DE1620548C

DE1620548C - Verfahren zur Herstellung von Inosin , Adenosm , Cytidin und/oder Undin 5 phosphat

Info

Publication number: DE1620548C
Authority: DE
Inventors: Mikio Takatsuki Marumoto Ryuji Minoo Honjo, (Japan) C07d
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Publication date: 1971-05-13

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Inosin-, Adenosin-, Cytidin- und/oder Uridin-5'-phosphat aus den entsprechenden Ribonucleosidcn.

RibonucIcosid-S'-phosphate sind sehr wertvoll als Würze für Speisen sowie in der pharmazeutischen Industrie. Sie werden hergestellt, indem zunächst die Hydroxylgruppen, die in 2'- und 3'-Stellung des Riboseanteils gebunden sind, mit einer Acyl- oder Isopropylidengruppe geschützt werden und dann die 5'-I lydroxylgruppe der so geschützten Verbindung mit fünfwertigen Phosphorverbindungen, wie Phosphorpentachlorid oder Phosphoroxychlorid, phosphoryliert wird und anschließend die schützenden Gruppen entfernt werden. Zu diesen bekannten Verfahren gehört die in der französischen Patentschrift L 369 079 beschriebene Phosphorylierung von Nucleosidcn in Gegenwart von Ketonen, bei derzunächstdie Hydroxylgruppen in 2'- und 3'-Stellimg maskiert und danach die Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe unter Verwendung von POCl_a durchgeführt wird. Das bekannte Verfahren erfordert jedoch eine lange Zeit (etwa 7 bis 30 Stunden) bis zum vollständigen Schutz und für die Phosphorylierung und ist daher für die technische Herstellung unvorteilhaft.

Hs wurde nun gefunden, daß eine selektive Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe des Ribonucleosids leicht in kurzer Zeit erzielt werden kann, wenn man an Stelle der bekanntermaßen verwendeten fünfwertigen Phosphorverbindungen Phosphortrichlorid als Phosphorylierungsmittel verwendet und die Phosphorylierung in Gegenwart von Sauerstoff vornimmt.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Inosin-, Adenosin-, Cytidin- und/oder Uridin-5'-phosphat durch Umsetzen der entsprechenden Ribonucleosidc mit 10 bis 100 Mol eines Phosphorylierungsmittels, bezogen auf das Ribonucleosid, in Gegenwart von Wasser und aliphatischen Ketonen mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und anschließende Hydrolyse des Rcaklionsproduktes zum gewünschten S'-Ribonuclcotid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Phosphorylierungsmittel Phosphortrichlorid einsetzt und dabei in Gegenwart von Sauerstoff arbeitet.

Hei diesem Verfahren werden die entsprechenden Ribonucleosid-S'-phosphate in kurzer Zeit und in guter Ausbeute erhalten.

Als aliphatische Ketone mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen eignen sich für die Zwecke der Erfindung beispielsweise Aceton, Methyläthylketon, Mcthylisohulylkcton und Methylisopropylketon.

Die Reaktion wird im allgemeinen durchgeführt, indem man zuerst das Ribonucleosid im Keton löst oder suspendiert und dann Phosphortrichlorid und Wasser zur Lösung oder Suspension gibt, wobei man das Reaktionssystem in Berührung mit der Atmosphäre hält oder Sauerstoff oder ein sauerstoffhaltiges Gas, /.. IJ. Luft, in das Reaktionssystem bläst.

Da das Keton als Lösungsmittel wirkt, ist für die Reaktion ein weiteres Lösungsmittel nicht unbedingt erforderlich. Das Keton kann in einer solchen Menge verwendet werden, daü das Ribonucleosid ausreichend gelöst oder suspendiert wird. Vorzugsweise wird das Keton im großen Oberschuß verwendet.

Das Molverhältnis von Phosphortrichlorid und Wasser zum Nucleosid ist verschieden, je nach dem Ausgangsmaterial. Hs liegt vorzugsweise im Bereich von 40 bis 60 MoI Phosphortrichlorid und 2 bis 20 Mol, vorzugsweise 2 bis 4 Mol, Wasser pro Mol Ribonucleosid.

Die gesamte erforderliche Menge an Phosphors' trichlorid kann dem Reaktionssystem auf einmal zugesetzt werden, jedoch ist es zur Erzielung der besten Ausbeute zweckmäßig, das Phosphortrichlorid in zwei Portionen dem Reaktionssystem zuzugeben. Dies kann so geschehen, daß man zuerst etwa 1 bis

ίο 10 Mol (zweckmäßig 1 bis 2 Mol) Phosphortrichlorid pro Mol Ribonucleosid zusammen mit etwa 2 bis 20 Mol (zweckmäßig 2 bis 4 Mol) Wasser pro Mol Ribonucleosid zum Reaktionssystem gibt, die Reaktion stattfinden läßt, bis das Reaktionsgemisch klar wird, und dann etwa 10 bis 90 Mol (zweckmäßig 40 bis 60 Mol) Phosphortrichlorid pro Mol Ribonucleosid zur weiteren Fortsetzung der Reaktion zum Reaktionsgemisch gibt. In diesem Fall ist für die erste Reaktionsstufe nicht unbedingt Sauerstoff erforderlich, aber die zweite Reaktionsstufe muß so durchgeführt werden, daß das Reaktionssystem der Atmosphäre ausgesetzt ist oder Sauerstoff oder Luft eingeblasen wird. ■

Bei der ersten Stufe des Verfahrens gemäß der Erfindung werden die Hydroxylgruppen in der 2'- und 3'-Stellung des Riboseanteils durch das aliphatische Keton in Gegenwart von Phosphortrichlorid und Wasser geschützt, und die freie 5'-Hydroxylgruppe wird durch Phosphortrichlorid und Sauerstoff in Gegenwart des aliphatischen Ketons phosphoryliert. Auf diese Weise wird das entsprechende geschützte Ribonucleosid-S'-dichlorphosphat erhalten.

Die Reaktion wird vorteilhaft so durchgeführt, daß die Temperatur durch Kühlung bei etwa 0 bis K)⁰C gehalten wird.

In der zweiten Stufe des Verfahrens gemäß der Erfindung wird die geschützte Verbindung in bekannter Weise zu Ribonucleosid-5'-phosphat hydrolysiert. Dies kann beispielsweise geschehen, indem man das erhaltene Produkt in Eiswasser gibt, den pH-Wert mit einer Alkaliverbindung (z. B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd und Natriumcarbonat) auf 1,0 bis 2,0 einstellt und das Gemisch auf etwa 40 bis 100" C, vorzugsweise auf 50 bis 8O⁰C, erhitzt.

Das als Endprodukt gcbildeteRibonucleosid-S'-phosphal kann vom Reaktionsgemisch nach beliebigen, bekannten Methoden abgetrennt werden, z. B. unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen oder Aktivkohle oder durch Kristallisation in Form eines Salzes,

Z. B. des Natriumsalzes. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit die Herstellung des betreffenden RibonucIeosid-5'-phosphats in kurzer Zeit und in guter Ausbeute.
Um die erfindungsgemäß erforderliche kurze Reaktionsdauer zu veranschaulichen, wird der folgende Versuch beschrieben.

Zu einer Suspension von 2 g Inosin in 50 ml Aceton wurden 3 ml Phosphortrichlorid und dann I ml Wasser gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 20"C gerührt. Dann wurden weitere 50 ml Phosphortrichlorid dem Reaktionsgemisch bei 0 bis 5°C zugesetzt. In geeigneten Zeitabständen wurde jeweils 0,1 ml der Reaktionslösung entnommen, um die Bildung von Inosin-5'-monophosphat (nachstehend als 5'- IMP bezeichnet) zu überwachen. Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle genannt. Es zeigt, daß innerhalb von 60 Minuten nach Beginn der Reaktion 94 ^ü/„ 5'-IMP gebildet wurden.

	3	von 5'-IMP, '/.
Zeit, Minuten	Bildung	0
0		60
35		70
40		82
50		93
60 ■		93
80

B e i s ρ i e 1 L

Zu einer Suspension von 2 g Inosin in 50 ml Aceton wurden unter Rühren 3 ml Phosphortrichlorid und dann 1 ml Wasser gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 10°C gerührt. Zum Reaktionsgemisch wurden weitere 40 ml Phosphortrichlorid gegeben, wobei die Temperatur 2 Stunden bei 0 bis 5⁰C gehalten wurde und die weitere Reaktion bei offenem Reaktionsgefäß stattfand. Das Reaktionsgemisch wurde in 11 Eiswasser gegossen und die erhaltene Lösung mit einer 20°/₀igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf pH 1,5 eingestellt. Diese Lösung wurde zur Abspaltung der Isopropylidengruppen 30 Minuten bei 70° C gehalten. Die so behandelte Lösung wurde an einer Aktivkohlesäule adsorbiert. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer O,5°/oig^en wäßrigen Natriumhydrox'ydlösung eluiert. Das Eluat wurde auf pH-Wert 8 eingestellt und eingeengt. Die Analyse des Konzentrats durch Papierelektrophorese (0,05 Mol Boratpufier) ergab, daß das Inosin-5'-monophosphat in einer Ausbeute von 88°/o gebildet worden war. Durch Zugabe von Methanol zum Konzentrat wurden 3,3 g des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat (8H₂O) erhalten. Ausbeute 8t °/₀.

Beispiel 2

Ein Gemisch von 2 g Adenosin in 50 ml Aceton, 4 ml Phosphortrichlorid und 2 ml Wasser wurden auf die im Beispiel 1 angegebene Weise umgesetzt, worauf weitere 45 ml Phosphortrichlorid zum Reaktionsgemisch gegeben wurden. Durch Aufarbeitung des hierbei erhaltenen Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 2,3 g des Dinatriumsalzes von 5'-Adenylsäure erhalten. Die Ausbeute betrug 77%.

B e i s ρ i e 1 3

Ein Gemisch von 2 g Cytidin als Lösung in 100 ml Aceton, 3 ml Phosphortrichlorid und 1 ml Wasser wurden auf die im Beispiel 1 angegebene Weise umgesetzt, worauf weitere 50 ml Phosphortrichlorid zum Reaktiönsgemisch gegeben wurden. Durch Aufarbeitung des hierbei erhaltenen Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 2,8 g des Dinatriumsalzes von 5'-Cytidylsäure erhalten. Die Ausbeute betrug 75 %.

Beispiel 4

Zu einer Suspension von 2 g Inosin in 50 ml Aceton wurden 3 ml Phosphortrichlorid und dann 1 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 10°C gerührt und dann mit 50 ml Phosphortrichlorid bei 0 bis 5°C versetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten der Reaktion überlassen. Die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die im Beispiel I angegebene Weise ergab 3,2 g Dinatriiimsalz von 5'-Inosinsäure. Die Ausbeute betrug 80%.

Beispiel 5

2 g fnosin, 70 ml Aceton, 40 ml Phosphortrichlorid und 1 ml Wasser wurden gleichzeitig gemischt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0 bis 5⁰C der Reaktion überlassen. Durch Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die im Beispiel I angegebene Weise ίο wurden 3 g des Dinatriumsalzes von Inosinsäure erhalten. Die Ausbeute betrug 75%.

Beispiel 6

Ein Gemisch von 2 g Uridin, 50 ml Aceton, 3 ml Phosphortrichlorid und I ml Wasser wurde auf die im Beispiel I angegebene Weise behandelt. Anschließend wurden 50 ml Phosphortrichlorid zum Reaktionsgemisch gegeben. Durch Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 2,9 g des Dinatriumsalzes von 5'-Uridinsäure erhalten. Die Ausbeute betrug 80%·

Beispiel 7

Zu einer Suspension von 2 g Inosin in 50 ml Methyläthylketon wurden 3 ml Phosphortrichlorid und dann 1 ml Wasser gegeben. Das Reaktiönsgemisch wurde 30 Minuten bei 10⁰C gerührt. Nach Zugabe von 50 ml Phosphortrichlorid zum Reaktionsgemisch wurde dieses 30 Minuten in einem offenen Gefäß gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in 1 1 Eiswasser gegossen und die erhaltene Lösung mit einer 20%igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf pH-Wert 1,5 eingestellt. Diese Lösung wurde 30 Minuten auf 70°C erhitzt, um die Isopropylidengruppen zu entfernen. Sie wurde dann an einer Aktivkohlesäule adsorbiert. Diese Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer 0,5%igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung eluiert. Das Eluat wurde auf pH-Wert 8 eingestellt und eingeengt. Die Analyse der geringen Konzentratmenge durch Papierelektrophorese (0,05 Mol BoratpuiTer) ergab, daß Inosin-5'-monophosphat in einer Ausbeute von 81% gebildet worden war. Durch Zugabe von Methanol zum Konzentrat wurden 3,0 g des Dinatriumsalzes von lnosin-5'-monophosphat (8H₂O) erhalten. Die Ausbeute betrug 74%.

Beispiel 8

Ein Gemisch von 2 g Inosin, 4 ml Phosphortrichlorid, 20 ml Methylisobutylketon und 2 ml Wasser wurde auf die im Beispiel 7 angegebene Weise behandelt. Nach Zugabe von 40 ml Phosphortrichlorid zum Reaktionsgemisch wurde dieses auf die im Beispiel 7 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 2,9 g des Dinatriumsalzes von 5'-Inosinsäureerhaltenwurden. Die Ausbeute betrug 71 %·

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Inosin-, Adenosin-, Cytidin- und/oder Uridin-5'-phosphat durch Umsetzung der entsprechenden Ribonucleoside mit 10 bis 100 Mol eines Phosphoryiierungsmittels, bezogen auf das Ribonucleosid, in Gegenwart von Wasser und aliphatischen Ketonen mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und anschließende Hydrolyse des Reaktionsproduktes zum gewünschten 5'-RibonucIeotid, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phosphorylierungsmittcl

Pliosphortrichlorid einsetzt und dabei in Gegenwart von Sauerstoff arbeitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Gegenwart von 2 bis 20 Mol Wasser, bezogen auf das Ribonucleosid, durchgeführt wird.