DE2059429A1

DE2059429A1 - Verfahren zur Herstellung von Nucleosiddiphosphatestern

Info

Publication number: DE2059429A1
Application number: DE19702059429
Authority: DE
Inventors: Erich Haid; Michael D Nelboeck-Hochstetter; Prof Dr Rer Nat Bergmey Ulrich; Guenter Dr Rer Nat Weimann
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1970-12-02
Filing date: 1970-12-02
Publication date: 1972-06-22
Also published as: ES395861A1; FR2117325A5; US3787392A; GB1305539A; JPS5335953B1; NL171064B; NL7114920A; IL37977A0; DE2059429C2; SU407449A3; HU163083B; IL37977A; NL171064C

Description

Patentanwälte Dipl. -Ing. R Weickmann, 2059429

Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke „.„-_r Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 27, DEN

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 39 21/22

BOEHRINGER MANUHEIM GMBH., Mannheim

'Verfahren zur Herstellung von Nucleosiddiphosphatestern

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Nucleosiddiphosphatestern durch Umsetzung eines Nucleosidphospliats mit Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart eines Phosphorsäureesters.

Es ist bereits bekannt, Nucleosiddiphosphatester durch Umsetzung des Nucleosidphosphats mit Dicyelohexylcarbodiimid in Gegenv/art * eines Phosphorsäureesters in Pyridin oder formamid als Lösungsmittel herzustellen. Dieses Verfahren besitzt den Nachteil, daß es eine Reaktionsdauer von 7 5?agen erfordert, zahlreiche Nebenprodukte liefert und nur unbefriedigende Ausbeuten bis etwa 45$ ergibt. Nach einem anderen Vorschlag wird vom Nucleosid-5^f-phosphoraraid als Dicyclohexylguanidiniumsalz ausgegangen und letzteres durch 16-stün'digen Erhitzen in o-Chlorphenol bei 100⁰O mit einem Phosphorsäureester kondensiert. Bei diesem Verfahren wird zwar die Reaktionsdauer abgekürzt, die Ausbeuten sind jedoch ebenso unbefriedigend wie bei dein zuvor erwähnten Verfahren.

209826/1086

2059A29

Neben diesem chemischen Verfahren wurde auch bereits die enzymatische Herstellung verschiedener Nucleosiddiphosphatester durch Umsetzung der entsprechenden Siucleosidtriphosphate mit Phosphorsäureestern in Gegenwart entsprechender Enzyme beschrieben. Dieses Verfahren ist für eine technische Herstellung der gewünschten Produkte ungeeignet.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur chemischen Herstellung von Nucleosiddiphosphatestern, welches die oben erwähnten Nachteile nicht aufweist und mit guten Ausbeuten ohne Bildung wesentlicher Mengen an störenden Nebenprodukten innerhalb kurzer Zeit zu den gewünschten Verbindungen führt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Nucleosiddiphosphatesters durch Umsetzung eines Nucleosidmonophosphats mit einem Phosphorsäureester in Gegenv/art von Dicyclohexylcarbodiimid besteht darin, daß man eine inethanolische Lösung einer Nucleosidmonophosphorsäure, welche Dicyclohexylcarbodiimid und gegebenenfalls einen Lösungsveraittler enthält, langsam mit einer methanolischen Lösung eines Phosphorsäureesters, die einen pH-^wert zwischen 1 und 6,5, vorzugsweise 4 bis 5» aufweist, zusammenbringt. Die Umsetzung erfolgt vorzugsweise bei Raumtemperatur oder geringfügig erhöhter Temperatur und führt innerhalb einiger Stunden zu Ausbeuten bis zu 90$ und darüber.

Besonders überraschend ist, daß unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens die Nucleosid-5-phosphatester mit dem Lösungsmittel nicht oder nur in sehr geringen Mengen gebildet werden, da J. Mo ff at und H. G. Khorana in J. Am.Chem.Soc. 8J5, 649 (1961) unter ähnlichen Bedingungen die praktisch quantitative Bildung des entsprechenden Methyiesters beschrieben haben. Überraschend ist weiter, daß nicht nur kaum Esterbildung mit dem Lösungsmittel auftritt, sonde2*n auch kaum Dinucleosidpyrophosphate gebildet werden.

209826/1086

Die ITucleosidmonophosphorsäure kann τοη einem natürlich, vorkommenden oder synthetischen liucleosid abgeleitet sein. Beispiele für geeignete natürliche Nucleoside sind Cytidin, Uridin, Thymidin, 5-Methylcytidin, 5-Hydroxymethylcytidin, Pseudouridin, Adenosin, Guanosin, Inosin sowie die entsprechenden 2'-Des oxy Verbindungen. Die verwendbaren synthetischen nucleoside stellen zumeist Derivate der oben erwähnten natürlichen "Nucleoside dar.

Als zv/eite Komponente wird beim erfindungsgemäßen Verfahren ein Phosphorsäureester verwendet. Die Phosphorsäure kann hierbei mit irgendeiner geeigneten hydroxylgruppenhaltigen organischen Verbindung verestert sein, vorausgesetzt, daß dieser Phosphorsäureester,im erfindungsgemäß angewandten Lösungsmittel ausreichend löslich ist. Beispiele für geeignete hydroxylgruppenhaltige organische Verbindungen, die in Form ihrer Phosphorsäureester eingesetzt werden können, sind ein- und mehrwertige Alkohole und Aminoalkohole, wie z.B. Äthanolamin, Cholin, Zucker wie z.B. Glucose, Mannose, Galactose, Ribose, Glycerinaldehyd sowie die zugehörigen Ketosen und Aminozucker. Bevorzugte Phosphorsäureester für das Verfahren der Erfindung sind Cholinphosphat, Äthanolaminphosphorsäure, Glucose-1-phosphat, Glucose-6-pliosphat, Galactose-1-phosphat und Mannose-1-phosphat, Glueοsamin-1-phosphat, Galactosamin-1-phosphat usw., Mannosamin-1-phosphat und entsprechende N-Acetylverbindungen.

Als Lösungsmittel wird Methanol verwendet. Das Methanol kann teil weise durch Alkanole mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder niedrige Dialkylketone mit bis zu 3 C-Atomen je Alkylkette oder Dimethylformamid ersetzt werden. Die Ausbeute wird dadurch jedoch im allgemeinen verschlechtert.

Besonders gute Ergebnisse werden in Gegenwart eines Lösungsvermittlers erhalten. Geeignete Lösungsvermittler sind z.B. Piperidin, Cyclohexyliimin und Anilin sowie vorzugsweise Morpholin,

Αΐΰ Säure für die Einstellung dea pH-Wertes in den erforderlichen Bereich iswiachan 1 und 6,5 eignen oich grundsätzlich so-

209826/1086

wohl anorganische als auch organische Säuren, die in dem angewandtenLösungsmittel löslich sind. Bevorzugt werden die Halogenwasserstoffsäuren, insbesondere Chlorwasserstoffsäure. Infolge der Wassertoleranz des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Säuren, insbesondere auch die Halogenwasserstoffsäure, in wasserhaltiger Form eingesetzt werden, beispielsweise als konzentrierte Salzsäure. Geeignete Säuren sind solche, die nicht zur Ausfällung eines Reaktionspartners führen oder irreversibel mit dieοem reagieren (z.B. Schwefelsäure, Salpetersäure).

Die Phosphorsäureester können in Form ihrer Salze verwendet werden, insbesondere der käuflichen Alkali- und Erdalkalisalze. Als besonders geeignet haben sich die Calciumsalze erwiesen. Es wird angenommen, daß die Galciumionen hierbei lösungsvermittelnde Eigenschaften entwickeln. Aber auch Natrium-, Kalium-, Lithium-, Strontium-, Magnesium- und Bariumsalze und Salze von organischen Aminen erwiesen sich als geeignet. Die Calciumsalze können auch als Mischsalze verwendet werden, beispielsweise als Mischsalze mit Halogenwasserstoffsäuren wie z.B. Gholinphosphatcalciumchlorid. Hierin ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens zu sehen, da viele der einzusetzenden Reagentien in Form ihrer Calciumsalze teilweise als Calciumchloridsalze im Handel erhältlich sind und in dieser Form, ohne vorherige Trocknung, direkt eingesetzt werden können.

Wie bereits angegeben, ist es wesentlich, daß die Lösung des Phosphorsäureesters einen sauren pH-Wert aufweist. Die besten Ergebnisse werden bei pH-Werten zwischen 4 und 5 erzielt. Je nach den verwendeten Ausgangsmaterialien können aber auch niedrigere pH-Werte vorteilhaft sein. Unterhalb von pH 4 steigt jedoch die Tendenz zur Bildung des Methylesters.

Die Heaktionstemperatur ist an sich unkritisch, und die Umsetzung kann bei Temperaturen zwischen 0 und etwa 80° durchgeführt wer.lon. Bevorzugt werden Temperaturen zwischen 20 und 60⁰C.

209826/1086

Wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die langsame Zugabe.der sauren Phosphorsäureesterlösung zu der Lösung von Nucleosidphosphorsäure und Dieyclohexylcarbodiimid in Methanol. Vorzugsweise erfolgt diese Zugabe durch Eintropfen der Phosphorsäureesterlösung in eine gut gerührte Nucleosidphosphorsäurelösung.

Die Reinigung und Aufarbeitung der erhaltenen Produkte ist einfach, da sie bereits verhältnismäßig rein anfallen und im allgemeinen nur Spuren von Verunreinigungen enthalten. In vielen Fällen kristallisiert das Produkt im Lauf der Reaktion bereits di- ( rekt aus, z.B. in Form des Calciumsalzes. Die Fällung kann durch Zugabe eines die^ Löslichkeit des Produktes vermindernden \veiteren Lösungsmittels, z.B. von Isopropanol, unterstützt werden.

Ein besonderer Vorzug des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in seiner Einfachheit. Es läßt sich als Eintopfverfahren in relativ kurzer Zeit mit denkbar einfachen Apparaturen durchführen, Die Produkte lassen sich sehr leicht gewinnen und reinigen. Es werden nur einfache und billige Lösungsmittel verwendet,und infolge einer gewissen V/assertoleranz brauchen diese Lösungsmittel nicht besonders getrocknet zu werden. Damit entfällt auch der sonst übliche große Zeitaufwand zur Entfernung von Wasser aus | dem Reaktionsmilieu mittels azeotroper Destillation, Behandlung mit Molekularsieben usw. Auf den Vorteil, daß die Ausgangsprodukte zumeist in Form der handelsüblichen Salze eingesetzt werden können, wurde bereits hingewiesen.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Produkte sind physiologisch interessant und finden daher sowohl als Arzneimittel wie auch in der Forschung Verwendung. Zahlreiche der erhältlichen Verbindungen spielen eine große Rolle im physiologischen Zellgeschehen, beispielsweise bei der Biosynthese von Phosphatiden, von Zellwandstrukturen und dergl. So erfolgt die Biosynthese von Phosphatiden von Basen wie Lecithin, Kephalin und Sphingomyelin durch Aktivierung der Base, bei den übrigen

209826/1086

Verbindungen mit weniger basischen Resten wie Serin, Inosit, Cardiolipin durch Aktivierung des Diglycerids. Die Aktivierung besteht dabei in allen Fällen in der Bildung der entsprechenden Cytidindiphosphatverbindung, welche den aktivierten Rest dann weiter übertragen kann. Bei einer Reihe von Krankheiten mit Phosphatidbeteiligung treten die Phospholipide vermindert auf, z.B. bei den "Glykolipid-Deseases", Sphingomyelinase (Morbus Niemann-Bieck) u.a. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliches Cytidindiphosphatcholin wurde beispielsweise erfolgreich bei Hirnverletzungen als Lecithinvorläufer verabreicht und führte zu bemerkenswerten Verbesserungen der klinischen Symptome. Die ilberlebensrate bei Gehirnsohädigungen konnte durch Behandlung mit dieser Substanz erheblich gesteigert v/erden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1 Uridindiphosphatgluoose

10 g Uridin~5^s-monophosphat (U-5^!-MP) als freie Säure (ca. 30 mM) werden in 500 ml reinem Methanol unter Zugabe von 7,5 ml Morpholin in Lösung gebracht und nach Zusatz von 10 g Dicyclohexylcarbodlimid auf 50° G erwärmt. Zu dieser Lösung werden 90 inMol Glucose-1-phosphat, Morpholinsalz, in 500 ml Methanol gelöst und mit konz. Salzsäure auf pH = 4 eingestellt, langsam zugetropft. Nach 12- Mb 15-stündiger Reaktionszeit bei 50° C werden unter gutem Rühren 500 ml Isopropanol angeben, der ausgefallene Niederschlag absentrifugiert» in 250 ml Wasser gelöst» neutralisiert und auf eine IMAC-A-17-Säule (500 ml Inhalt„ Pormiatform) gegeben und mit einem linearen Gradienten von 0 - 0*5 N ianiponiumformiat, pH - 4, elulert. 'Die Fraktionen mit UDP-glucose, die bei etwa 0,4 N Ammoniumfonaiat von der Säule kommen» werden über eine 2-1-Kohle-Bäule sofort entsalzt. Die Blution τοπ eier Kohle erfolgt mit Ibopropanol : HpO : Ätznatron = 50 : 50 : 0,5. Die Eluate werden

209826/1086

_ 7 —

mit Natronlauge auf pH 7»2 gebracht, die Lösung im Vakuum konzentriert und das Natriumsalz von UDP-glucose mit dem lofachen Volumen Methanol gefällt.

Ausbeute: 8,5 bis 9 g (ca. 50 $ der Theorie bezogen auf eingesetztes U-5'-MP).

Analog wird mit Galactose-1-phosphat, Morpholinsalz, das entsprechende UDP-galactose erhalten.

Beispiel 2 Adenosindiphosphat

15 g Galactose-1-phosphat, Morpholinsalz, werden in 500 ml Methanol gelöst und durch Zusatz von konz. Salzsäure wird der pH-Wert der Lösung auf 4 eingestellt. Diese Lösung wird langsam zu 200 ml einer 50°-C-warmen Methanollösung getropft, die 5 g Adenosin-5'-monophosphat (A-5'-MP),'freie Säure, 3,5 ml Morpholin und 5 g Dicyclohexylcarbodiimid enthält. Nach einer Reaktionszeit von 15 Std. bei 50° C und bei einem pH-Wert von 4-4,5 werden unter gutem Rühren 250 ml Iospropanol zugesetzt. Der ausgefallene Niederschlag wird abzentrifugiert, in 200 ml destilliertem Wassser gelöst, der pH-wert auf 7 eingestellt und anschließend auf einer Anionenaustauschersäule (500 ml Inhalt; Typ Dowex 1X2, Formiat- " form) aufgezogen. Das Produkt wird mit 0,7 N Natriumformiat eluiert und wie in Beispiel 1 über Kohle weiter aufgearbeitet. Die Ausbeute an ADP-galactose, Natriumsalz, beträgt 4,5 g (ca. 50 $> der Theorie, bezogen auf eingesetztes A-5'-MP).

Beispiel 5 Cytidindiphosphat-Äthanolamin

14»5 g Äthanolaminphosporsäure, ca. 100 mMol, und 15g Calciumchlorid (CaGl₂ * 2HgO) werden in ca. 55 ral destilliertem Wasser

209826/1086

gelöst, mit ca. 5 ml konzentrierter Salzsäure angesäuert und mit Methanol auf 500 ml aufgefüllt. Diese Lösung wird langsam in eine 50°-warme Methanollösung (250 ml) eingetropft, die 11g Cytidin-5'-monophosphat (C-5^f-MP), freie Säure, 8 ml Morpholin und 11g Dicyclohexylcarbodiimid enthält. Nach ca. 15 Std. Reaktionszeit bei 50° werden 300 ml Isopropanol zugegeben, der Niederschlag abfiltriert, in Wasser gelöst, neutralisiert und auf eine Anionenaustauscher-Säule (Typ Dowex 1X2, Formiatform, 50 - 100 mesh, 1000 ml Inhalt), chromatographiert. Nach einem Vorwasch wird mit 0,02 M Ameisensäure das CDP-Äthanolamin eluiert. Die CDP-Äthanolamin-haltigen Fraktionen werden konzentriert, mit Natronlauge neutralisiert und schließlich durch Zusatz von Äthanol kristallisiert. Das Kristallisat wird abgesaugt, mit Äthanol gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: ca. 12 g (70 % der Theorie bezogen auf eingesetztes

0-5'-MP).

Beispiel 4

2 g Cytidinphosphorsäure werden in 100 ml reinem Methanol unter Zugabe von 1,5 ml Morpholin in Lösung gebracht und nach Zugabe von 2 g Dicyclohexylcarbodiimid auf ca. 5O⁰C erwärmt.

Obiger Reaktionslösung wird langsam eine Lösung von 5 g phosphat-calciurnchlorid in 175 1 Methanol, die 2,0 ml Salzsäure enthält, zugetropft. Nach einer Reaktionszeit von 12 bis 15 Stunden bei 50⁰C werden unter gutem Rühren 2 50 ml Isopropanol zugesetzt. Der ausgefallene Niederschlag wird abzentrifugiert, in 200 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine Chromatographiesäule mit 250 ml Anionenaustauscher Dowex 1x2 in Formiatform gezogen. Die Säule wird mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen und mit 0,05 N Ameisensäure eluiert. Die Cy tidindiphosphatcholin-haltigen Frairt ionen werden bis zur Trockne

209826/1086

konzentriert, in wenig Wasser gelöst, mit Natronlauge neutrali· siert und durch Zusatz von Äthanol kristallisiert.

Ausbeute: 5»2 g Cytidindiphosphatcholin -.Ha · 4H₂O (90 $ der Theorie).

209826/1086

Claims

Patentansprüche

1/ Verfahren zur Herstellung von Nucleosiddiphosphatestern durch Umsetzung eines Nucleosidmonophosphats mit einem Phosphorsäureester in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid, dadurch gekennzeichnet, daß eine methanolische Lösung von Nucleosidmonophosphorsäure und Dicyclohexylcar'bodiimid, die gegebenenfalls einen Lösungsvermittler enthält, langsam mit einer methanolischen Lösung eines Phosphorsäureesters, die einen pH-Wert zwischen 1 und 6,5 aufweist, zusammengebracht Wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Temperatur zwischen 0 und 80 C gearbeitet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsvermittler Morpholin verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert mit einer HgO-haltigen konzentrierten Halogenwasserstoffsäure eingestellt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Phosphorsäureester in Form eines Alkali- oder Erdalkalisalzes eingesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Calciumsalz verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Cholinphosphat verwendet wird.

209826/1086