DE1617680A1

DE1617680A1 - Verfahren zur Gewinnung von hochgereinigtem Phosphatidylcholin

Info

Publication number: DE1617680A1
Application number: DE19671617680
Authority: DE
Inventors: Hans Dr Betzing
Original assignee: A Natterman und Cie GmbH
Current assignee: A Natterman und Cie GmbH
Priority date: 1967-08-21
Filing date: 1967-08-21
Publication date: 1971-07-22
Also published as: NL159868C; US3544605A; DE1617679A1; NL6811738A; DE1617680C3; CH518317A; NL159868B; FR1588863A; DE1617680B2; SE355495B; DK128397B; GB1182554A; BE719354A; AT281290B

Description

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1A~33 578

B e s c h r e i b u ng
zu der Patentanmeldung

A. NATTERMANN & CIE, GMBH. 5 Köln-Braunefeld 1

betreffend

Verfahren zur Gewinnung von hochgereinigtem Phosphatidylcholin

(Zusatz 2Ui Patent .,,....,.,,„.«. (Patentanmeldung: /. .//..·.. * .) (Unser Zeichen: lA-33 599)

Nach dem Verfahren des Patents .......,<,...... (Patentanmeldung /.... T~A /Λ⁴.«.,.) erfolgt die Gewinnung von hochgereinigtera Phosphatidylcholin mit hohem Gehalt an essentiellen Fettsäuren aus pflanzlichen "Lecithinen" durch Lösen der ölhaltigen Rohphosphatide in Essigester oder einem dichlorierten Kohlenv/asserf.toff mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bzw, einer Mischung dieser i.opun^eaaittel und Behandlung der Lösung mit mindestens der fünffachen Menge Aluminiumoxyd, bezogen auf den Gehalt von Rohphocphatid, unter Rühren und anschliessendem Eluieren des hcchgereinigten Phosphatidylcholins vom Adsorbens mit Alkohol,

ITach 'iieoeiu Verfahren wird ein produkt erhalten, dessen r-hosphatid/lcIiOlin-Aüteil 9o % und mehr beträgt und das unter anderen iuodiiiinisch-therapeuti^ch für orale Zwecke gut geeignet ist. .

Es wurde rtun gefunden, dass sich durch eine Abwandlung dieses Verfahrens der Phosphatidylcholin-Anteil des Produktes auf loo % steigern lässt, so dass man chemisch reines Phosphatidylcbollir erhält, das sich daher für Injektionen, insbesondere auch intravenöse Injektionen, eignet»

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Die erfindungsgemässe Abwandlung des Verfahrens des Hauptpatents ist dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung der Ölhaltigen Rohphosphatide in dem Essigester oder in dem.dichlorierten Kohlenwasserstoff mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bzw. in einem Gemisch dieser Lösungsmittel auf eine AluminiuBioxyd-£;äule gegeben wird, worauf dann das Phosphatidylcholin mit Alkohol vom Adsorbens eluiert wird. Vorzugsweise wäscht man nach den. Aufgeben der Rohphosphatidlösung auf die Säule noch mit einem der verwendeten Lösungsmittel odex* deren Gemisch nach.

Man geht dabei zweckmässigerweise so vor, dass wan das ölhaltige Rohphosphatid ohne jede Vorbehandlung vorzugsweise unter leichtem Erwärmen auf eine im. allgemeinen 37 C nicht übersteigende Temperatur und unter dem Schutz einer inerten Gases sowie unter Zugabe eines Antioxydans, z.B. Tocopherol, in kleinen Mengen, z.B. o,l bis o,2 %, im Essigester und/oder dem dichlorierten Kohlenwasserstoff löst und möglichst unter Lichtausschluss sofort auf die Aluminiumoxydsäule gibt. Erfolgt die Auflösung des Rohphosphatids statt im Essigester in einem der dichlorhaltigen Lösungsmittel, so kann wan auf das leichte Erwärmen verzichten und bei Zimmertemperatur lösen.

Das Herauslösen der Neutrallipide beim Nachwaschen mit dem Lösungsmittel lässt sich durch Zusatz von bis zu 6 Vol. % Alkohol zur Lösung vor Aufgeben auf die Säule beschleunigen. Das nachfolgende taschen InI^-J; Essigester oder einen der vorher genannten chlorhaltigen Lösungsmittel, denen man vorzugsweise auch bis zu 6 Vol. % Alkohol zufügt, holt überraschenderweise nur die Neutrallipide quantitativ von der Säule herunter.

Beim abschliessenden Eluieren der Säule mit Alkohol, wozu Äthanol besonders geeignet ist, erhält man chemisch reines, natürliches Phosphatidylcholin mit hohem Gehalt an essentiellen Fettsäuren. Alle anderen Begleitphosphatide sowie die Phytoglykolipide verbleiben hierbei auf der Säule.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren gewonnene, chemisch reine Phosphatidylcholin bleibt beim Eindampfen der alkoholischen Lösung im Vakuum in Gegenwart eines inerten Gases als

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fast farblose Masse von pastenartiger Konsistenz zurück. Die Ausbeute betrügt bis zu GS %« Dieses Fhosphatidylcholin ist in Alkohol, Essigester, Äther _r Petroläther und vielen chlorhaltigen Lösungsmitteln gut löslich, löst sich jedoch schwer in Aceton. Eine typische Analyse- zeigt folgende Vierte:

Gesagtphosphor	Jodzahl =	3,8o %
Cholin	Ii,9o %
Fettsäuren	69 %
F: Cholin-Molverhältnis	1
Fettsäuren: Cholin-
Molverhältnis	2
loo - Iod

gaschroiaatographische Analyse der Fettsäuren ergibt folgende typischen "erte:

Ialmitiasäure 12,5%

Stearinsäure 2,5 %

ölsäure 7,8 %

■%

Linolsäure 71,5

Linolensäure 5,7

loo,ο

Von den angeführten Lösungsmitteln zur Eluierung der Neutrallipide ist der· Essigsäureäthylester das gebräuchlichste; allerdings muss man-hierbei, wie bereits gesagt, zur vollständigen Auflösung des handelsüblichen Rohphosphatids auf

ο *

etwa 37 C erwärmen und die so erhaltene Lösung noch in warmem

Zustand auf die Adsorptionssäule bringen. Bei diesem Vorgehen ist ein Beheizen des Säulenmantels nicht notwendig, die Rohphosphat idlösung zieht ohne Schwierigkeiten in das Adsorbens ein. Das Erwärmen kann aber unterbleiben, wenn man dem Essig— ester Io bis 15 % eines dichlorierten Kohlenwasserstoffs wit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen zusetzt; dann erhält man schon bei Zimmertemperatur eine klare Lösung des Rohphosphatids. Das Eluieren der Neutraliipide kann auch in diesem Falle mit E ssige ster erfolgen.

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Die Konzentration der auf die Adsorptionssäule aufzubringenden Rohphosphatidlösung kann zwischen 1 und 2o % liegen. Lösungen mit noch höheren Konzentrationen an Kohphosphatid sind auch noch brauchbar, neigen aber unter Umständen zu einem leichten Verstopfen der Gäule, Vorzugsweise geeignet sind Konzentrationen zwischen 3 und Io %.

Als Adsorbens können basische und neutrale Aluminiumoxyde, vorzugsweise aber basische Aluminiumpxyde der Aktivitätsstufe 1 bis 3 und nach Brockmann standardisierte Produkte verwendet werden.

Als Alkohol zur Eluierung des Phosphatidylcholins können solche einwertigen, aliphatischen verwendet werden, die 1 bis 3 C-Atome enthalten. Der vorzugsweise angewandte Äthylalkohol eignet sich im Gemisch mit r/asser bei eineiu Gehalt von Go bis 93 %_} wobei die letztere Konzentration als handelsübliche besonders vorteilhaft ist.

Durch das erfindungsgemässe Verfahren ist es nun möglich, die Phosphatide von den Neutrallipiden durch eine einfache Behandlung auf einer Aluminiumoxyd—Säule zu trennen und chemisch reines Phosphatidylcholin mit hohem Gehalt an essentiellen Fettsäuren zu gewinnen, das medizinisch wertvolle Eigenschaften besitzt. Dieses Verfahren erbringt bei höchstem Reinheitsgrad des Phosphatidylchölins noch eine besonders gute Ausbeute.

Das erfindungsgemässe Verfahren sei durch folgende Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

4o g handelsübliches Sojabohnenrohphosphatid werden in 8oo ml Essigester unter Erwärmen auf eine 37°C nicht übersteigende Temperatur tind unter dem Schutz eines inerten Gases gelöst und warm auf eine Adsorptionssäule von 4 cm Durchmesser und 5o cm Länge gegeben, die mit einer Aufschlämmung von 5oo g Aluminiumoxyd in Essigsäureäthylester gefüllt ist, wobei man darauf ächtet, dass keine wesentliche Abkühlung der Lösung eintritt. Nachdem die Lösung in das Adsorbens eingezogen ist, wird mit etwa 1,3 1 Essigester nachgewaschen. Die Essig-

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ester-Eluate enthalten das gesamte Neutrallipid, das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum als kräftig gelb gefärbtes Öl in einer Ausbeute von 11,ο g (= 28,ο %) zurückbleibt . Zur Eluierung des Lecithins lässt man etwa 1,7 1 Äthanol (96 %ig) durch die Säule laufen» Nach dem Abdestillieren des Alkohols im Vakuum in Gegenwart eines inerten Gases verbleiben 6,8 g chemisch völlig reines Phosphatidylcholin, das sind 75 % der im ursprünglichen Rohphosphatid vorhandenen Menge.

Beispiel 2

4o g handelsübliches Sojabohnenrohphosphatid anderer Provenienz werden in 4oo ml Essigsäureäthylester gelöst, der zur Verbesserung der Löslichkeit Io bis 15 % Dichloräthan (Dichlormethan oder Dichloräthylen) enthält. Erforderlichenfalls befreit man die Lösung durch Absitzenlassen, Filtrieren oder Zentrifugieren von den nichtlipidartigen Verunreinigungen, und gibt sie wie in Beispiel 1 angegeben auf eine Säule mit einer Aufschlämmung von 5oo g Aluminiumoxyd in Essigester. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben. Ausbeute an Neutrallipiden: 12,4 g =31,ο %. Ausbeute an chemisch reinem Phosphatidylcholin: 5,8 g = 72,5 %«

Beispiel 3

72 g handelsübliches Sojabohnenrohphosphatid werden in 36o ml Methylenchlorid oder einem Gemisch von Methylenchlorid-Äthanol 95 : 5 unter leichtem Rühren und Einleiten von Stickstoff gelöst, fall-s erforderlich von nichtlipidartigen Verunreinigungen befreit und auf eine Adsorptionssäule von 4 cm Durchmesser und 8o cm Länge gegeben, in der sich eine Aufschlämmung von looo g Aluminiumoxyd in Methylenchlorid oder Methylenchlorid-Äthanol 95 : 5 befindet. Wenn die Rohphosphatidlösung in das Adsorbens eingezogen ist, wird mit Methylenchlorid-Äthanol (95 : 5) eluiert, bis alle Neutrallipide aus der Säule herausgelöst sind. Dazu sind etwa 2 1 Lösungsmittelgemisch erforderlich. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels in einer Stickstoffatmosphäre verbleiben 23 g - 31,5 % eines kräftig gelb gefärbten Öles* Die Säule wird nun zur Gewinnung des Phosphatidylcholins mit etwa 3,5 1 Äthanol elulert und schliessliefo der Alkohol im Vakuum

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unter Nachziehen eines inerten Gases abdestilliert. Ausbeute an chemisch reinem Phosphatidylcholin: 11,ο g = 76 %.

Beispiel 4

37 g handelsübliches Sojabohnenrohphosphatid werden in 37o ml Dichloräthan, das 5 % Äthanol enthält, unter gelindem Erwärmen oder leichtem Rühren unter dein Schutz eines inerten Gases gelöst , falls erforderlich filtriert oder zentrifugiert und bei Zimmertemperatur auf eine Aufschlämmung von 5oo g basischem Aluminiumoxyd in Dichloräthan oder Dichloräthan mit 5 % Äthanolzusatz gegeben, die sich in einer Adsorptionssäule von 4 cm Durchmesser und 5o cm Länge befindet. Nachdem die Rohphosphatidlösung in das Adsorbens eingezogen ist, wird zur quantitativen Abtrennung der Neutrallipide mit ca. 1,5 1 Dichloräthan-Äthanol (95 : 5) eluiert. Das gesamte durch die Säule gelaufene Eluat wird vereinigt und im Vakuum unter Stickstoff eingedampft. Der Rückstand besteht ausschließelieh aus Neutrallipiden. Ausbeute: 11,S g *= 31,4 %. Zur nachfolgenden Eluierung des Phosphatidylcholins lässt man etwa 2 1 Äthanol durch die Säule laufen. Nach dem Eindampfen deP Äthanols im Vakuum unter dem Schutz eines inerten Gases verbleiben 5,3 g chemisch reines Phosphatidylcholin, das sind o % der im Rohphosphatid enthaltenen Menye,

Beispiel 5

34 g ölhaltiges Handelslec^thin werden unter leichtem Rühren und Einleiten eines inerten Gases in 17o iul technischer. Dichloräthylen gelöst und auf eine Adsorptionssäule gegeben, die mit einer Aufschlämmung von ioo g Aluminiunioxyd, basisch, Aktivstufe 2, in Dichloräthylen oder Dichloräthylen-Äthanol (95 : 5) gefüllt ist. Die weitere Aufarbeitung der Säule erfolgt analog Beispiel 4. Zur Eluierung der Neutrallipide werden etwa l,o 1 Dichloräthylen mit 5 % Äthanolzusatz benötigt, Ausbeute an Neutrallipiden: 11,6 g = 34 %. Zur Gewinnung des chemisch reinen Phosphatidylcholins wird mit etwa 1,5 1 Äthanol eluiert, Ausbeute: 5,5 g = So % des im Rohphosphatid vorhandenen Lecithins.

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Beispiel 6

4o g ölhaltiges Sojabohnenrohphosphatid werden wie unter Beispiel 5 beschrieben in 1,3 1 Propylendichlorid gelöst und auf eine Adsorptionssäule von 4 cm Durchmesser und 45 cm Länge gegeben, die mit 35o g Aluminiumoxyd, aufgeschlämmt in I ropylenchlorid, gefüllt ist. Zur Eluierung der gesamten Neutraliipide wird die Säule mit etwa 1,2 1 Propylenchlorid, dem 5 % Äthanol zugesetzt sind, ausgewaschen, Ausbeute an Neutrallipiden nach dem Abdampfen des Lösungsmittels: 13,6 g ·- 31 %„ Die nachfolgende Eluierung mit etwa 1,5 1 Äthanol ergibt nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum 6,9 g, d.h. in Ü5 %iger Ausbeute reines Phosphatidylcholin.

Beispiel 7

27 g handelsübliches Sojabohnenrohphosphatid werden wie in Beispiel 1 beschrieben in 67o ml Essigester gelöst und warm auf eine Adsorptionssäule (4 cm Durchmesser, Füllhöhe 26 cm) gegeben, die mit einer Aufschlämmung von 34o g Aluminiumoxyd in Essigester gefüllt ist. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben. Zur Eluierung der Neutrallipide werden etwa 7oo ml Essigester benötigt. Ausbeute nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels S,S g = 32,5 %, Das Phosphatidylcholin wird mit etwa Soo ml Äthanol aus der Säule herausgelöst, Ausbeute nach dem Abdampfen des Alkohols im Vakuum unter Inertgasschutz 5,ο g = 87,5 %.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von hochgereinigtem Phosphatidylcholin mit hohem Gehalt an essentiellen Fettsäuren aus pflanz* liehen "Lecithinen" durch Lösen der ölhaltigen Rohphosphat!de in Essigester oder einem dichlorierten Kohlenwasserstoff mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bzw. einer Mischung dieser Lösungsmittel und Behandlung der Lösung mit mindestens der fünffachen Menge Aluminiumoxyd, bezogen auf den Gehalt an Rohphosphat id, unter Rühren und anschliessendem Eluieren des hochgereinigten Phosphatidylcholin vom Adsorbens mit Alkohol

10 9 8 30/1798 BAD ORK3INAL -8-

nach Patent (Fatentanmeldung ) ,

dadurch gekennzeichnet., dass man die Lösung der ölhaltir;eu Rohphosphatide auf eine Aluniniumoxyd-Cäule aufgibt und dar chemisch reine Ihosphatidylcholin mit Alkohol vom Adsorbens löst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man nach dem Aufgeben der Rohphosphatidlösung auf die Gäule hit einem der Lösungsmittel bzw. deren Gemisch .nachwäscht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , dass das Lösungsmittel bis zu 3 Vol. % Alkohol enthält.

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