DE1642724C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Threonin - Google Patents

Description

10 bis nru mg ι. .

15 Außer den oben erörterten speziellen Nahrstoff-

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotech- Erfordernissen werden die üblicherweise zur Züchtung

nischen Herstellung von i.-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen angewendeten Medien und Bc-

von mindestens Diaminopimelinsäure erfordernden dingungen verwendet. Demzufolge .st erhndung^e-

Mikroorganismen der Gattung Escherichia in wäßrigen maß entweder ein synthetisches oder e.n natürliche,

Nährmedien bei hierfür üblichen Bedingungen. » Nährmedium gee.gnet. solange es die tür das Wu₁,:,-

L-Threonin ist als essentielle Aminosäure für die turn des verwendeten Stammes notwendigen Nahr-

Ernährungvon Mensch und Tier sehr wichtig. Inder stoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind in der TecW

Medizin wird es als Nährstoff verwendet, ι-Threonin bekannt: zu ihnen gehören Stoffe, wie eine Kohles-

ist in kleinen Mengen in Getreideproteinen enthalten stoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische W.-

und als Aminosäure eine äußerst nützliche Substanz. 25 bindungen u.dgl.. die von dem verwendeten Mikro-

welche die Nährwerte von Getreideproteinen ver- Organismus in geeigneten Mengen ausgenutzt werden,

bessert, wenn sie damit ergänzt werden. So seien als Kohlenstoffquelle beispielsweise Kohlen-

Veisuchsweise wurden Verfahren zur Herstellung hydrate, wie z. B. Glucose. Maltose, Rohrzucker u^ von !.-Threonin durch Fermentation durchgeführt, oder jede andere geeignete KohlenstoRquelle, wie /. _a. wobei als Hauptausgangsmaterial !--Homoserin ver- 30 Glycerin, Mannit, Sorbit, organische bauren u«,*.. wendet wurde (USA.-Patentschrift 3 099 604, japa- genannt. Diese Stoffe können einzeln oder in (.«.· nische Patentveröffentlichung 2896/61 und S ugahara mischen von zweien oder mehreren verwendet werden et al. in .»Amino Acid and Nucleic Acid«, Bd. 10. S. 68 Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten v-n [1964]). [.-Homoserin ist jedoch eine teure Verbindung. anorganischen Her organischen balzen oder Verf.1,1-Bei anderen Verfahren zur Herstellung von L-Threo- 35 düngen, wie z. B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, nin werden Mikroorganismen der Gattung Escherichia, z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsultat, Aminodie zu ihrem Wachstum mindestens Diaminopimelic niumnitrat, Ammoniumphosphat usw., oder natursäure benötigen, in einem wäßrigen Nährmedium ge- liehe stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B.MaisqueH-züchtet(USA.-Patentschriften 2937121 und 2937122); wasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Hs.hbei diesen Fermentationsverfahren werden jedoch nur 40 mehl, Bouillon, Caseinhydrolysate Fischpreßsafte. geringe Mengen an L-Threonin in den Kulturflüssig- Reiskleieextrakt usw., verwendet werden Auch d.ese keiten erzeugt, und eine praktische Durchführung Substanzen können einzeln oder in Kombination von dieser Verfahren in industriellem Maßstab ist nicht zweien oder mehreren verwende werden. Anorgaerreicht worden. nische Verbindungen, die zu dem Medium hinzuge Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Ent- 45 fügt werden können, sind z. B. Magnesiumsulfat, wicklung eines verbesserten biotechnischen Verfahrens Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kazur Herstellung von L-Threonin, das in einfacher und liummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Natriumwirksamer Weise vorteilhaft in industriellem Maßstab chlorid, Manganchlorid, Calciumchlorid, oder andere bei niedrigen Betriebskosten und mit hoher Produkt- geeignete Salze von Magnesium, Eisen, Mangan, ausbeute durchführbar ist. 5° Zink, Calcium u. dgl. Mischungen der anorganischen

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Verbindungen können verwendet werden,

biotechnischen Herstellung von L-Threonin durch Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen,

Züchten von mindestens Diaminopimelinsäure erfor- wie z. B. aerobem Schütteln der Kultur oder durch

dernden Mikroorganismen der Gattung Escherichia in Rühren einer Submerskultur unter Belüftung, bei

wäßrigen Nährmedien bei hierfür üblichen Bedingun- 55 einer Temperatur von etwa 20 bis 40°C und bei einem

gen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als pH-Wert von etwa 5,0 bis 8,5 durchgeführt. Nach

Escherichia Escherichia coli ATCC 21149 oder etwa 2 bis 4 Tagen der Züchtung unter diesen Bedin-

ATCC 21151 einsetzt. gungen sind wesentliche Mengen an L-Threonin in

Die Erfindung beinhaltet ein ausgezeichnetes in- der Kulturflüssigkeit angereichert worden,
dustrielles Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, 60 Nach Beendigung der Fermentation wird L-Threonin bei welchem die in den Kulturflüssigkeiten produ- gemäß den üblichen Maßnahmen von der Fermenzierten i.-Threonin-Mengen von 5 bis 10 g/l schwanken, tationsflüssigkeit abgetrennt, wie z. B. durch Behandwie in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird, wo- lung mit Ionenaustauscherharzen, Ausfällung mit bei diese Mengen wesentlich größer sind als die ge- Metallsalzen, Chromatographie u. dgl.
ringen, gemäß dem bisherigen Stand der Technik er- 65 Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erhaltenen Werte, z.B. 1,0 bis 1,5g/l (USA.-Patent- findung erläutern. Falls nicht anders angegeben, beschrift 2 937 121) und 2 bis 3 g/l (USA.-Patentschrift ziehen sich die darin enthaltenen Prozentangaben auf 2 937 122). das Gewicht 5 Volumenprozent.

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B e i s D i e I 1 Impfstamm verwendet. Die Züchtung des Stammes

^p wird in denselben Medien und in der gleichen Weise,

Escherichia coli ATCC 21151 (ein sowohl diamino- wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, mit der

pimelinsäure- als auch isoleucinbedürftiger Stamm) Abwandlung, daß an Stelle von Rohrzucker 50 g/I wird als Impfstamm verwendet. Dieser Stamm wird 5 Sorbit in der Zusammensetzung des Ferruentations-

unter aeroben Bedingungen 24 Stunden lang in einem mediums verwendet werden. Die nach Abschluß der

Impfkulturmedium gezüchtet, welches sich aus 20 g/l Fermentation in der Fermentationsflüssigkeit ange-

Glucose, 10 g/l Pepton, 10g/I Hefeextrakt, 2,5 g/l NaCl reicherte Menge an L-Threonin beträgt 6,5 mg/ml,
und 50 mg/1 Diaminopimelinsäure zusammensetzt. Der

sich ergebende gezüchtete Stamm wird in einem Vo- io B e i s ρ i e I 3
lumenverhältnis von 10°/₉ in einen 250 ml fassenden

dreieckigen Kolben eingeimpft, der 20 ml eines Fer- Escherichia coli ATCC 21149 (ein diaminopimelin-

mentationsmediums der folgenden Zusammensetzung säurebedürftiger Stamm, der durch Rückmutation aus

50 g/1 Rohrzucker 15 Stamm, Escherichia coli ATCC 21151, erhalten worden

14 g I (NH₄).,SO₄ war) wird als Impfstamm verwendet. Die Züchtung des

1 g/I K H₂PO₄ Stammes wird in denselben Medien und in der gleichen

0,3 g/l MgSO₄ · 7 H₂O Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt,

20 g/I CaCO₃ " mit der Abwandlung, daß die Konzentration an

25 mg/I i.-lsoleucin 20 Diaminopimelinsäure auf 100 mg/1 abgeändert und

kein L-Isoleucin in der Zusammensetzung des Fermen-

Der pH-Wert dieses Mediums beträgt 7.2. tationsmediums vorwendet wird. Nach Abschluß der

Die Züchtung wird dann unter aerobem Schütteln Fermentation beträgt die in der Fermentationsflüssigder Kultur bei 30°C 96 Stunden lang durchgeführt. keit angereicherte Menge an L-Threonin 5,3 mg ml.
Nach 96 Stunden dauernder Züchtung beträgt die in as

der Kulturflüssig: eit angereicherte Menge an L-Threo- Beispiel 4

nin 10,2 mg/ml.

Das L-Threonin in der Fermentationsflüssigkeit Die Züchtung wird mit demselben Stamm, in den-

wird durch Ionenaustauscherharz! shandlung gewon- selben Medien und unter denselben Bedingungen wie nen, nachdem das Mycel und CaCO₃ aus der Fermen- 30 im Beispiel 3 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß tationsflüssigkeit entfernt worden waren. an Stelle von Rohrzucker 50 g/l Mannit in der Zu

sammensetzung des Fermentationsmediums verwendet

Beispiel ² werden. Nach Abschluß der Fermentation beträgt die

Escherichia coli ATCC 21151 (sowohl diamino- in der Fermentationsflüssigkeit angereicherte Menge pimelinsäure- als auch isoleucinbedürftig) wird als 35 an L-Threonin 6,3 mg/ml.

Claims (1)

1. Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme sind bei

   _D „ . . j„ American Tvpe Culture Collection hinterlegt

   Patentanspruch: der American ¹JV" ^ ,„i„„ a„ v„\t,,_TI>„ „ι-

   worden und sind in dem Katalog der Kulturen als

   Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Escherichia eoli ATCC 21149 und Eschench.a eol.

   L-Threonin durch Züchten von mindestens Di- 5 ATCC 21151 bezeichnet diaminommelin

   ammopimelinsäure erfordernden Mikroorganismen Eschenchia colt ATCC 21149 ist diammopimel rider Gattung Escherichia in wäßrigen Nährmedien säurebedürftig, und Eschenchia coIiATCC 21151 ist bei hierfür üblichen Bedingungen, dadurch diaminopimelinsäure- und isoleucinbedurf ig.

   gekennzeichnet, daß man als Escherichia Die in dem Nährmed.um verwendete Konwn-

   Escherichia coli ATCC 21149 oder ATCC 21151 io tration an Diaminopimelinsäure betrag vorzugsweise

   einsetzt 10 bis 300 mg/1- Die Menge an Isoleucin m Nähr-

   medium im Falle der Verwendung_ des gleichzeitig

   isoleucinbedürftigen Stammes, beträgt vorzugsweise