DE2103861C - Verfahren zur Herstellung von Inosin auf mikrobiologischem Wege - Google Patents

Description

in.i-.in (lUpovanthin-Ribosid) ist ein wichtes Zwische:iproüukt zur Herstellung \on 5'-lnosmsäure (lno>m-5-phosphorsäure), die in großem Umfang als ehemi\dier Wurzstoff verwendet wird. Fener hat Inosin in letzter Zeit als wichtiges Arzneimittel Bedeulung gewonnen, da es ausgezeichnete therapeutische Wirkungen bei schwerem Herzleiden. Leberleiden oder abrormem Zellstoffwechscl. z. B. L.eukopenie. zeigt.

Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von Inosin weisen Nachteile und Mängel auf

fs wurde häufig gefunden, daß das Enzymsystem zur Biosynthese von 5'-lnosinsäure. die als Vorläufer des Inosins angesehen wird, der Feedback-Hemmung und der Repression durch verschiedene Purinnucleotide oder ähnliche Verbindungen unterlieg! (vergl. Harn ο Mom öse, Protein. Nucleic Acid and Enzyme [Japan], Bd. 13, S. 781 [1968]). Versetzt man das Nährmedium eines zur Akkumulation von 5'-lnosinsäure befähigten Mikroorganismus während der Akkumulation von 5'-Inosinsäure z. B. mit einem Überschuß \ou Adenin oder Guanin, so wird die Akkumulation der 5'-lnosinsäure beträchtlich gehemmt.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Herstellung von Inosin auf mikrobiologischem Wege zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile und Mängel der bekannten Verfahren nicht aufweist. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung beruht auf dem Befund, J.'.B das En/\ msvstem zur Biosynthese von 5-Inosinsäure bei bestimmten Mikroorganismen von der Art Brevibacterium aminoniagenes keiner solchen Fccdback-Hemmung und/oder Repression unterliegt. Diese Mikroorganismen häufen während der Fermentation beträch !liehe Inosinmengen im Kulturmedium und in den Zellen an. Inosin wurde bereits durch Züchten bestimmter Stämme von Brevibaclerium ammoniauenes erhallen (französische Patentschrift 1 487 024, deutsche Offenlcgungsschrift 1 807 622).

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Inosin durch aerobes Züchten eines Stammes der Art Brcvibactcriiim ammoitiagcnes in einem hierfür üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pll-Wcrt-Vcrhältnissen, das dadurch gekennzeichnet ist, daR man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21 477, Brevibaclerium aminoniagenes ATCC 21 478, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21 479 oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21 480 einsetzt.

Nach dem Verfahren der Erfindung gelingt es. Inosin auf einfache Weise aus billigen Ausgangsstoffen in hoher Ausbeute herzustellen.

Die zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendeten Bakterienstämme wurden durch mutagene Behandlung, z. B. mit Hilfe von ultrav ioletten Strahlen. Röntgenstrahlen. y-Strahlen oder mutagenen Verbindungen, erhalten. Die Bakterienstämme wurden mit hoher Häufigkeit isoliert, wenn man die Mikro-Organismen nach durchgeführter Mutation auf cnem purinanaioge Verbindungen, 7. B. 6-Mercaptopurin. 6-Mercaptoguanin. 6-Methylmercaptopurin. S-Azaadenin. 8-Azaguanin. 8-Azaxanthin. 2-Fluoradenin und 2-Bromadenin. enthaltenden Agar-N'ährboden wachsen lief

Die Tabe' ι I und Il zeigen, daß das Enzymsystem zur Biosynt: jse der 5-lnosinsäure df zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendeten Mikroorganismen nicht der Feedback-Hemmung und oder Repression unterliegt. Der Ausgangsstamm Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6S72 (WiIdstamm) wurde nach Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin auf einem 6-Mercaptoguanin enthaltender Nährboden ausgestrichen. Aus den gewachsenen Mikroorganismen wird der Stamm Brevibaeterium ammoniagenes, der die Bezeichnung ATCC 21477 erhielt, isolfert. Tabelle 1 zeigt, daß die Phosphoribosyl-pyrophosphat-amidotransferase (Enzymnummer 2.4.2.14) dieser Mutante durch Purin-

3η nucleotide nicht gehemmt wird. Das genannte Enzym ist ein Schlüsselenzym der Biosynthese von 5'-Inosi:isäure und ein l.eitenzym zur Untersuchung der Feedback-Hemmung dieses Biosynthesewegs. Tabelle II zeigt, daß die Enzymbildung durch Purinbasen nicht reprimiert wird.

Tabelle I

Inhibitor

Adenosin-5'-mono-
phosphat
Adenosin-5'-triphos-
phat ....
Uuanosin-
^so 5'-monophosphat

Molare
Inhibitor-Konzen
tration

10 -

10

10 -

Tabelle Il

Hemmung der Phosphor-

ibosylpyrophosphatarr.idotransferase. Prozent ATCC 6872 1 ATCC 21477

iOO

100

Reprcssor	Repressor- Konzcn- iraiion, mg/1	Repression der Enzym bildung, Prozent ATCC 6872 j ATCC 21477	0 0
\denin Guanin	500 500	80 75

Bei einigen der beim Verfahren der Erfindung einzusetzenden Stämme handelt es sich um Nährstoffabhängige Stämme, deren Enzymsystem zur Biosynthese von 5'-lnosinsäure keiner Feedback-Hemmung und/oder Repression unterliegt und die zum Wachs-

ium ζ. B. Aminosäuren. Vitamine oder organische Basen benotigen. In den Beispielen 3 und 4 wird gezeigt, daß die dort verwendeten, guanin- und oder adeninabhängigen Stämme in hoher Austeile produzieren.

Im Verfahren der Erfindung können sowohl synthetische als auch komplexe Nährlösungen verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie die für das Wachstum des verwendeten Stammes notwendigen Bestandteile enthalten. Solche Nährlösungen sind wohlbekannt und enthalten 7. B. eine Kohlensioffquelle. eine StickstofTquelle. anorganische Verbindungen und Spuren wichtiger Elemente und Verbindungen. Als Kohlenstoffquelle können /. B. Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose. Saccharose. Maltose. Mannose. Mannit, Galactose. Riho;e. Glycerin. Stärke, flüssiges Stärekhydroksai und Melasse, organische ->iuren. wie Essigsäure. Milchsäure. Brenztraubensäure und Cilukonsäure oder Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure. Alanin. Glutanin und Asparagin, verwendet werden. Als KohLp.siuiiquelle kann entweder eine der genannten Verbindungen oder ein Gemisch aus mehreren dieser Verbindungen verwendet werden. Wenn dse im Verfahren der Erfindung verwendeten Stämme Kohlenwasserstoffe zu assimilieren -vermögen, kann auch ein Kohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoffeen-ii-vV. als hauptsächliche Kohlenstoffquelle verwendet werden. Solche Kohlenwasserstoffe sind z. B. unverzweigte Paraffine mit 5 his I " C-Atomen, wie n-Pentan. n-Octan. η-Dekan. n-Dodekan und n-He\adekan. verzweigte Paraffine, wie Isopentan und Isooctan. alicyclische Kohlenwasserstoffe, wie Cyclohexan und Cyclooctan. geradkettige und verzweigte Olefine wie Penten-(2). Hexen-(l), Octen-U) und Octen-(2). cyclische Olefine, wie Cyclohexen. aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, o-Xylol, und p-Xylol, und Kohlenwasserstoffgemische, wie Petroläther. Leichtöle, Schweröle und Paraffinole, d. h. verschiedene Erdölfraklionen einschließlich Rohöl. Es können einzelne Kohlenwasserstoffe oder Gemische mehrerer Kohlenwasserstoffe verwendet werden. Es kann auch /. B. ein Kohlenhydrat zusammen mit einem Kohlenwasserstoff als Kohlenstoff quelle verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können anorganische oder organische Verbindungen, z. B. Ammoniak. Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid. Ammoniumsulfat. Ammoniumnitrat, Ammoniumaeetat. Ammoniumphosphat und Ammoniumcarbonat, Harnstoff, Glycin. Glutaminsäure und Alanin oder stickstoffhaltige Substanzen tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt. Fleischextrakt. Pepton, Fischmehl, Bouillon Caseinhydrolysate, lösliche Fischbestandteile, Reiskleieextrakt. NZ-Amine (eine Reihe von Caseinhydroly säten), entfetteter Sojabohnenpreßkuchen, angedaute Produkte, wie abgebautes Fischmehl oder abgebauter entfetteter Sojabohnenpreßkuchen oderSchmetterlingspuppenhydrolysat, verwendet werden. Die genannten Stickstoffquellen können entvveder einzeln oder als Gemische verwendet werden.

Als anorganische Verbindungen können der Nährlösung z. B. Magnesiumsulfat. Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Eisen(ll)-sulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat, Mangansulfat und CaI-ciumcarbonat zugesetzt werden.

Wenn im Verfahren der Erfindung Bakterienstämme verwendet werden, die zum Wachstum Spuren wichtiger Nährstoffe. /.. B. Vitamine. Aminosäuren oder organische Basen, benötigen, so werden diese \ erbindungen der Nährlösung zugesetzt, wenn sie nicht schon in den Hauptbestandteilen der Nährlösung eniKilien sind. Solche wichtigen Nährstoffe sind z. B. Purinbasen. wie Adenin oder Guanin, und oder Vitamine, wie Biotin. Thiamin und Cobalamin. Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen.

ίο z. B. in aerober Schütielkullur oder in belüfteter und gerührter Submerskuliur. bei Temperaturen von etwa 20 bis 4(1 C und einem pH-Wert der Nährlösung von etwa 4.0 bis etwa 9.0 durchgeführt. Zur Erzielung hoher Inosinausbeuten wird während der Fernientation der pH-Wert durch Zugabe von /. B. wäßriger Ammoniak-. Harnstoff- oder Nairiumhydro'udlösung auf etwa 7.0 gehalten. Im Verfahren der Erfindung stellen jedoch die Temperatur und der pH-Wert der Fermentation keine kritischen Faktoren dar. Nach 2- bis 7tägiger Fermentation unter den genannten Bedingungen haben sich beträchtliche Inosinmengen in der Kulturflüssigkeit und in den Zellen des Mikroorganismus angereichert.

Nach beendeter Fermentation wird das Inosin aus der KuI'irflüssigkeit nach bekannten Methoden, z. B. mit Hilfe von Ionenaustauschern, durch Lösungsmittelextraktion. Ausfällung, -\dsoption oder Chromatographie isoliert. Vorzugsweise wird das Inosin mit Hilfe von Ionenaustauschern isoliert.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Wenn nicht anders vermerkt, sind die angegebenen Prozente Gew iehtsprozenle Liter Wasser.

Beispiel 1

3=^ Brevibaeterium ammoniagenes ATCC 21477 wird in einer aus 2% Glucose. 1 °·₀ Pepton. 1" „ Fleischextrakt. 1% HefeextKjkt und 0,3'V₀ Natriumchlorid bestehenden Nährlösung 24 Stunden bei 30 C zur Gewinnung des Anzuchtstamms gezüchtet.

Es wird eine Nährlösung hergestellt, die pro Liter Wasser folgende Bestandteile enthält:

50	g	Glucose.
10	g	Kaliumdihydrogenphosphat.
10	CI)	Dikaliiimhydrogenphüsphat.
10	e	Magnesiumsulfat.
1.	Og	Calciumchlorid.
10	mg	Eisensulfat.
1	mg	Zinksulfat,
10	mg	Mangansulfat.
5	mg	Vitamin B1.
10	mg	Calciumpantolhenat.
20	mg	Cystin.
30	Ug	Biotin,
10	g	Fleischextrakt,
2	•TO 1	Harnstoff (getrennt sterilisiert)

3 Liter dieser Nährlösung werden nach Einstellen des pH auf einen Wert von 7,8 in einem 5-Liter-

fio Fermenter 30 Minuten bei 120 C sterilisiert. Die abgekühlte sterilisierte Nährlösung wird mit 3(X) ml des vorstehend beschriebenen Anzuehtstamins beimpft. Nach 4tätiger Fermentation, wobei der pH-Wert mit wäßriger Ammoniaklösung auf 6.8 gehalten wird, enthält die Kulturflüssigkeit 35,4 mg Inosin ml.

Die Kulturflüssigkeit wird zur Entfernung des

Zellmaterials und der Niederschläge filtriert. 1 Liter des Kulturfiltrats wird zusammen mit I Liter eines

ihirJi Furakiion des /ellenmaterials und der Niederschläge r.iit heißem Wasser erhaltenen Fvtrakts auf eine loneiiausiauschersäule siark saurer Kationenaustauscher auf der Basis eines Surol-Divinvlbenzol-Copoivnierisats gegeben, wobei das Inosin an den Ionenaustauscher gebunden wird. Die Säule wird mit Wasser gewa.seIien und anschließend mit 0.0! π »illriser Ammoniaklosung elutert. Die inosinhaltigen Fraktionen werden vereinigt, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck teilweise abdestilhert. Nach Abkühlen des Konzentrats werden IS.4 g Inosin ui Form verunreinigter Kristalle erhalten. Die Identität der urrkrisialiisierte'i Verbindung mit Inosin wurde durch Flemenuiranahse. Bestimmung des Gehalts von Base und Zucker. L itraMoleitspektroskopie und Bestimmung der Ri-W cnc in der Papierchromaiographic nachgewiesen.

Beispiel 2

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wurde mit ultraviolettem Licht bestrahlt. Die aus diesem Stamm isolierte Mutante Brevibai .erium ammoniagenes ATCC 2147S wird als Anzuchtstamm verwendet. Die Fermentation wird gemäß Beispiel I durchgeführt, ausgenommen, daß Glucose durch ein Stärkehydrolysat mit einem Glucosegehah von 200g Liter ersetzt wird. Nach 1 HMündiger Fermentation enthält die Kulturflüssigkeit 43.5 mg Inosin ml.

Beispiel 3

Brevibacterium ammoniagenes ATCC21 477 wurde mit ultraviolettem Licht bestrahlt. Die daraus isolierte adeninahhängige Mutante Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21479 wird als Anzuchtstamm verwendet. Die Fermentation wird gemäß Beispiel i durchgeführt, ausgenommen, daß der Nährlösung 300 mg Liter Adenin und KK) mg Liter Hypoxanthin zugesetzt wert' ^-n: ferner wird die Nährlösung 48 Stunden nach Beginn der Fermentation mit 5"₀ Glucose versetzt. 7ur pH-Regulierung der Kullurflüssigkeit wird eine 2O⁰Z₀IgC wäßrige Harnstofflösung verwendet. Nach 120stündigcr Fermentation enthält die Kulturflüssigkcit 45.5 mg Inosin ml.

Beispiel 4

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21478 wurde mit Methansiilfonsäureäthyiester behandelt. Die daraus isolierte adenin- und guaninabhängige Mutante Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21480 wird als Anzuchlstamm verwendet.

Es wird eine Nährlösung hergestellt, die in 1 Liter Wasser folgende Bestandteile enthält:

15"/₀ (ausgedrückt in Glucose) säurehydroly-

sierte Abfallmasse.
2,0 g Dikaliumhydrogenphosphat,

5 nig Vitamin B₁.
Ui mg ,"i'-AIunin.

i..(i J Harnstoff (getreu sterilisiert).
5.0 g Natmmiglutamat.
2.0 g I'ep'.on.

30o mn Adenin.
200 mg Guanin.

Der pH-Wert der Nährlösung wird auf 7,4 eii.gestellt. Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt, ausgenommen, daß die Kühlflüssigkeit 4¹S biiinden nach Beginn der Fermentation mit 10" „ (ausgedrückt in Glucose! säurehvdrolvsierier Abfallmelassc versetzt wird. Der pH-Wert der Kultiirflüssigkeit wird mit wäßriger Ammoniaklösung auf 6.4 einresiuüert. Nach 120sti'indiger Fermentation enthält die Kühlflüssigkeit 52.4mg Inosinml.

In der nachstehenden Tabelle werden die lnosinausbeuten, die nach dem eri'indungsgemäßen Vcrfahren erhalten werden, mit den nach bekannten Verfahren erhaltenen Ausbeute, verdienen.

Stamm

In der
Kuliurbruhe I

Ausbeute, bc/ogen auf die Hatipi-

	enmaiicncs	kohlenstoiT
	Inosin, πιμ mi	quelle. "
Brevibacterium ammonia
genes ATCC 21295 (deut
sche Offeniegungsschrift
1 K07 622. Beispiel 1) ...	18.4	18.4
Baflillus pumilus tiottheil
ATCC 19546 (deutsche
Offeniegungsschrift
1 517 S57. Beispiel 3) ...	17.8	17.8
Arthrobactcr paraftineus
ATCC 21161 (französi
sche Patentschrift
1 563 036. Beispiel 2) ...	2.8	2.8
Brevibacterium ammonia
genes ATCC 15312 (fran
zösische Patentschrift
1 487 024. Beispiel 2) ...	7.3	9.1
Bacillus subtilis ATCC
14661 (französische Pa
tentschrift 1 321 118,
Beispiel 3)	4.5	9,0
Bacillus subtilis ATCC
19162 (L1SA.-Patent
schrift 3 409 502. Bei
spiel 2) ....	5.6	11,2
Vorliegende Erfindung
Beispiel 1	35,4	23.6
Beispiel 2	43.5	21,8
Beispiel 3	45.5	22,8
Beispiel 4	52.4	21,0

Claims (1)

1. Patenianspruch:

   Verfahren zur Herstellung \on Inosin durch aerobes Züchten eines Stammes der Art Brevibaeterium ammoniagenes in einem hierfür üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-\\ emerhältnissen. dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21 477. Brcvibacterium ammoniager.e> ATCC 21 478, Brcvibaclerium ammonia gen es ATCC 21 479 oder Brevibacierium ammoniaseres ATCC 21 480 einsetzt.