DE1695323A1

DE1695323A1 - Verfahren zur Herstellung von Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat

Info

Publication number: DE1695323A1
Application number: DE19671695323
Authority: DE
Inventors: Kioshi Nakayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-08-08
Filing date: 1967-07-24
Publication date: 1972-04-20
Also published as: BE702406A; DE1695323B2; ES343895A1; DE1695323C3; GB1161262A; US3762999A; CH510735A; YU155967A; NL6710555A; YU31708B

Description

^ Patentanwälte -

Dr.-Ing. H-NS RUSCHKE

γγη -".-. ^--Ni7 α-mi ad Patentanmeldung P 16 95 323«>4-44

Up!.-,,.., ..:.:· ,Z M^ULAK Unser Zeichen: K 746

8 München i>^· riiii»«:enc:uerstr. 2

München, den

12. März1970

KYOWA HAKKO KOGYO GO. LTD., Tokyo/Japan

"Verfahren zur Herstellung von Adenosindiphosphat und

Adenosintriphosphat"

Die vorliegende Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Adenosindiphoaphat und Adenosintriphosphat durch Gärung in Gegenwart einer geeigneten Kohlenstoff quelle, beispielsweise Kohlehydraten, anorganischen
Phosphaten und Adenin oder dessen Derivaten.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat werden in der .biochemie auf zahlreichen ü-ebieten eingesetzt. Bei-

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Unteriagen (Art 7 51 Atm. 2 Nr. I Sate 3 des Xnd«une*e₃. v. 4.9. If 67)

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spielsweise findet Adenosindiphosphat verwendung bei der Zellatmung. Die Geschwindigkeit, mit welcher Nahrungsmittel verbrannt werden können, wird durch das Bedürfnis der Zellen nach einer geeigneten Energiezufuhr bestimmt. Die Verwendung von Adenosintriphosphat zum Antreiben der verschiedenen Energie erfordernden verfanren der Zelle erhöht automatisch die verfügbare Zufuhr von Adenosindiphosphat und anorganischen Phosphaten, welche ihrerseits für eine Reaktion in dem Kupplungsmechanismus zur Verfügung stehen und ein Fortschreiten der Atmung ermöglichen. Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat (,nachfolgend als ADP und ATP bezeichnet) spielen ferner eine wichtige Holle bei aem Stoffwechsel in vivo. Außerdem sina diese Verbindungen Dedeutsame biochemische xteagentien, hoch-energetische Phosphorsäureadditive und Arzneimittel. Adenosintriphosphat ist ferner bei der Acetylcoenzym-A-Synthese, Dei der Synthese von aktivem Sulfat sowie bei der Syntnese von oholesterin oder dergl. wirksam.

Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von ADP und AIP, das in wirksamer und einfacher Weise durchgeführt werden kann. Erfindun^sgemäß werden Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat nach einer

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üärungsmethode in industriellem Laßstabe in guter Ausbeute hergestellt. Dieses verbesserte Verfahren zur Herstellung von ADP und ATP durcn Fermentierung in Gegenwart von K.ohlenyaraten als hauptsächlicher Kohlenstoffq.uelle ist mit sehr geringen rosten behaftet.

Erfindungsgemäß hat sich herausgestellt, daß ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von ADP und ATP durch Züchtung eines Mikroorganismus durchgeführt werden kann, welcher ADP und aTP in einem wäßrigen xjährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von wenigstens einem Kohlehydrat als Hauptkohlenstoffquelle, anorganischen Phosphaten und Adenin oder dessen Derivaten zu erzeugen vermag, wobei die genannten Bestandteile in einer derart ausreichenden Menge vorliegen, daß Adenosindipiiosphat und/oder Adenosintriphosphat in dem Kulturmedium angehäuft werden. Zur Gewinnung von AxiP und ATP in hohen Ausbeuten liegen die Kohlehydrate, anorganischen Phosphate sowie Adenin oder dessen Derivate in vorteilhafter V/eise in dem Kulturmedium in spezifischen Konzentrationen vor.

Die Bakterien, welcne die Kohlehydrate zu assimilieren und in dem waSrigen Ilährmedium zu wachsen vermögen, wobei große

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Mengen an ADP und ATP geoildet werden, gehören einer Vielzahl von Arten und Gattungen an. Versuche haben gezeigt, daß Stämme, welche in besonders wirksamer Y/eise Adenosindiphosphat und/oder Adenosintriphosphat zu erzeugen vermögen, zu den Gattungen Oorynebacterium, Arthrobacter und Micrococcus gehören.

Es hat sich herausgestellt, daß erhebliche Mengen an ADP und ATP in einem Kulturmedium angesammelt werden können, wenn Mikroorganismen verwendet werden, welche die nachstehend angegebenen Eigenschaften besitzen, wobei die spezifizierten Gärungsbedingungen eingehalten werden müssen.

Die erfindungsgeraäß verwendeten Mikroorganismen besitzen die Eigenschaft, daß sie ADP und ATP in dem Kulturmedium erzeugen, wobei die Züchtung in Gegenwart von Adenin durchgeführt wird. Mikroorganismen mit dieser Eigenschaft sind weit verteilt und können nicht unter eine bestimmte Art eingeordnet werden.

Ausgezeichnete Stämme Mikroorganismen können durch die folgende Auswahlmethode von Mikroorganismen, die im Erdboden, in der Luft, in 'i'ierkörpern und anderen natürlichen otellen

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leben sowie von Zuchtstämmen erhalten werden. Die Mikroorganismen werden in einem Reagenzglas auf 10 ml eines Kulturmediums aufgeimpft, das beispielsweise aus 10 % Glukose, 1 £ K₂HPO₄, 1 fo KH₂PO₄, 1 # MgSO₄ . 7H₂O, 1 °/o Hefe extrakt und 30 ug/1 Biotin besteht. Das Züchten wird dann unter Schütteln durchgeführt. Nach 48 Stunden wird dem Kulturmedium Adenin zugefügt, so daß die Adeninkonzentration 2 mg/ml beträgtβ weiterhin werden nach 48 Stunden 0,01 ml der überstehenden Kulturbrühe auf ein Filterpapier in ü'orm eines Fleckens aufgetragen und einer Papierchromatographie unterzogen. Die Stämme, die AIP und ADP bilden können und die durch die genannte' Chromatographie ermittelt und durch UV-Bestrahlung sichtbar werden, werden abgetrennt. Die auf diese Weise isolierten Mikroorganismen werden für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt. Beispielsweise der Mikroorganismen, die für das erfindungegemäße Verfahren verwendet werden können, sind Bakterien, welche den Gattungen Uorynebacterium, Arthrobacter und mikrococcus angehören. Diese Stämme werden bei den nachstehend angegebenen Beispielen eingesetzx.

Das Gärungsmedium besteht entweder aus einem synthetischen Züchtungsmedium oder aus einem natürlichen Nährmedium,

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welches die wesentlichen Uahrungsbestandteile für das Wachsen der verwendeten Hikroorganismenstamme enthält. Ein derartiges (xärungsmedium enthält spezifische Mengen an Kohlehydraten als Hauptkohlenstoffquelle sowie spezifische Mengen an anorganischen Phosphaten sowie anaere Nährmittel, die dem Fachmann geläufig sind, beispielsweise eine Stickstoff quelle, anorganische Verbindungen oder dergleichen, wobei diese Komponenten je nach dem verwende ten. Mikroorganismus in spezifischen Mengen eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäß verwendete Kulturmedium zur Herstellung von ADP und AiEP in hohen Ausbeuten enthält Kohlehydrate als Hauptkohlenstoffquelle in einer Menge von ungefähr 5 bis 20 ?6. Die Kohlehydrate, welche für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden können, sind beispielsweise Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysat, Heiassen oder dergleichen. Geringe Mengen anderer geeigneter Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise Glycerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren, Kohlenwasserstoffe oder dergl., können in dem Gärungsmedium zusammen mit den Kohlehydraten eingesetzt werden. Die Kohlehydrate können entweder einzeln oder in Mischungen aus 2 oder mehreren Kohle- hydraten verwendet werden, wobei kleine Mengen anderer

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Kohlenstoffquellen ebenfalls entweder einzeln oder in Mischungen aus 2 oder mehreren Bestandteilen zugegen sein können.

.uie anorganischen Phosphate, welche in dem erfindungsgemäien Kulturmedium zur Erzeugung von Adenosindiphosphat und/oder Adenosintriphosphat in hohen Ausbeuten verwendet werden, liegen in einer Menge von 0,4 bis 3 °/>_t berechnet als PO., vor. Geeignete anorganische Phosphate, die in wirksamer Weise verwendet werden können, sind beispielsweise liatriumpho sphat, Natriumdinydrogenphosphat, Natriummonohydrogenphosphat, Kaliumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat sowie andere ähnliche organische Phosphate, .uie bevorzugten Phosphate sind Kaliummonohydro- £enphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat_β Andere anorganische Verbindungen, welche dem erfindungsgemäßen kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid oder dergleichen.

Adenin oder dessen .Derivate werden dem Kulturmedium zu jeder beliebigen Zeit während der Züchtung in einer solchen Menge zugesetzt, die dazu ausreicht, Adenosindiphosphat und Adenosinxriphosphat in dem Kulturmedium anzuhäufen. Zur Her-

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stellung von ADP und ATP in hohen Ausbeuten werden Adenin oder seine Derivate in dem Kulturmedium in einer Menge von ungefähr 1 bis 10 mg/ml verwendet· Bei geringerer Konzentration ist die Menge an ADP und aTP entsprechend niedriger. Werden größere Mengen an Adenin als die vorstehend erwähnten verwendet, dann ist die Umwandlungsgeschwindigkeit von Adenin zu aDP und ATP niedrig. Adenin oder seine Derivate können zu Beginn der iiüchtung oder während der Züchtung zugesetzt werden. Adenin kann in Form von unschädlichen Salzen, wie beispielsweise in Form des Eydrochlorids oder Sulfats oder in Form von Derivaten derartiger Verbindungen zugesetzt werden, beispielsweise in Form von Adenosin, das in einfacher Weise infolge der Eigenschaften der verwendeten ijtämme in Adenin umgewandelt werden kann. Von anderen Adeninderivaten seien beispielsweise Adenin rib ο s id und Adenin— ribotid sowie die natürlichen Substanzen erwähnt, welche Adenin enthalten. Außerdem seien die Fälle erwähnt, in denen die verwendeten Mikroorganismen selbst Adenin erzeugen.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer oalze oder Verbindungen eingesetzt werden, beispielsweise Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammonium-

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phosphat oder dergl. sowie eine oder mehr als eine Aminosäure zusammen mit anderen Aminosäuren oder natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, beispielsweise Maiswasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Bouillon, Kaseinhydrolysate, lösliche Fischbestandteile, Reiskleie oder dergleichen. Diese Substanzen können entweder für sich allein oder in Kombination aus 2 oder mehreren Bestandteilen verwendet werden. Es kann ferner erforderlich sein, dem Kulturmedium bestimmte Nährstoffe zuzusetzen, und zwar nach dem jeweils verwendeten Mikroorganismus. Als Nährstoffe seien Aminosäuren, beispielsweise Asparaginsäure, Threonin, Methionin oder dergl. und/oder Vitamine, oeispielsweise Biotin, Thiamin, Cobalamin oder dergl. erwähnt.

Die Gärung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise wird entweder eine Kultur unter aeroben Bedingungen geschüttelt oder eine submerse Kultur gerührt, wobei eine Temperatur von ungefähr 20 bis 40°0 und ein pH von ungefähr 5 bis 9 eingehalten wird. Bemerkenswert große Mengen an Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat werden in der Gärungsflüssigkeit angefunden.

Nach Beendigung der Gärung können das Adenosindiphosphat

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und Adenosintriphospiiat von eier iuilturbrühe in üblicher Weise abgetrennt werden, beispielsweise durch Behandlung mittels eines Ionenaustauscherharzes, durch Ausfällung mit Metallsalzen, durch Extraktionsmethoden, herkömmliche Adsorptionsmethoden, Chromatographie oder dergleichen.

Die folgenden Beispiele erläutern aie Erfindung, ohne sie zu beschränken. Sofern nicht anders angegeben beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht.

Beispiel 1

Corynebacterium sp. Nr. 34-85 ATCC 21084 wird als Beimpfungsbakterium verwendet. Bs wird bei 30°C 24 Stunden lang in einem aus 2 # Glukose, 1 f> Pepton, 1 $> Hefeextrakt, 0,3 ¥> Natriumchlorid und 30 /ug/l Biotin bestehenden zuchtmedium gezüchtet.

Das verwendete Gärungsmedium besitzt folgende Zusammensetzung:

120 g Glukose

12 g K₂HPO₄

12 g KH₂PO₄

12 g MgSO₄.7H₂O

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6 g Harnstoff
10 g Hefeextrakt
30 yug Biotin pro Liter des Kulturmediums.

Von der oben erwähnten Zusammensetzung wird Harnstoff in einer 12#-igen Lösung getrennt sterilisiert und zu 19 des Restes des fcrärungsmediums zugesetzt, welches vorher in

einem Autoklaven 10 Hinuten lang unter 1 kg/cm sterilisiert worden ist·

Die Zuchtkultur wird auf 20 ml des Grärungsmediums in einem 25OmI-ErIenmeyerkolben in einer Menge von 10 ^, bezogen auf das Volumen, auf geimpft. Die Gärung wird durch Schütteln der Kultur bei 30⁰C unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Nach einer 72-stündigen Züchtung wird Adenin dem Gärungsmedium. zur Einstellung einer Konzentration von 2 mg/ml zugesetzt. Hach einer Züchtung von weiteren 48 Stunden sammeln sich Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat in der Gärungs— flüssigkeit in Mengen von 1,1 mg/ml bzw. 4,2 mg/ml an.

Das aus der Gärungsflüssigkeit durch Filtrieren über Pilterzellenkörper erhaltene Piltrat wird durch eine Kolonne mit einem stark basischen Anionenaus taus ehe rhar ζ (Dowex 1 (X2) , Chlorid-Typ) geleitet. Die jeweils durch Eluierung mit

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•Salzsäure erhaltenen Adenosindiphosphat- und Adenosintri- . phosphatfraktionen werden mit Natronlauge neutralisiert und anschließend mit Kohlenstoffpulver behandelt. Danach erfolgt eine Konzentrierung und Abkühlung. Auf diese V/eise werden Kristalle von Natriumsalzen von Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat erhalten.

Wird das vorstehend beschriebene Beispiel wiederholt, wobei nur die G-luko sekonzentration auf 3 % geändert wird oder nur die Konzentration von K₂HPO. und KHp₁PO. auf 0,2 ⁰J₀ abgeänddert wird, wobei alle anderen Bedingungen die gleichen bleiben, dann betragen die Mengen an erzeugtem ADP und ATP in beiden Fällen 0,5 mg/ml bzw. weniger.

Beispiel 2

Arthrobacter sp. Nr. 3486 ATCC 21085 wird als Beimpfungsmikroorganismus verwendet, wobei aie anderen Züchtungsbedingungen die gleichen wie in Beispiel 1 sind. Die Mengen an Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat, welche sich in der Gärungsflüssigkeit ansammeln, betragen 2,1 mg/ml bzw. 3,8 mg/ml.

.Beispiel 3

Mikrococcus sodonensis ATCC 15932 wird als Beimpfungsmikro-

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Organismus verwendet, wobei die Züchtungsbedingungen die gleichen wie in Beispiel 1 sind. Die Mengen an Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat, welche sich in der Gärungsflüssigkeit ansammeln, betragen 0,6 mg/ml bzw. 1,7 mg/ml.

Wird das Beispiel 3 unter Verwendung von 3 $ Glukose oder 0,2 i> K₂HPO₄ und HH₂PO. durchgeführt, dann beträgt di· Menge an angesammeltem Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat 0,3 mg/ml bzw. 0,4 mg/ml in beiden fällen·

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Claims

Patentanmeldung P 16 95 323.4-44 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Unser Zeichen» K 746

München, den

Patentansprüche

1· Verfahren zur Herstellung von Adenosindiphosphat und Adenosintr!phosphat, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus, welcher in der Lage ist, Adenosindiphosphat und Adenosintr!phosphat zu erzeugen, in einem wäßrigen Nährmeddum unter aeroben Bedingungen in Gegenwart wenigstens eines Kohlehydrates als Hauptkohlenstoffquelle, eines anorganischen Phosphats sowie von Adenin oder dessen Derivaten gezüchtet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus, welcher Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat zu erzeugen vermag, ein solcher verwendet wird, der zu der Gattung Corynebaoterium, Arthrobacter oder Microcoocus gehört.
3. Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

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Neue Unterlagen (m.i§i**aNfct8*3*.

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als Mikroorganismus üorynebacterium sp. Ur. 3485 ATCG 21084 verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Arthrobacter sp. Ur. 3486 ATGC 21085 verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Micrococcus sodonensis ATCC 15932 verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlehydrat Glukose und als anorganisches Phosphat eine Mischung aus Kaliummonohydrogenphosphat und Kaliumdihyarogenphosphat verwendet wird.
7. Verfahren zur Herstellung von Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium, Arthrobacter oder Kicrococcus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von ungefähr 5 bis 20 <fo Kohlehydraten als üauptkohlenstoffquelle, ungefähr 0,4 bis 3,0 $ anorganischen Phoepkaxen als PO. und Adenin oder dessen Derivaten in einer Menge, die dazu ausreicht, läenosindiphosphat und Adenosintriphosphat anzusammeln, gezüchtet wird

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und das Adenosindiphosphat und Adenosintr!phosphat von dem Medium abgetrennt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Adenin oder dessen Derivate in dem Kulturmedium in
einer Menge von ungefähr 1 bis 10 mg/ml verwendet werden.
9» Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Derivate von Adenin Adenosin, Adeninribosid oder Adeninribotid verwendet werden.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von ungefähr 20 bis 40°u und bei einem pH von ungefähr 5 bis 9 gezüchtet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Adenin oder dessen Derivate dem Kulturmedium zu jedem beliebigen Zeitpunkt während des Züchtens zugesetzt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Uorynebacterium sp. Nr. 3485 ATCC 21084» Arthrobacter sp. Nr. 3486 ATCC 2108b oüer Micrococcus sodonensis ATCC 1^932 verwendet wird.

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