DE1673330A1 - Einrichtung und Verfahren zur Bestimmung einer Aktivitaetszunahme bei Enzymen - Google Patents

Description

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29. November 1967

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zu der Patentanmeldung

MBOMTORIES IETG., Hitt and Swansoti Streets, OIEAWA, Illinois, TJ.S.A.

betreffend

"Einrichtung und Verfahren zur Bestimmung einer Akti-vitätszunahme bei Enzymen"

Die. Erfindung bezieht sich auf ein analytisches lestverfahren und die zugehörige Einrichtung zur BGstimmung einer Aktivitätszunahme bei gewissen Enzymen, die gleichlaufend ist mit der fruchtbaren Periode der Frau.

Seit jeher bestand ein großes Interesse daran, den Zeitabschnitt während dessen die frau fruchtbar, d. h. fähig ißt, iriichkommens-ohaft zu empfangen, vorauszusagen

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und,festzustellen. Dieser empfängnisfähige Zeitabschnitt besteht während der Ovulation, wenn das Ei das Ovarium verlassen hat und in einer Stellung, in der es befruchtet werden kann noch lebensfähig ist.

alle, einerlei ob sie die fruchtbare ™ Periode ausnützen oder sie vermeiden wollen, ist

es selbstverständlich wichtig, diesen Zeitabschnitt vorhersagen und bestimmen zu können. Allerdings weisen die für eine derartige "Vorhersage und Bestimmung bisher verfügbaren. Methoden und Mittel weder den wünschenswerten Grad an Bequemlichkeit noch an Sicherheit auf. Tersuche, den fraglichen Zeitabschnitt unter Bezugnahme auf den Eintritt der Menses zu berechnen sind spekulativ und mit einem Unsicherheitsfaktor befc lastet, da der weibliche Organismus beispielsweise ' beim Menschen zu den verschiedensten und nicht vorhersehbaren Zeiten in die Ovulation eintritt. Aber auch mechanische Methoden, wie die Bestimmung und Aufzeichnung der Körpertemperatur! sind, wenn auch vielleicht genauer, ausgesprochen umständlich und verlangen eine beträchtliche Geschicklichkeit in der Beobachtung und Auswertung der Daten.

Es hat sich gezeigt, daß gewisse im Speichel. (oder in anderen Körpersekreten, s. B. im KaIa- und

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Rachenschleim) auftretende Enzyme während des weiblichen Menstruationszyklus in ihrer Konzentration schwanken; sie haben während des ersten Teiles der fruchtbaren Periode der Frau und zur Zeit der Ovulation eine relativ hohe-Konzentration. Yon besonderem Interesse unter diesen Enzymen sind die alkalische Phosphatase, die Monoesterase und die saure Phosphatase.

Erfindungsgemäß ist eine Üesteinrichtung vorgesehen, die sich verwenden läßt zur Feststellung einer Aktivitätszunahme, bei der alkalischen Phosphatase, die gleichlaufend ist mit der fruchtbaren Perlode der Frau. Die Einrichtung besteht in einem saugfähigen Material, das mit einem nichttoxischen Puffer imprägniert ist, welcher den pH-Wert im alkalischen Bereich zwischen etwa 1o,o und etwa 1o,3 hält, und einem. Indikator der allgemeinen Formel R-O-PO,, worin R ein organisches Radikal ist, dan bei Sprengung der Esterbindung dur-rch die erwähnte alkalische Phosphatase eine Verbindung mit einer leicht erkennbaren Färbung bildet oder entwickelt.

Ferner umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der fruchtbaren Periode der Frau aufgrund eines Nachweises der Anwesenheit einer alkalischen Phosphatane, das dadurch gekennzeichnet' ist, daß map

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eine gewisse Menge des Speichels der betreffenden Frau mit der oben beschriebenen, Testeinrichtung,-in Verbindung bringt. Die Testeinrichtung (z. B. das Testpapier) zeigt einen Farbumschlag während der Zeit der Oyulation und der Fruchtbarkeit der Frau, während sie zu anderen Zeiten keine Farbänderung erleidet.

Als Indikator kann zwar grundsätzlich jede beliebige physiologisch akzeptable organische Verbindung der oben erwähnten allgemeinen Formel, soweit sie entsprechende Eigenschaften aufweist, verwendet .werden, es wurde jedoch gefundenj daß Indoxylphosphat, 5-Bromindoxylphosphat, Phenolphthalein-. phosphat und 3-0-Methylfluorescinphosphat besondere Vorteile aufweisen.

Die Sprengung der Esterbindung in den erwähnten Indoxylverbindungen gibt das (gegebenenfalls substituierte) Indoxylradikal frei und in Anwesenheit von Sauerstoff oder Luft kombinieren sich zwei Indoxylradikale zu Indigo bzw. zu einem substituierten Indigo, der einen dunkelblauen Farbstoff darstellt. Diese Reaktion verläuft normalerweise in kurzer Zeit, etwa in 3o Sekunden bis ungefähr 2 Minuten. Die Farbtiefe

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der gebildetem Blaufärbung hängt von der Menge anwesendem alkalischen Phasphatase ab.

Wenn als Indikator; eine (gegebenenfalls substituierte) Paenolphtlialeinpiiospiiatverbindung ■verwendet wird, wird "bei der Sprengung der 1sterbimdung ein Phenolphthaleinradikal frei, das bei dem durch den Puffer aufrechterhaltenen alkalischen pH-Wert eine matte Rotfärbung entwickelt.

Bei der Sprengung des Pluoresoeinesters wird ein gegelDenenfalls substituiertes Fluorescein frei, das gelb ist* In allen lallen ist die entwickelte erkennbare Parbe prinzipiell abhängig von der Menge der anwesenden alkalischen Phosphatase»

Durch die Anwesenheit von Phosphationen im Speichel und von Ionen, die durch die Sprengung des Indikatorgliedes gebildet wurden, besteht die Gefahr, daß die Wirkung des Enzyms, d· h. der alkalischen Phosphathase, verhindert wird. Es wurde jedoch nun gefunden, daß die Aktivität des Enzyms wesentlich verstärkt werden kann, wenn man in die lesteinrichtung eitle Terbindung einarbeitet, die fähig ist, Phosphat-Ionen aufzunehmen und zu binden, Gegenüber dem Indikator

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und aem Puffer muß diese Verbindung inert sein. Als geeignet haben sich Magnesiumsalze, z» B. das Sulfat und das Chlorid, erwiesen.

Der große Torzug und die Einfachheit dieses oralen bestes ist ohne weiteres ersichtlich. Die Frau braucht nur das Eestpapier mit der Zunge zn befeuchten und ein paar Minuten zu warten um festzustellen, ob an dem Papier eine farbänderung auftritt. Das Resultat ist sehr leicht zu beobachten und es müssen nicht über längere Zeit Daten aufgezeichnet und interpretiert werden. tFeder einzelne !Test ist in sich vollständig. Der Test ist zuverlässig und einfach' und kann ohne große Kosten auf bequeme Art durchgeführt werden.

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Als lestpapier dient vorzugsweise ein saugfähiges Papier, z. B. ein absorbierendes, chemisch reines FiIter^ papier oder dergleichen« Stoffstreif en oder poröse und absorbierende Holzlamellen können ebenfalls verwendet werden. Das festpapier wird mit einer Lösung der aktiven Bestandteile imprägniert und getrocknet, so daß die !lösungsmittel verdunsten und die aktiven Bestandteile auf dem Papier aurtickbleiben.

Wird Indoxylphosphat als Indikator verwendet, so

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kann beispielsweise eine Lösung von 2,8 g Natriumalginat in 1oo ml destilliertem Wasser "bereitet werden. Außerdem werden 5 g Tris-(hydro2rymethyl)-aminomethan, 2 g Natriumcarbonat und 5oo mg Magnesiumsulfat in 1oo ml destilliertem Wasser gelöst und ferner löst man 2 g Indoxylphosphat in 4o ml destilliertem Wasser. .

Die drei lösungen werden zusammengegossen, so daß die Gesamtlösung ein pH von 1o,o bis etwa 1o,3 aufweist. Mit dem Gemisch werden größere Blätter von chemisch reinem Filterpapier imprägniert und an der Luft getrocknet..

Im obigen Ansatz können 5-Brojn-Indoxylphosphat, Phenolphthaleinmono- und -diphosphat und 3-O-Methyl-Fluoresceinphosphat das Indoxylphosphat als Indikator ersetzen. Die Konzentration des Indikator kann innerhalb eines Bereiches von 5oo - 25oo mg variiert werden, je nach der Tiefe der gewünschten Färbung.

Die so hergestellten Testpapiere bzw. Teststreifen wurden in klinischen Untersuchungen verwendet um die Genauigkeit des Testes bei der Bestimmung der Fruchtbarkeit sperio.de zu prüfen, wie sie durch den Farbutn-

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schlag, der durch den weiblichen Speichel hervorgerufen wird, in -Erscheinung tritt. Verglieh-en mit der bisher angewandten Standardmethode, nämlich der (Grundkörpertemperatur-). Wärraeverschiebungsprüfung ergehen die erfindungsgemäßen Teststreifen eine deutliche Übereinstimmung.

Erfindungsgemäß wird demnach ein leicht durchzuführender und sicherer Test und die zugehörige Einrichtung, z. B. ein Testpapier zur Bestimmung der fruchtbaren Periode durch einen einfachen Versuch mit dem Speichel bereitgestellt. Mit Hilfe der oben beschriebenen Teststreifen läßt sich beim Kontakt mit Speichel während der Fruchtbarkeitsperiode eine Aktivitätszunabme der alkalischen Phosphatase dadurch feststellen, daß sich in kurzer Zeit eine leicht erkennbare Färbung entwickelt. Wenn keine merkliche Zunahme der Phosphataseaktivität stattgefunden hat, entwickelt der Teststreifen nicht die leicht feststellbare Färbung beim Kontakt mit Speichel.

Abgesehen von seiner primären Bedeutung für den weiblichen Organismus beim Menschen ist das erfindungsgemäße Verfahren offensichtlich auch anwendbar auf weibliche Tiere und kann für die Tierzuoht von beträchtlicher Wichtigkeit sein.

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Das Anspreoheii der Testeinrichtung kann auch mit anderen verwandten Körperflüssigkeiten demonstriert werden, "besonders mit dem Hals- und Rachenschleim.

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Claims (3)

Patentansprüche

1. Testeinrichtung zur Bestimmung einer Zunahme der Aktivität von alkalischer Phosphatase im Speichel oder anderen Körpersekreten, die gleichlaufend ist mit der Fruchtbarkeitsperiode der Frau, gekennzeichnet durch ein saugfähiges Material, das imprägniert ist mit einem nicht giftigen Puffer, der den- pH-Wert in einem Bereich von etwa lo,o bis etwa lo,3 hält und einem Indikator in Form einer Verbindung der allgemeinen Formel R-O-PO^, worin R ein organisches Radikal ist, das bei Sprengung der Esterbindung durch die alkalische Phosphatase eine Verbindung mit auffallender Färbung bildet.

2. Testeinrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator Indoxylphosphat, 5-Bromindoxylphosphat, 3-0-Methylfluoresceinphosphat, Phenolphthaleinmonophosphat oder Phenolphthaleindiphosphat ist.

3. Verfahren zum Nachweis von alkalischer Phosphatase im Speichel oder.verwandten Körpersekreten, dadurch

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gek ertiizei chne t , daß man das Sekret mit einer Einrichtung nach Anspruch 1 oder Z in Berührung bringt. ■

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