DE2532005A1 - Verfahren zur herstellung von verzuckerten staerkeprodukten - Google Patents
Verfahren zur herstellung von verzuckerten staerkeproduktenInfo
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Description
Verfahren zur Herstellung von verzuckerten Stärkeprodukten
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von verzuckerten Stärkeprodukten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
man ein Stärkehydrolysat mit einer hohen Maltosereinheit der Einwirkung einer Alpha-Amyläse mit einem Verhältnis von maltotriosezersetzender
Aktivität zu dextrinogener Aktivität von o,oo1 bis o,1 unterwirft.
In den verzuckerten Stärkeprodukten ist Maltose der Hauptbestand-
wi rd teil, und durch das erfindungsgemäße Verfahren die Maltosereinheit
der Produkte erhöht, während gleichzeitig ihr Maltotrxosegehalt erniedrigt wird. Die Einwirkung der Alpha-Amylase erfolgt während
der Bezuckerung durch ein maltogenes Enzym oder nach einer derartigen
Verzuckerung. Im folgenden sind alle Angaben über Teile und Prozente, sofern nicht anders angegeben, auf das Gewicht und auf Trockenfestsubstanz
bezogen.
Die in letzter Zeit gemachten Entdeckungen über viele vorteilhafte
Merkmale der Maltose haben zu einer raschen Ausweitung des Maltose-
-2-
Verbrauchs geführt. Daher erhalten verzuckerte Stärkeprodukte mit Maltose als Hauptbestandteil erhöhte Beachtung und werden in immer
stärkerem Ausmaß auf vielen Gebieten, besonders in der Nahrungsmittelverarbeitung
und pharmazeutischen Industrie, benötigt.
Herkömmlicherweise erhält man verzuckerte Stärkehydrolysate mit einer
Maltosereinheit im Bereich von 4o bis 5o%, indem man verflüssigte Stärke der Einwirkung eines maltogenen Enzyms, der Malz-Amyläse,
unterwirft. In neuerer Zeit hat man durch Anwendung von Enzymen, die die Verzweigungen im Stärkemolekül abbauen, und von Beta-Amyläse
verzuckerte Stärkehydrolysate mit einem Maltosegehalt von 5o% oder darüber verhältnismäßig leicht erhalten.
Notwendigerweise bildet sich in reichem Maße in den verzuckerten Stärkehydrolysaten, die aus Stärke mit Hilfe von maltogenen Enzymen
oder mit Hilfe eines maltogenen Enzyms, wie beispielsweise von Beta-Amylase oder einem die Verzweigungen im Stärkemolekül abbauenden
Enyzm, erhalten werden und bei denen Maltose der Hauptbestandteil ist,
Da sich die 'gebildete Maltotriose durch die genannten Enzyme nicht
zersetzen läßt, war das Ausmaß der sog. Mal tose reinheit, insoweit
beschränkt.
Aufgabe der Erfindung ist daher, die Zersetzung oder weitere Umwandlung
der in den Stärkehydrolysaten enthaltenen Maltotriose in Maltose, um dadurch den Maltosegehalt in diesen Hydrolysaten zu
erhöhen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Fähigkeit von Alpha-Amylase,
die bisher als Maltotriosezersetzungsenzym (im folgenden als Maltotriase bezeichnet) praktisch keine Bedeutung besessen hatte,
den Maltotriosegehalt der verzuckerten Stärkehydrolysate zu verringern
und gleichzeitig verzuckerte Stärkeprodukte mit höherer Maltosereinheit zu liefern.Die Tatsache, daß Alpha-Amyläse gegenüber hohen Temperaturen
verhältnismäßig stabil ist, ist bekannt. Ebenso bekannt ist es, daß im allgemeinen Alpha-Amylase leicht höhermolekulare Substrate
angreift, jedoch verhältnismäßig schlecht auf niedermolekulare Substrate, wie beispielsweise Maltotriose, einwirkt und daß dieses Enzym
den Nachteil besitzt, daß es kompetitiv durch Maltose inhibiert wird.
Die Forschung auf dem Gebiet der Alpha-Amylase, die eint Maltotriase-Aktivität
besitzt, sowie der Entwicklung eines Verfahrens zur Gewinnung von verzuckerten Stärkeprodukten mit höherer Maltosereinheit
durch Zersetzung des Maltotriosegehaltes in verzuckerten Stärkehydrolysaten
wurde daher besonders intensiv betrieben.
Dabei wurde gefunden, daß überraschenderweise bei steigendem Maltosegehalt
des Substrates, d.h. des verzuckerten Stärkehydrolysates, die Alpha-Amylase mit einem Verhältnis von Maltotriaseaktivität zu
dextrinogener Aktivität (im folgenden als m/d-Verhältnis bezeichnet)
im Bereich von o,oo1 bis o,1 die in dem Hydrolysat vorhandene Maltotriose unter Erhöhung der Maltosereinheit in immer stärkerem Maße
zersetzt. Alpha-Amylasen mit einem m/d - Verhältnis in dem genannten
Bereich werden von Pilzen der Gattungen Aspergillus, Ehizopus, Penicillium und Oospora erzeugt.
-4-F- U 9 W 2 h f \) W V 1
Bei dem erfindungsgeroäßen Verfahren ist jede Stärke unabhängig von
ihrer Herkunft verwendbar, beispielsweise Stärke aus Getreide, anderen Körnern, Samen , Knollen und Wurzeln; diese Unabhängigkeit
besteht auch in bezug auf das Verhältnis von Amylose zu Amylopektin in der verwendeten Stärke. Um eine verzuckerte Stärkehydrolysatlösung
mit hohem Maltosegehalt zu erhalten, wird die Stärke-aufschlämmung
zunächst gelatiniert oder verflüssigt. Danach wird die Verzuckerung der gelatinierten oder verflüssigten Stärke mit Hilfe
von Beta-Amylase oder einer Kombination von Beta-Amylase und einem
die Verzweigungen im Stärkemolekül abbauenden Enzym durchgeführt.
Als Beta-Amylase können im allgemeinen enzymatische Präparate, wie
solche aus Weizenkleie (vergl. JA-AS 7o-18937), Sojabohnen und Süßkartoffeln,
verwendet werden. Als die Verzweigungen im Stärkemolekül abbauende Enzyme kommen als verwendbar Pullulanase und Isoamylase
in Betracht, die aus einer KuItürlösung eines Mikroorganismus einer
der folgenden Gattungen hergestellt worden sind: Escherichia intermedia ATCC 21o73, Aerobacter aerogenes ATCC 8724, Pseudomonas amyloderamosa
ATCC 21262, Corynebacterium sepedonicum IFO 33o6, Aeromonas
hydrohphyla IFO 382o, Flavobacterium esteroarimaticum IFO 3751,
Vibrio metachnikovii IFO 1o39, Actinoplanes philippinensis ATCC 12427 und Streptospojrangium rose_um ATCC 12428, wie in folgenden
japanischen Auslegeschriften beschrieben: 68-28939, 69-8o7o, 7o-9229,
7O-16788, 71-28151 und 73-18826.
Durch die Verzuckerung werden verzuckerte Stärkehydrolysate erhalten,
in denen der Maltotriosegehalt im allgemeinen etwa 5 bis 25% beträgt, was von der verwendeten Umsetzungsmethode abhängt; die Maltosereinheit
(maltose purity) ist auf etwa 5o bis 93% beschränkt?
Je höher die Maltoserein aes verzuckerten Stärkehydrolysates ist,
umso besser eignen sich die Hydrolysate als Substrate für die Alpha-Amylase
mit einem m/d-Verhältnis von o,oo1 bis o,1. Insbesondere werden günstige Ergebnisse von verzuckerten Stärkehydrolysaten erhalten,
die eine Maltoserein von 80% oder darüber besitzen,
sowie mit Hydrolysaten mit einer Konzentration von 2,ο bis 3o,o%.
Von den Reaktionsbedingungen sind eine Temperatur von 3obis 7o C, ein pH-Wert von 3,ο bis 9,ο sowie eine Zugabe von Alpha-Amylase in
einer Menge von einer bis mehreren Einheiten dextrinogener Aktivität je Gramm verzuckerten Stärkehydrolysats, bezogen auf Trockengehalt,
bevorzugt und die Zugabe der Alpha-Amylase kann entweder während der Verzuckerung des Stärkehydrolysates oder danach erfolgen. Auch
kann die Alpha-Amylase zusammen mit einem maltogenen Enzym oder maltogenen Enzymen auf das verzuckerte Stärkehydrolysat einwirken
gelassen werden oder nach der Verzuckerung des verzuckerten Stärkehydrolysates mit einem maltogenen Enzym oder mit maltogenen Enzymen.
In diesem Zusammenhang ist unter maltogenem Enzym ein Enzym zu verstehen,
das Maltose aus Stärke bildet, jedoch keinen Abfall in der Maltosereinheit verursacht.
Durch den Einsatz der Alpha-Amylase mit dem angegebenen Bereich für
das m/d-Verhältnis wird die in dem verzuckerten Stärkehydrolysat
vorhandene Maltotriose, die eine weitere Erhöhung der Maltosereinheit verhindert, zersetzt, so daß die Maltosereinheit des Endproduktes
beträchtlich verbessert wird.
-6-603824/19831
Die erhaltenen verzuckerten Stärkeprodukte werden anschließend erhitzt, um die Enzyme bzw. das Enzym zu inaktivieren/ filtriert,
mit Aktivkohle entfärbt und mit Ionenaustauschern einer Entionisierung unterworfen.
Sirup, kristalline und pulverförmige Produkte werden in Ausbeuten von 96 bis 99%, bezogen auf das Stärkehydrolysat nach Konzentration,
erhalten.
Die für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität und die quantitative
Zuckerbestinunung angewandten Verfahren werden im folgenden beschrieben.
Ein Gemisch aus 5 ml einer 1%igen (Gewicht zu Volumen) Lösung von löslicher Stärke und 4 ml einer o,1m Acetatpufferlösung vom
pH 5,3 wurden in einem Reagenzglas auf 4o°C vorerhitzt, unter Rühren mit 1 ml einer enzymatischen Lösung versetzt und das Ganze bei 4o C
reagieren gelassen. In Abständen wurden o,5 ml Proben entnommen und durch Zugabe von Anteilen von o,5 ml einer o,oo2 η Jod-JodkaIilösung,
die vorher hergestellt worden war, eingefärbt. Es wurde die Zeit bestimmt, die eine bestimmte Probe benötigte, bis ihre Färbung der
Standardfärbung einer o,1 η Jod-Jodkalilösung entsprach. Als eine Einheit der dextrinogenen Aktivität wurde die Fähigkeit angesehen,
die zu der äquivalenten Färbung n^h 1o-minütiger Umsetzung führte.
zersetzung) :
1o ml einer o,1 m Acetatpufferlösung vom pH 6,ο mit einem Gehalt
von ο,55% ( Gewicht zu Volumen) Maltotriose wurde mit o,5 ml einer
enzymatischen Lösung zersetzt und das Ganze bei 4o C inkubiert. Die Glucosebildung je ml Umsetzungsgemisch wurde gemäß der Glucose-Oxidase-Methode
(J-B. Lloyd und W.J. Whelan:"Anal.Biochem.",
3o, 467 (1969)) bestimmt, und die Enzymmenge, die die Hydrolyse von einem ^umol Maltorio!>ei 4o°C während einer Minute hervorrief, wurde
als eine Maltotriaseeinheit bezeichnet.
Die quantitative Bestimmung und die Berechnung wurden analog ausgeführt,
wie für die Maltotriaseaktivitat beschrieben, mit der Abweichung, daß Maltose durch Maltotriose ersetzt wurde.
Entwickelte Papierchromatogramme, die gemäß der in "Sugar Handbook",
S. 686-6 87, Herausgeber Hamaguchi und Sakurai, Verlag Asakura Shoten Inc., Tokyo, Japan (1964)) beschriebenen Methode erhalten
worden waren, wurden in die einzelnen Bestandteile zerlegt, die quantitativ nach der Anthronmethode bestimmt und in Prozenten ausgedrückt
wurden.
Die Herstellung von Alpha-Amylasen mit dem m/d-Verhältnis von o,oo1
bis o,1 wird im folgenden erläutert. Die Kultivierung eines Mikroorganismus, der Alpha-Amylase erzeugt, wird gewöhnlich durch Aufimpfen
eines Stammes des Mikroorganismus auf ein flüssiges oder festes Kulturmedium durchgeführt, das Kohlenstoff-, Stickstoff- und
anorganische Quellen sowie Spuren von Wachstumsfaktoren enthält
und das durch Erhitzen auf 12o°C während 1o bis 4o Minuten sterilisiert
worden ist« Anschließend wird das Gemisch bei 2o bis 35 C unter stationären Bedingungen oder unter Rühren durch Belüftung
1 bis 7 Tage bebrütet.
Die aus dem Kulturmedium hergestellte Alpha-Amylase enthaltende
Lösung wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren gereinigt. Besonders wenn die Alpha-Amylase in einem Mycel-Endocellular hergestellt wird,
kann sie aus dem Mycel auf bekannte Weise extrahiert werden, beispielsweise
durch Behandeln mit Ultraschall, Einfrieren und Auftauen, Autolyse, durch zellwandzersetzende Enzyme, oberflächenaktive Mittel
oder eine Kombination von mehreren dieser Behandlungsarten. Die auf dfese Weise erhaltene Alpha-Amylase kann so, wie sie ist, verwendet
werden, wenn ihr m/d-Verhältnis im Bereich von o,oo1 bis o,1 liegt.
Ist eine Alpha-Amylase von höherer Reinheit erwünscht, so kann das Enzym durch jede Fraktion^ierungsmethode gereinigt werden, wie beispielsweise
durch thermische Behandlung, pH-Wert Änderung, Aussalzen oder Gelfiltration.
Wenn die Aktivität der Alpha-Amylase außerordentlich gering ist, kann das Enzym konzentriert werden, beispielsweise durch Ausfällen
mit Ammoniumsulfat oder organischen Lösungsmitteln oder durch Eindampfen im Vakuum. Eine im Handel erhältliche Alpha-Amylase mit einem
m/d-Verhältnis in dem angegebenen Bereich kann so, wie sie ist, oder
nötigenfalls nach Reinigung verwendet werden.
Selbst unreine Alpha-Amylase, beispielsweise solche, in der gleichzeitig
Gluco-Amylase oder Alpha-Glucosidase vorkommt, kann so, wie
sie ist, verwendet werden, wenn sie das geforderte m/d-Verhältnis
-9-
im Bereich von ο,οοΐ bis o,1 aufweist und die Verbesserung der Maltosereinheit
nicht wesentlich beeinträchtigt wird. In diesem Falle wird die Verwendung einer Alpha-Amylase mit einem Verhältnis von
Maltotriaseaktivität zu Maltaseaktivität von 2,5 oder darüber bevorzugt
.
Selbst wenn die Alpha-Amylase mit Enzymen verunreinigt ist, die die Verbesserung der Maltosereinheit verhindern, kann die Wirksamkeit
der Amylase dennoch bei gleichzeitigem Vorkommen von Inhibitoren für diese Enzyme, die die Maltosereinheitsverbesserung verhindern,
hinreichend gut sein.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von experimentellen Ergebnissen
näher erläutert.
Versuch 1
Als Sutöirat wurde ein im Handel erhältliches Stärkehydrolysat mit
hoher Maltosereinheit in einer Konzentration von o,2 bis 4o% verwendet.
D ie Ergebnisse, die durch Verzuckerung des Hydrolysates durch Zugabe von Alpha-Amylase in einer Menge von 5o dextrinogenen Aktivitätseinheiten
je Gramm Feststoff bei pH 6,ο und 4o C während 2o h erhalten wurden, 3ind in der Tabelle I zusammengefaßt.
Die Alpha-Amylase wurde wie folgt hergestellt: 15 Teile einer wäßrigen Lösung aus o,1% (Gewicht/Volumen) Amonnitrat, o,1% (Gewicht/
Volumen) Natriumnitrat, o,2% (Gewicht/Volumen) Polypepton, o,1% (Gewicht/Volumen) Dicaliumhydrogenphosphat, o,o5% (Gewicht/Volumen)
Magnesiumsulfat . 7 H2O und o,o5% (Gewicht/Volumen) Kaliumchlorid
wurde mit 1o Teilen Weizenkleie unter gründlichem Verrühren versetzt
- 1ο -
und die erhaltene Mischung wurde 3o Minuten lang bei 12o°C einer Autoklavenbehandlung unterzogen und anschließend als Kulturmedium
verwendet. Anteile dieses Mediums wurden mit je einem der folgenden Pilze beimpft: Aspergillus oryzae IFO 571o, Aspergillus niger IAM
2534, Penicilliun crysogenum IAM 7326, Rhizopus japonicus IFO 4758 und
Oospora aurantia IFO 46o6. Die beimpften Medien wurden 5 Tage lang
bei 27°C bebrütet. Anschließend wurden die Kulturen bei 35°C
zwei Stunden lang extrahiert, nachdem man 1oo Teile Wasser zugesetzt hatte. Danach wurden die Extrakte filtriert und jedes der Filtrate
mit dem zweifachen Volumen kalten Acetons versetzt, um eine Ausfällung zu erzielen. Die Niederschläge, die mit Wasser eluiert wurden, wurden
dialisiert. Die dialisierten Lösungen wurden anschließend zweimal auf Säulen mit DEAE-Zellulose mit einem Gradienten von o,o2 bis o,5
m NaCl aufgebracht, und die Zonen der Alpha-Amylase wurden gesammelt
und nach Aussalzen mit Ammoniumsulfat verwendet.
Malz Alpha-Amylase wurde nach dem Verfahren von S. Schwimmer und
A.K. Balls ( J.Biol.Chem. , V79, 1o63, (1949)) hergestellt.
Die bakterielle verflüssigende Alpha-Amylase, die bakterielle
saccharogene Alpha-Amy läse und die Taka-Amylase A, die in den Versuchen
und Beispielen verwendet wurden, waren kristalline Produkte der Seikagaku Kogyo Co. Ltd. Tokyo/JAPAN.
-11-
| Quelle für Alpha-Amylaee |
kein | », | Taka-Amylaee A, | Mnltotrinse-/ ^r^ IJ η vt vin f\ Ii λ r\ f* |
0.0311 | Stärkeliydrolysat | Zuckerzusammensetzung % | ^Z | ti 3 | Dext | tfirksam- |
| f | kristall | Aktivität^, V ■ .^."fK / Aktivität |
Konzentration, % | ül | 90.5 | 7.4 | 1.7 | ||||
| Zusatz | 0.4 | 91.7 | 5.8 | 1.7 | |||||||
| 0.2 | 0.8 | 93.5 | 3.2 | 1.3 | + | ||||||
| 2.0 | 2.0 | 94.6 | 1.0 | 1.6 | + | ||||||
| 5.0 | 2. 8 | 93. 8 | 1.8 | 1. 5 | + | ||||||
| 10.0* | 2.9 | 94.8 | 0.7 | 1.1 | + | ||||||
| 0.0062 | 10.0 | 3.4 | 94.0 | 0.9 | 1.4 | + | |||||
| Aspergillus oryzae | 15.0 | 3.7 | 93. 2 | 1.2 | 1.4 | + | |||||
| IFO 5710 | 20.0 | 4.2 | 93.0 | 1.3 | 1.3 | + | |||||
| 25.0 | 4.4 | 92.3 | 1.4 | 1.6 | + | ||||||
| 30.0 | 4.7 | 90.8 | 2.2 | 1.7 | + | ||||||
| Λ AHC | 40.0 | 5.3 | 91.6 | 5.8 | 1.6 | ||||||
| U. 0143 | 0.2 | 1.0 | 93.0 | 2.9 | 1.4 | + | |||||
| Aepergillua nvRer | 2.0 | 2.7 | 94. 1 | 1.3 | 1.6 | + ' | |||||
| IAM 2534 | 10.0 | 3.0 | 93. 5 | 1.0 | 1.6 | + | |||||
| 20.0 | 3.9 | 92.3 | 1.3 | 1.6 | + | ||||||
| 30.0 | 4.8 | 90.3 | 2.2 | 1.7 | + | ||||||
| 0. 0139 | 40.0 | 5.8 | 91.7 | 5.8 | 1.7 | ± | |||||
| Penicillium crysoßenum | 0.2 | 0.8 | 93.5 | 3.1 | 1.4 | + | |||||
| IAM 7326 | 2.0 | 2.0 | 94.4 | 1.8 | 1.2 | + | |||||
| 10.0 | 2.6 | 93.0 | 2.6 | 1.4 | + | ||||||
| 20.0 | 3.0 | 92.2 | 3.4 | 1.4 | + | ||||||
| 30.0 | 3.0 | 91.2 | 3.7 | 1.6 | + | ||||||
| 40.0 | 3.5 | 91.3 | 6.0 | 1. 5 | |||||||
| 0.2 | 1.2 | 94.8 | 0.9 | 1. 1 | + | ||||||
| 10.0 | 3.2 | 93. 3 | 1.3 | 1.6 | + | ||||||
| 20.0 | 3.8 | + |
| Tabelle I . — | - Fortsetzung | Zuckerzusaininensetzung % 1 | iirksam- ;eit |
* | I | |
| Quelle für Alpha A mylase |
Maltotriasc S Vktivität^/ DextrinoRcrc / Aktivität |
Stärke hydrolysat Konzentration, % |
Gl G£ G3 Dcxt | \ | ||
| RhizopuB j.iponicus IFO 47 58 |
0.0048 | 5 10 20 |
3.4 93.0 1.9 1.7 3.6 "94.5 0.8 1.1 4.8 93.3 0.6 1.3 |
■ + | ||
| Ooepora aurantia | 0.0157 | 5 10 20 |
2.1 94.4 2.1 1.4 3.2 93.9 1.4 1.5 3.5 93.8 1.5 1.2 |
1+1+1+1+1+1+ | ||
| IFO 4606 .. · | 0.0001 | 0.2 2.0 10.0 20.0 30.0 40.0 |
0.4 90.3 7.6 1.7 0.5 90.8 6.7 2.0 0.9 90.9 6.8 1.4 0.7 90.7 6.6 2.0 0.8 89.9 7.4 1.9 0.4 90.7 6.8 2.1 |
|||
| Bakterielle verflüssig c e/alpha-Amylase, kristall |
0.5580 | 0.2 2.0 10.0 20.0 30.0 40.0 |
73.7 23.5 1.3 1.5 77.0 20.1 1.0 1.9 68.6 28.7 0.8 1.9 64.4 31.7 1.5 2.4 64.5 29.6 2.3 3.6 60.3 32.0 3.0 4.7 |
|||
| Bakterielle saccharogen alpha-Α mylase, kristall |
0.00047 | 5.0 10.0 20.0 |
0.9 90.6 6.8 1.7 1.2 90.7 6.7 1.4 1.4 90.6 6.3 1.7 |
|||
| MaIzA lpha-Aiiylaee |
+) Die Menge an verwendetem Enzym betrug 1o Einheiten je Gramm festen Stärkehydrolysats
Anmerkung: In der Tabelle und in der beschreibung bleuten G., Glucose, G„ Maltose, G3 Maltotriose, Dext.
Dextrine mit einem Molekulargewicht, das gleich dem oder höher als das von Maltotetraose ist
+ als wirksam bestimmt, + schwierig bestimmbar durch die Zuckerzusammensetzung und - als
ungünstig bestimmt.
Dextrine mit einem Molekulargewicht, das gleich dem oder höher als das von Maltotetraose ist
+ als wirksam bestimmt, + schwierig bestimmbar durch die Zuckerzusammensetzung und - als
ungünstig bestimmt.
N) cn CJ Ni
O O
Wie aus der Tabelle I hervorgeht, wurde bei Verwendung von bakterieller,
verflüssigender Alpha-Amyläse mit einem m/d-Verhältnis von
unter o,oo1, bakterielle saccharogene Alpha-Amylase mit einem
m/d-Verhältnis von o,558o oder Malz-Alpha-Amylase mit einem m/d-Verhältnis
von o,ooo47 keine Erhöhung der Maltosereinheit über das Ausmaß erzielt, das bereits im Stärkehydrolysat vorhanden war. Insbesondere
wurde bei Verwendung von bakterieller saccharogener Alpha-Amylase eine beträchtliche Verminderung der Maltosereinheit erzielt.
Im Gegensatz dazu wurde bei Verwendung von handelsüblicher Taka-Amylase
A (m/d-Verhältnis o,o311) sowie solcher Alpha-Amylase mit einem m/d-Verhältnis von über o,oo1, jedoch geringer als o,1 und
den Alpha-Amylasen, die von Aspsrgillus oryzae (m/d-Verhältnis
o,oo62), Aspergillus niger (o,o145), Penicillium crysogenum (o,o139),
Rhizopus japonicus (o,oo48) oder Oospora aurantia (o,o157) erhalten
waren, eine beträchtlich Erhöhung der Maltosereinheit in den verzuckerten Stärkeprodukten, die durch Einwirkung der Enzyme auf Stärkehydrolysat
erhalten worden waren, erzielt.
Vergleichsversuche, die unter Verwendung einer Alpha-Amylase mit einem m/d-Verhältnis im Bereich von o,oo1 bis o,1 durchgeführt wurden,
ergaben, daß Stärkehydrolysate mit Konzentrationen von o,2 und 4o% nur eine geringe Neigung zeigten, die Maltosereinheit verbessern zu
lassen. Weiter wurde gefunden, daß in den Fällen, in denen die Konzentrationen des Stärkehydrolysates sich im Bereich von 2,ο bis 3o,o%
bewegte, die Maltotriose hauptsächlich zersetzt und eine beträchtliche Erhöhung der Maltosereinheit erzielt wurde.
-14-
K U 3 ö 2 i /U 8 m
Ve rs uch 2
Die im Versuch 1 verwendete Taka-Amylase A wurde in Mengen von 5o Einheiten
dextrinogener Aktivität des Enzyms je Gramm Stärkehydrolysat Feststoff 1o%igen wäßrigen Lösungen von Stärkehydrolysaten mit unterschiedlichen
Zuckerzusammensetzungen zugesetzt, worauf die Gemische
bei pH 6,o und 45°C 24 Stunden lang umgesetzt wurde, um die Wirkungen
der Enzyme zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
| f Zuckerzusammensetzung 9· |
G2 | 74.0 | G5 1 Dext | 35.1 | Zusatz | Gl | G2 | G3 | Dext | Maltose _ bildung >"* |
| kein Zusatz | 7.0 43.0 | 31 · 3 | 14.3 | 31.2 | 9.3 | 45.7 | 12.6 | 32.4 | 18.9 | |
| Gl | 2.3 ; 52.0 | 67.9 | 14.0 | 11.0 | 6.7 | 55.1 | 11.5 | 26.7 | 22.1 | |
| 1.5 | 0.4 j 92.5 | 13.5 | 8.8 | 4.5 | 77.0 | 9.5 | 9.0 | 22.2 | ||
| 1.3 | 0.4 [94.5 | 8.1 | 3.7 | 3.2 | 85.1 | 4.3 | 7.4 | 40.7 , | ||
| 0.9 | 7.5 | 2.0 | 3.4 | 91.6 | 1.9 | 3.1 | 49.3 | |||
| 5.1 | 1.0 | 2.3 | 95.5 | 1.1 | 1.1 | 58.8 | ||||
| 4.1 | 1.6 | 96.7 | 0.8 | 0.9 | 53.7 |
Anm. :
+ Maltosebildung, %
_fG2-Gehalt nach Umsetzung minus G2-Gehalt vor Umsetzung). 1oo
G3 - Gehalt vor Umsetzung
609824/0891
Aus den Ergebnissen der Tabelle II geht hervor, daß, je höher die Maltosereinheit in dem Stärkehydrolysat ist, umso stärker die
Zersetzung der in dem Hydrolysat enthaltenen Maltotriose durch die Taka-Amyläse unter weiterer Erhöhung der Maltosereinheit ist. Insbesondere
führt die Verwendung eines Substrates mit einer Zuckerzusamnensetzung,
in der die Maltose einen Anteil von über 8o% ausmacht, zu einer höheren Umwandlung von Maltotriose in Maltose.
Diese Tatsache war vom bisherigen Wissensstand aus völlig unvorhersehbar, da man bisher geglaubt hatte, daß die Wirkung von Alpha-Amylase
durch Maltose kompetitiv inhibiert wird.
Die Erfindung wird im folgenden weiter anhand der folgenden Beispiele
erläutert, die bevorzugte Durchführungsformen des erfindungsgemäßen
Verfahrens beschreiben.
Ein Teil Kartoffelstärke wurde 1o Teilen Wasser,die eine Einheit
bakterieller, verflüssigende Alpha-Amylase je Gramm Stärke enthielten,
unter Rühren zugemischt und das Gemisch wurde auf pH 6,o
eingestellt. Die Suspension wurde anschließend auf 9o°C erhitzt, um Gelatinierung und Verflüssigung zu erzielen, und anschließend
sofort auf eine Temperatur von 13o C erhitzt, bei der sie 5 Minuten gehalten wurde. Danach wurde das erhaltene Produkt rasch auf 5o° C
abgekühlt und nach Zugabe von je 2o Einheiten eines die Verzweigungen im Stärkemolekül abbauenden Enzyms, das aus einer Kulturlösung
von Escherichia intermedia ATCC 21o73 erhalten worden war, sowie einer Sojabohnen-Beta-Amylase (Product Nr. 15oo der Nagase
& Co. Ltd. Osaka, Japan) je Gramm Stärke bei einer Temperatur von 5b C über 46 Stunden der Verzuckerung unterzogen, während der der
pH-Wert bei 6,ο gehaltaiwurde. Das erhaltene Produkt wurde als
6 U y « 2 U f U 8 9 1
-16-
Hydrolysat A bezeichnet.
Das 24 Stunden nach Beginn der Verzuckerung gesammelte Hydrolysat und das inaktivierte 46 Stunden lang verzuckerte Hydrolysat wurden
als Hydrolysate B bzw. C bezeichnet. Die Hydrolysate B und C wurden nach Zugabe von jeweils 1oo Einheiten dextrinogener Aktivität einer
Taka-Amylase A {Handelsprodukt der Seikagaku Kogyo Co. Ltd),die aus
Aspergillus oryzae hergestellt war und ein m/d-Verhältnis von o,o311
aufwies, weitere 22 Stunden weiter verzuckert und die dabei erhaltenen Produkte wurden als b und c bezeichnet. Die Ergebnisse sind in
der folgenden Tabelle III zusammengefaßt
| \ | \ | Zuckerzusammensetzung, % | G2 | G3 | Dext |
| G1 | 91,5 | 5,2 | 2,7 | ||
| (A) | o,6 | 96,ο | o,3 | 1,o | |
| (b) | 2,7 | 95,1 | o,5 | 1,7 | |
| (C) | 2,7 | ||||
Die Zuckerzusammensetzung des nach 24-stündiger Verzuckerung erhaltenen
Stärkehydrolysates betrug o,2% Glucose, 9o,3% Maltose,
4,9% Maltotriose und 4,6% Dextrine.
Die erhaltenen verzuckerten Stärkeprodukte A,b und c wurden zur
Inaktivierung der Enzyme erhitzt, mit Aktivkohle entfärbt, mit Hilfe eines Ionenaustauschers entionisiert und anschließend unter
vermindertem Druck eingedampft. Die Ausbeuten betrugen jeweils 97%, bezogen auf feste Stärke. Danach wurden die Produkte kristallisiert
und im Hinblick auf Kristallform, Größe und Aussehen sowie auf die
Zeit, die für die Zentrifugierung von der Mutterlauge erforderlich war, ( Zentrifugierungszeit ) und schließlich hinsichtlich der Ausbeute
( Gesamtausbeute der 1. und 2. Kristallisation ) verglichen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle IV zusammengefaßt.
Kristallform, Zentrifugierungs- Ausbeute an krist. -größe und -aussehen zeit Maltose, %
(C)
gut
ausgezeichnet
ausgezeichnet
ausgezeichnet
1oo
37
42
37
42
35,ο 71,4 67,7
Wie sich aus der Tabelle IV ergibt, zeigt sich die deutliche Wirksamkeit
der Taka-Amylase mit einem m/d-Verhältnis von o,o311 vollständig
darin, daß die Maltosereinheit der erhaltenen verzuckerten Stärkeprodukte beträchtlich erhöht wurden, ob nun die Alpha-Amyläse
so zugesetzt wurde, daß sie während der Verzuckerungsstufe einwirken konnte, oder erst nach Beendigung der Verzuckerung. Außerdem geht aus
ö';r Tabelle IV hervor, daß die Verwendung vor. Taka-Amylase A die
BUy» 24/0891 ~18~
Zentrifugierungszeit auf etwa die Hälfte bis ein Drittel senkt und
die Ausbeute an kristalliner Maltose etwa verdoppelt. Wegen der Verkürzung der Verzuckerungszeit wird die Alpha-Amylase vorzugsweise
gemeinsam mit anderen Enzymen einwirken gelassen.
Anteile des StärkehydroIysates gemäß Beispiel 1, das nach 24-stündiger
Verzuckerung erhalten worden war, ( Hydrolysat B ) wurden jeweils mit 5o Einheiten dextrinogener Aktivität Alpha-Amylase,
hergestellt gemäß Versuch 1, je Gramm Stärkehydrolysat versetzt und analog Beispiel 1 der weiteren Verzuckerung unterworfen.
Die Zuckerzusammensetzung der auf diese Weise erhaltenen Produkte
ist in der folgenden Tabelle V angegeben.
| Quelle für Alpha-Amylase |
toltotriase-/aextrinogene Aktivität X Aktivität |
ZuckerZusammen setzung, % |
G1 | G2 | G3 ] | Dext |
| o,6 | 91,5 | 5,2 | 2,7 | |||
| [kein Zusatz | o,o311 | 2,4 | 95,3 | o,8 | 1,5 | |
| Taka-Amyläse A(krist) | O,oo62 | 2,4 | 95,ο | o,9 | 1,7 | |
| Aspergillus oryzae IFO 571o |
O,o145 | 3,6 | 93,9 | o,8 | 1,7 | |
| Aspergillus niger IAM 2534 |
o,o139 | 3,4 | 93,9 | o,9 | 1,8 | |
| Penicillium crysogenum IAM 7326 |
o,oo48 | 5,o | 92,9 | o,7 | 1,4 | |
| hizopus japonicus IFO 4758 |
o,o157 | 2,6 | 94,5 | 1,1 | 1,8 | |
| Oospora aurantia IFO 46o6 |
BU9824/0891
-19-
Die durch Ausführung von Reinigung und Konzentrierung analog Beispiel
1 erhaltenen Konzentrate wurden in einer Ausbeute von etwa 97%, bezogen auf die eingesetzte Stärke, gewonnen. Die Konzentrate
wurden anschließend kristallisiert und im Hinblick auf Kristallform, Größe und Aussehen sowie in bezug auf die Maltoseausbeute
(Gesamtausbeute der 1. und 2. Kristallisation) untersucht. Die Ergebnisse
sind in der folgenden Tabelle VI zusammengefaßt.
| Quelle für Alpha-Amy- lase |
Maltotriase- Ak tivitat/ dextrino— gene Aktivi tät |
Kristall form, -größe u.-aussehen |
Zentrifu- gierzeit |
Ausbeute an kristalliner Maltose, % |
| kein Zusatz | gut | 1oo | 35,ο | |
| Γ ak a-Amy läse A (krist) |
o,o311 | ausgezeichnet | 37 | 7o,6 |
| Aspergillus oryzae IFO 571o |
o,oo62 | ausgezeichnet | 4o | 71,3 |
| Aspergillus higer IAM 2534 |
o,o145 | ausgezeichnet | 42 | 66,3 |
| Pen i ei Hi um crysogenum IAM 7326 |
o,o139 | ausgezeichnet | 4o | 69,5 |
| Rhizopus japonicus IFO 4758 |
o,oo48 | aus ge ze i chne t | 43 | 64,8 |
| Oospora aurantia IFO 46o6 |
o,o157 | ausgezeichnet | 39 | 68,ο |
M/0891
-2o-
- 2ο -
Die Ergebnisse der Tabile VI zeigen wiederum die Wirksamkeit der Verwendung von Alpha-Amyläse mit einem m/d-Verhältnis von 0,001
bis o,1, indem eine deutliche Verbesserung der Maltosereinheit sowie eine Verminderung der Zentrifugierzeit und eine annähernde Verdoppelung
der Maltoseausbeute erhalten wurden. Die auf diese Weise erhaltene kristalline Maltose eignet sich zur Injektion.
Ein Teil Maisstärke wurde mit vier Teilen Wasser, die zwei Einheiten bakterieller, verflüssigender Alpha -Amylase je Gramm
Stärke enthielten, versetzt und die Suspension wurde auf pH 6,0 eingestellt. Anschließend wurde sie auf 9o C erhitzt, um gleichzeitige
Gelatinierung und Verflüssigung zu erzielen, und das erhaltene Produkt wurde 1o Minuten bei einer Temperatur von 12o°C
gehalten. Danach wurde auf 5o C abgekühlt und mit jeweils 1o Einheiten
einer aus Pseudomonas amyloderamosa ATCC 21262 hergestellten Isoamylase
sowie 1o Einheiten aus Weizenkleie erhaltener Beta-Amylase je Gramm feste Stärke versetzt und HS Stunden bei Einhaltung eines
pH-Wertes von 5,ο und einer Temperatur von 5o°C verzuckert. Danach
wurde die Umsetzung durch Erhitzen des erhaltenen Stärkehydrolysates auf 7o C unterbrochen. Die Zuckerzusammensetzung des Produktes, das
nach Verzuckerung des Hydrolysates bei 5o°C, einem pH-Wert von 6/O
während 24 Stunden unter Verwendung der gleichen Taka-Amylase A wie in Versuch 1 erhalten worden war, ist in der folgenden Tabelle
VII angegeben.
-21-
| Taka-Amyläse | A | 1 | G1 | G | 2 | G | 3 | De xt | 8 |
| kein Zusatz | 3 | ,3 | 81 | ,8 | 8 | ,1 | 8, | 3 | |
| Zusatz | ,3 | 85 | ,2 | 4 | ,2 | 7, | |||
Die mit Taka-Amylase A behandelten verzuckerten Stärkeprodukte
wurden analog gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben, und anschließend bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 1o% konzentriert.
Verfestigung und Vermählen des Produktes, das nach Animpfen erhalten wurde, gingen leicht vonstatten, und das erhaltene vermahlene
Produkt fiel in einer Ausbeute von etwa 96%, bezogen auf die eingesetzte Stärke, an.
Ein Anteil der mit Taka-Amylase A behandelten verzuckerten Stärkeprodukte
wurde analog den Vorschriften von Beispiel 3 gereinigt, anschließend bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 25% konzentriert,
mit Maltoseimpfkristallen zur Auslösung der Kristallisation versetzt und zu einer Füllmasse verarbeitet, die sprühgetrocknet
wurde. Das kristalline pulverige Produkt wurde in einer Ausbeute von etwa 97%, bezogen auf eingesetzte Stärke, erhalten. Im Vergleich
mit dem ohne Verwendung von Taka-Amylase A hergestellten Hydrolysat besaß das Produkt weit bessere Kristallpulvereigenschaften und war
in vieler Hinsicht als Handelsprodukt überlegen.
Claims (1)
- PatentansprücheVerfahren zur Herstellung von verzuckerten Stärkeprodukten, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Stärkehydrolysat mit hoher Maltosereinheit der Einwirkung einer Alpha-Amylase mit einem Verhältnis von maltotriosezersetzender Aktivität zu dextrlnogener Aktivität von o,oo1 bis o,1 unterwirft.2, Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,daß man als Stärkehydrolysat ein Hydrolysat mit einer Maltosereinheit von 8o% oder höher verwendet.3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alpha-Aaryläse ein von Pilzen erzeugtes Enzym verwendet.
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