DE888918C

DE888918C - Verfahren zur Gewinnung eines antibiotischen Wirkstoffes

Info

Publication number: DE888918C
Application number: DEF7012A
Authority: DE
Inventors: Hans Dr Brockmann
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1951-08-22
Filing date: 1951-08-22
Publication date: 1953-09-07

Description

Verfahren zur Gewinnung eines antibiotischen Wirkstoffes Die Erfindung hat die Gewinnung eines neuen Antibiotieums, Resistomycin, zum Gegenstand. Dieses neue Antibioticum. ist wegen seiner bakterlostatischen Wirksamkeit wertvoll und hat nach den Ergebnissen der Analyse wahrscheinlich die Zusammensetzung C2,H"06. Wegen seiner außerordentlichen Stabilität erhält das Produkt die Bezeichnung Resistomycin. Resistomycin kristallisiert in safrangelben balkenförmigen Nadeln, die sich bei etwa 315' ohne zu schmelzen zersetzen, und ist in Wasser bei pa7 schwer löslich, jedoch in Äther, Dioxan, Benzol, Äthanol, Methanol, Aceton mit gelber Farbe, in Natronlauge mit orangeroter Farbe löslich. Die alkoholische Lösung fluoresziert im ultravioletten Licht intensiv gelb, die acetonische und benzolische Lösung hellrot. Löst man ResistomycÜi in konzentrierter Schwefelsäure, so erhält man eine intensiv gelbgrün fluoreszierende Lösung. Resistomycin sublimiert im Hochvakuum (io-'Torr) unzersetzt bei 2oo bis 2o5'.
Resistomycin ist außergewöhnlich stabil gegen Säuren und Alkalien. Man kann aus der Lösung in konzentrierter Schwefelsäure, die 2 Stunden auf i2o' erhitzt worden ist, unverändertes Resistomycin zurückgewinnen, ebenso aus einer 7 Stunden unter Stickstoff auf go' erwärmten Lösung in 2 n-Kahlauge. Resistomycin läßt sich i Stunde lang auf 25o' erhitzen, ohne daß die chemischen und biologischen Eigenschaften sich ändern.
Die Konstitution des Resistomycins ist zur Zeit noch nicht bekannt. Resistomycin wird von Streptomyces resistomycificus gebildet und kann aus den Kulturen, insbesondere aus dem Mycel dieses Mikroorganismus gewonnen werden.
Streptomyces resistomycificus wurde aus einer Erdprobe isoliert. Er wächst nicht auf Gelatine und Czapek-Agar. Auf Fleischwasser und Pepton beobachtet man ein dichtes, aber sehr feines, glattes Wachstum mit unversportem, farblosem Iviycel. Kultiviert man den Stamm auf Glycerin-Pepton, so zeigt er gutes Wachstum mit dichtem, körnigem, hell olivbrännlichem Mycel, das kaum versport ist. . Auf der Kartoffelscheibe erkennt man ein gutes, feinkörniges Wachstum mit einem mittel- bis dunkelbrannen, schwach bräunlichgrau versportem Mycel und am Rande der Kolonien eine dunkelbranne Zone, Lackmusmilch-Agar wird rötlich gefärbt, jedoch nicht geklärt; die Kolonien auf diesem Nährmedium sind groß, strahlig gefurcht und gut versport. Auf Lackmusmilch selbst erhält man ein gutes, derbes, stark gekräuseltes, schwarzbraunes, sehr gut versportes Mycel, jedoch wie auf Lackmusmilch-Agar keine Klärung der Milch. Verwendet man Stärke und Glykokoll als Nährboden, so ergeben sich mittelgroße, flache Kolonien und gut grauweiß versportes Mycel. Mit Lugolscher Lösung erhält man auf diesen Platten eine große Zone mit rötviolettem, schmalem Rand. Die Stärke wird, wie auch ein Parallelversuch mit Stärke und Kaliumnitrat als Nährmischung zeigte, hydrolysiert. Auf Cellulose-Agar beobachtet man ein kümmerliches Wachstum, Nitrat wird nicht reduziert, Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet. Auf Vollmilch als Nährmedium erkennt man auf der Fettschicht ein gutes, derbes Wachstum mit unversportem, hellbraunem Mycel; die Milch wird nicht geklärt. Auf Magermilch kultiviert, zeigt der Stamm ebenfalls gutes, hellbraunes Wachstum, ohne Klärung der Milch. Auf Fleischwasser-Glucose wächst der Stamm unversport in Form eines farblosen, glänzenden Mycels.
Streptomyces resistomycifieus kann wegen seiner Pigmentbildung nur in der Albusgruppe von B ergeys »Manual of Determinative Baceteriology« 6th Edition untergebracht werden oder in der Gruppe E i (Chromogenic Types), Von den in diesen Gruppen beschriebenen Arten kommen nur Streptomyces albus und Streptomyces antibioticus als Verwandte in Frage. Die Unterschiede zu beiden sind jedoch zu stark, um den Streptomyces resistomycifieus in eine der beiden Species einzuordnen. Streptomyces resistomycifie-Lis stellt daher eine neue Species dar.

Vergleich des Streptomyces resistomycificus mit Streptorayces albus und Streptomyces antibioticus.

Streptomyces Streptomyces Streptomyces

resistomycificus albus antibiotieus

Lösliches Pigment braun - tiefbraun Pigment anfänglich braun, später Pigment tiefbraun

verschwindend

Gelatine: kein Wachstum Gelatine: Wachstum und Verflüssi- Gelatine: dunkelbraunes Wachstum,

gung an der Oberfläche mit braunem

Luftmycel, starke Verflüssigung

Stärke wird hydrolysiert Stärke wird nicht hydrolysiert

Nitrat wird nicht reduziert Nitrat wird reduziert

Czapek: kein Wachstum Czapek: dünnes Wachstum, dünnes

graues Luftmycel

Kartoffelscheibe: dunkelbraunes Kartoffelscheibe: Kolonie und Luft- Kartoffelscheibe: Wachstum gefal-

Wachstum, schwach bräunlich- mycel weiß tet, braun mit dünnem schwarzem

graues Luftmycel, schmale dunkel- Ring in bläulich übergehend, kein

braune Zone Luftmycel

Milch: koaguliert, nicht geklärt Milch: koaguliert und geklärt Milch: nicht koaguliert, nicht ge-

klärt

Sporenbildung in langen, nicht in Sporen in aufgerollten Ketten, an Sporenketten in Büscheln, Sporen

Bündeln stehenden Ketten, Sporen Seitenzweigen, ellipsoidisch kugelig bis schwach ellipsoidisch

ellipsoidisch

Zur Gewinnung von Resistomycin wird ein geeigneter Nährboden mit Streptomyces resistomycificus beimpft und für einige Tage unter airoben Bedingungen bei schwach erhöhten Temperaturen, vorzugsweise bei etwa 3o', bebrütet. Nach der Bebrütung findet man Resistomycin in dem gebildeten Mycel, das Kulturfiltrat zeigt im allgemeinen nur eine schwache antibiotische Wirksamkeit. Für die Gewinnung von Resistomycin ist -ein Nährmedium geeignet, das beispielsweise folgende Zusammensetzung hat: 2 0/0 Glycerin, 0,25 0/, Glykokoll, o,i % Natriumchlorid, o,i 0/, Dikaliumhydrogenphosphat, o,oi 0,/, Ferrosulfat, o,oi 0!'. Magnesiumsulfat, o,5 0/, Hefekochsaft, Spuren Calciumcarbonat.

Mit Erfolg können auch andere Nährmedien benutzt werden, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und ein stickstoffhaltiges Material neben den übrigen Nährstoffen, insbesondere Salzen, enthalten, Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kommen unter anderem Kohlenhydrate, wie Stärke, Glykogen, Glykose, oder mehrwertige Alkohole, wie Glycerin und Sorbit, in Frage. Geeignete stickstoffhaltige Materialien sind: Pepton, Glykokoll, Melasse, Maisquell-,vasser, Milchproteine, hydrolysiertes Kasein, Sojabohnenmehl, Kaliumnitrat. Die Züchtung des Mikroorganismus kann sowohl im Oberflächenverfahren wie auch im submersen Verfahren unter Zuführung von Sauerstoff bzw. Luft erfolgen. In beiden Fällen erhält man ein bräunlichgrau bis schwarzbraun gefärbtes Mycel, das von der Kulturflüssigkeit durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt werden kann.
Aus dem Mycel kann Resistomycin durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln gewonnen werden. Insbesondere sind Äther und niedere Ketone hierfür geeignet, doch ist die Extraktion auch mit Alkoholen und anderen organischen Lösungsmitteln möglich. Es ist zweckmäßig, das Mycel vor der Extraktion zu trocknen und einer Vorextraktion mit Kohlenwasserstoff, wie Petroläther u. dgl., zu unterwerfen, durch die fettlösliche Begleitstoffe beseitigt werden.
Die Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln ist pli-abhängig. Unterhalb von pa 8,?, kann Resistomycin durch wäßrige Lösungen nicht aus Äther extrahiert werden. Schüttelt man jedoch die Ätherlösung mit Pufferlösungen, deren p,1 zwischen 8,2 und 12 liegt, so verteilt sich das Resistomycin auf beide Phasen. Der Verteilungskoeffizient ist vom pH der wäßrigen Phase abhängig. Oberhalb von'pil 12 geht Resistomycin aus seiner ätherischen Lösung vollständig in wäßrige Pufferlösungen über. Von dieser pE-Abhängigkeit der Löslichkeit in Äther kann bei der Reindarstellung mit Vorteil Gebrauch gemacht werden.
Aus den Extrakten, die das Resistomycin enthalten, läßt sich dieses durch Adsorptionsmethoden in geeigneter Form gewinnen. Es ist zweckmäßig, die Adsorption in Form einer Chromatographie durchzuführen. Als Adsorptionsmittel kommt insbesondere Gips, Aluminiumoxyd oder Kieselsäure in Betracht. Durch Eindampfen der Eluate kann Resistomycin zur Kristallisation gebracht werden.
Kristallisiertes Resistomycin hemmt das Wachstum von Staphylococcus aureus in einer Verdünnung von :[ : io ooo ooo bis i : 2o ooo ooo, von Bacillus subtilis in einer Verdünnung von i: 2ooooooo bis 1: 40000000 und von Mycobacterium Auberculosis in einer Verdünnung von i: 5ooooo. Beispiel i Man bereitet ein Nährmedium folgender Zusammensetzung in Leitungswasser: 2 l)/, Glycerin, o,?,5 0/, Glykokoll, o,i 0/, Natriumehlorid, o,i 0/, Dikahumhydrogenphosphat, o,oi 0/, Ferrosulfat, o,oi l)/, Magnesiumsulfat, 0,5 01, Hefekochsaft, Spur Calciumcarbonat.
Zur Herstellung des Hefekochsaftes wird i Gewichtsteil Hefe, in io Gewichtsteilen Wasser suspendiert, i Stunde bei 3o' stehengelassen; dann wird die Mischung unter Druck auf 15o' erhitzt. Man dekantiert dann vom Bodensatz ab, der verworfen wird.
Geeignete Glasgefäße, z. B. Erlenmeyer, werden dann mit diesem Nährmedium etwa 2 cm hoch gefüllt. Nach dem Sterilisieren werden diese Gefäße mit Streptomyces resistomycificus beimpft. Dazu geht man von gut versporten Schrägröhrchenkulturen aus, die sich durch Bräunung des Agars auszeichnen. Man läßt die Gefäße dann etwa 3 Wochen bei 27' stehen. Die Kulturflüssigkeit färbt sich bereits nach etwa 5 Tagen brännlich und wird gegen Ende. tief dunkelbraun. Sie enthält nur Spuren des Antibioticums.
Das Mycel ist schmutzig gelbbräunlich gefärbt und wird durch ein Koliertuch abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Das gewaschene Mycel wird dann getrocknet und gemahlen.
Das Mahlgut wird sodann 12 Stunden mit Petroläther im Soxhlet extrahiert. Dabei gehen Lipoide und ähnliche Zellsubstanzen in Lösung, während das Resistomycin fast vollständig im Mycel verbleibt. Dieses wird nun erschöpfend mit Äther extrahiert. Der Ätherextrakt wird abgedampft und der Rückstand in trocknem Aceton aufgenommen. Die Acetonlösung, die orange gefärbt ist und schwach fluoresziert, wird durch eine Calciumsulfatsäule filtriert. Dabei bildet sich unterhalb kleiner gelber und roter Zonen eine einheitliche große gelbe Zone aus. Diese Zone enthält das Resistomycin, das mit Aceton eluiert wird.
Das Eluat wird nochmals filtriert und eingeengt. Dabei kristallisiert Resistomycin in safrangelben balkenförmigen Nadeln aus, die durch zweimalige Umkristallisation aus Dioxan rein gewonnen werden.
Bei der Analyse wurde folgende Zusammensetzung gefunden: 70,76 0/0 C, 4,610/, H, frei von Stickstoff, Schwefel und, Halogen. Für die Formel C2,111.0. berechnen sich 7o,760/OC und 4,650/,H. Beispiel 2 500 1 eines Nährmediums, der in Beispiel i angegebenen Zusammensetzung von p#I 6,8 wurden mit etwa 1: 1 einer Vorkultur von Streptomyces resistomycificus, die in Schüttelkölbehen hergestellt wurde, unter sterilen Bedingungen beimpft. Danach wurde die Nährlösung unter Belüftung 140 Stunden lang bei 30' gerührt. Da färbte sich die Lösung dunkelbraun, während sich ein braunschwarzes Pilzinycel bildete. Nach einer Incubationszeit von 1:40 Stunden wurde der Versuch abgebrochen und das Pilzmycel durch ein Beutelfilter abfiltriert. So wurden 2o kg feuchtes Mycel gewonnen, die 2,6 kg lufttrockenes Mycel lieferten. Die weitere Aufarbeitung erfolgt nach dem in Beispiel i angegebenen Verfahren und liefert io g kristallisiertes Resistomycin.

Claims

PATENTANSPROCHE- i. Verfahren zur Gewinnung eines antibiotischen Wirkstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces resistomycificus in einem Nährmedium züchtet und aus der entstandenen Kultur, vorzugsweise aus dem abgetrennten Mycel, das Resistomycin gewinnt. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung unter Zutritt von Luft erfolgt. 3. Verfahren nach Ansprüchen i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces resistomycificus submers gezüchtet wird. 4. Verfahren nach Ansprüchen i bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährinedium Glycerin enthält. 5. Verfahren nach Ansprach i, dadurch gekennzeichnet, daß man Resistomycin aus dem Mycel von Streptomyces resistomycificus durch Extraktion gewinnt. 6. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extrakte aus dem Mycel von Streptomyces resistomycificus durch Adsorptionsmethoden, insbesondere chromatographische, reinigt.