DE1185334B

DE1185334B - Verwendung von Streptomyces caelestis NRRL 2821 zur Herstellung des Antibiotikums M-188

Info

Publication number: DE1185334B
Application number: DEA36852A
Authority: DE
Inventors: Earl Elmer Fager; Thomas Josephus Oliver; Joseph Frank Prokop; Arthur Charles Sinclair
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1960-03-01
Filing date: 1961-03-01
Publication date: 1965-01-14
Also published as: GB936049A; US3218239A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Internat. KL: C12 d

Deutsche Kl.: 30h-6

Nummer: 1185 334

Aktenzeichen: A 36852IV a/30 h

Anmeldetag: I.März 1961

Auslegetag: 14. Juni 1965

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums M-188 durch Fermentation von Nährlösungen mittels Streptomyces caelestis NRRL 2821, die Gewinnung des Antibiotikums aus den Nährlösungen sowie seine Überführung in Salze.

Nach der Erfindung gelingt die Herstellung eines neuen und brauchbaren Antibiotikums, das gegen zahlreiche Bakterien und Protozoen aktiv ist, beispielsweise gegen Elmeria tenella. Außer dem Antibiotikum M-188 können auch die entsprechenden sauren Additionssalze des Antibiotikums hergestellt werden.

Es wurde bereits ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des fungiziden Antibiotikums »Phytoactin« auf biologischem Wege mit Hilfe des Stammes Streptomyces hygroscopicus NRRL 2752 (deutsche Auslegeschrift 1 121 276) und ein Verfahren zur Gewinnung des antibakteriell wirksamen Antibiotikums »Moenomycin« mit Hilfe des Stammes Streptomyces bambergienis nov. spec. 3263 oder S. ghanaensis nov. spec. 4092, S. ederensis nov. spec. 2861 oder S. geysiriensis nov. spec. 3888 (deutsche Auslegeschrift 1 113 791) vorgeschlagen. Bekannt ist, daß S. caelestis ein Antibiotikum D-52, auch Celesticitin genannt, erzeugt, welches sich jedoch von dem Antibiotikum M-188 unterscheidet, wie weiter unten ausführlich dargelegt wird.

. Verwendet man für die erfindungsgemäße, biologische Gewinnung den Stamm von Streptomyces caelestis NRRL 2821 unter bestimmten Bedingungen und in einem geeigneten Nährmedium, so erhält man ein neues Antibiotikum mit der Bezeichnung M-188. Der Stamm des Mikroorganismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die in Capitol City, Texas/USA., entnommen wurde. In seinen morphologischen Eigenschaften scheint der Organismus mit dem bekannten Mikroorganismus Streptomyces caelestis eng verwandt zu sein. Wie nachstehend erläutert wird, bestehen bestimmte Unterschiede in den Kultureigenschaften des bekannten Organismus und denjenigen des neu aufgefundenen erfindungsgemäß verwendeten Stammes NRRL 2821. Aus diesem Grunde wurde der neu aufgefundene Stamm als ein Stamm des Streptomyces caelestis bezeichnet. Eine Kultur des lebenden Organismus wurde in der Northern Utilization Research and Development Division des Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, in Peoria, Illinois, USA, unter der Nummer NRRL 2821 hinterlegt.

Eine sorgfältige Untersuchung der morphologischen und physiologischen Eigenschaften des neuen Stammes von Streptomyces caelestis zeigt, daß sich dieser Stamm von Streptomyces caelestis unterscheiden läßt. Strepto-Verwendung von Streptomyces caelestis
NRRL 2821 zur Herstellung des
Antibiotikums M-188

Anmelder:

Abbott Laboratories, North Chicago, JIl.

(V. St. A.)

Vertreter:

Dr.-Ing. F. Wuesthoff, Dipl.-Ing. G. Puls und
Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Frhr. v. Pechmann,
Patentanwälte, München 9, Schweigerstr. 2

Als Erfinder benannt:
Earl Eimer Fager, Lake Villa, JlL;
Thomas Josephus Oliver, Zion, JlL;
Joseph Frank Prokop, Mundelein, JlL;
Arthur Charles Sinclair, Lake Bluff, JlL
(V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

V.St.v.Amerika vom I.März 1960 (12062) -

2

myces caelestis ist in der britischen Patentschrift 971 vollständig beschrieben. Es wurde festgestellt, daß beide Organismen Xylose, Arabinose, Rhamnose, Dextrose, Galactose, Mannose, Fructose, Saccharose, Lactose, Maltose, Cellobiose, Dextrin, Raffmose, Glycerin und bernsteinsaures Natrium leicht verwerten. Keiner der Organismen verwertet jedoch Sorbose, Dulcit, Natriumkaliumtartrat oder lösliche Stärke.

Andererseits werden jedoch Sorbit, Natriumeitrat und Salicin von Streptomyces caelestis Stamm NRRL verwertet, jedoch nicht von Streptomyces caelestis. Die Verwertung der vorstehend genannten zahlreichen Kohlenstoffverbindungen durch den neuen Mikroorganismus-Stamm wurde bestimmt nach P r i d h a m und Gottlieb, J. of Bacteriology, 56, S. 107 bis 114 (1948). Unter dem Lichtmikroskop sind das sporulierende Mycel und die Sporen beider Organismen nicht unterscheidbar.

Andere direkte Vergleiche unter Verwendung von Pridhams-Medium mit zahlreichen Kohlenstoffquellen ergeben, daß die Farbe des sporulierenden Luftmycels

409 768/368

von Streptomyces caelestis Stamm NRRL 2821 grünlichblau ist, im Vergleich zur himmelblauen Farbe, die von Streptomyces caelestis erzeugt wird. Beim Vergleich von Streptomyces caelestis mit Streptomyces caelestis Stamm NRRL 2821 wurden die folgenden Ähnlichkeiten und Unterschiede festgestellt:

Grundnährmedium	Verglichene Eigenschaften	Streptomyces caelestis Stamm NRRL 2821	Streptomyces caelestis
Gelatine	Wachstum Luftmycel Pigment	einigermaßen grauweiß dunkel bräunlich schwarz	gut blaugrau braun
	Verflüssigung der Gelatine	negativ	bis zur Tiefe des Pigments
Milch	Wachstum Koagulation Peptonisierung Reduktion	einigermaßen keine keine keine	gut keine keine keine
D-Glukose-Nährbouillon	Wachstum Luftmycel Pigment	einigermaßen bis gut keines keines	gut keines gelblich
Nähr-Agar	Wachstum Luftmycel lösliches Pigment	gut elfenbeinfarben perlmutterfarben keines	einigermaßen bis gut schwach rosa weiß bräunlichgelb
D-Glukose-Agar	Wachstum Luftmycel	gut keines	gut blaugrau weiß
	lösliches Pigment	keines	gelblich
Waksmans Tyrosin-Agar	Wachstum Luftmycel Pigment	einigermaßen bis gut keines keines	gut keines keines
Waksmans Stärke-Agar B	Wachstum	keines	keines
Nitrit aus Nitrat		negativ	negativ

Streptomyces caelestis sporuliert schneller auf organischen Medien jals Streptomyces caelestis Stamm NRRL 2821. Es wird angenommen, daß dies ein Unterschied des Stammes ist. Es wurde festgestellt, daß die beiden Organismen chemisch verschiedene Antibiotika produzieren. Zwischen dem von Streptomyces caelestis Stamm NRRL 2821 erzeugten Antibiotikum M-188 und dem bekannten Antibiotikum D-52 (= Celesticitin) ergeben sich folgende grundlegende Unterschiede:

	Gegenübers D-52	μ	teilung von M-188	Inten sität
Empirische Formel Löslichkeit in Äthyl acetat Optische Drehung	Q₃H₃₆O₉N₂S unlöslich + 121,5°	2,88 3,41 5,79	C₃₈H₆₁NO₁₄ löslich -40° "(1 ο/« freie Base in Chloroform)	M S S
	cm"¹	cm-¹
Infrarotabsorptions- J spektrum 1	3340 3210 1900	3472 2933 1727

(Fortsetzung)	45	cm-¹	μ	cm-¹	Inten
		1672	5,94	1684	sität
		1655	6,12	1634	W
	1615	6,26	1597	W
	1570	6,89	1451	S
5o	1545	7,11	1406	M
	1488	7,36	1359	W
	1090	7,46	1340	W
	758	7,73	1294	W
55 Infrarotabsorptions spektrum		7,85	1274	W
		8,00 8,60 8,95	1250 1163 1117	W
		9,25	1081	W S M
6o		9,52	1050	M
		9,75	1026	M
		9,85	1015	M
		9,98	1002	M
		10,22	978	M
		10,9	917	M
⁵		11,12	899	W
		11,53	868	W
		11,94	838	W
		M

S = stark; M = mittel; W = schwach.

Eine vollständige taxonomische Untersuchung des Streptomyces caelestis Stamm NRRL 2821 in zahlreichen Medien wird nachstehend angegeben. Die Farbwerte sind dem »Color Harmony Manual«, 3. Ausgabe, Jacobsen, Granville, und Foss, 1948, Container Corporation of America, entnommen.

Medium Nr. 1:
Trypton-Glukose-Fleischextrakt-Agar

Das Wachstum in diesem Medium ist rasch und kräftig. Nach 6 Tagen ist die dunkelste Farbe des Substrats senf braun (2 pi). Nach 11 Tagen ist das leichtere Substrat goldbraun, tabakbraun (3 pi), die dunkleren Flächen, die Zentren der dichtgedrängten Kolonien nelkenbraun (3 ni). Nach 18 Tagen sind diese Flächen kamelfarben, ahornzuckerfarben, gelblich (3 Ie) bzw. nelkenbraun, tiefbraun (3 pi).

Das Luftmycel ist kräftig, es bedeckt die Oberfläche von 2 bis 3 mm Kolonien im Durchmesser und den zentralen Teil anderer größerer Kolonien nach 3 Tagen. Luftmycel grauweiß (b) bis hellgrau (c) unverändert während 26 Tagen Bebrütung. Die mikroskopische Prüfung des Luftmycels nach 26 Tagen ergab keine Sporen.

Isolierte Kolonien besitzen konvexe Zentren, wobei das Luftmycel auf 1 bis 2 mm im Zentrum beschränkt ist. Zwischen dem 6. bis 11. Tag zeigt sich eine einzige diametrale Falte oder Spalte im zentral-erhöhten Teil. Mit fortschreitendem Wachstum breiten sich die Kolonien flach aus mit 2 bis 4 mm Oberflächenwachstum im Durchmesser, der Rest verbreitet sich dicht unter der Agaroberfläche auf einen Gesamtdurchmesser von 7 bis 7,5 mm nach 18 Tagen. Das Luftmycel bleibt auf die am 3. Tage festgestellte ursprüngliche Fläche beschränkt.

Das lösliche Pigment sieht am 3. Tage bräunlich aus, am 6. Tage mäßig nelkenbraun (3 ni) und wird nach 18 Tagen dunkelschokoladenbraun (4ni).

Medium Nr. 2:

Pepton-Glukose-Natriumchlorid-Fleischextrakt-Agar

Sehr rasches und kräftiges Wachstum. Das Substrat ist nach 6 Tagen senffarben-altgold (2 Ie), die tiefergefärbten Teile nach 11 Tagen bernsteinfarben-topas (3 pe) — nach 18 Tagen goldbraun (3 pg); der frisch gewachsene Teil in den sich ausdehnenden Kolonien ist senffarben-altgold (2Ie).

Luftmycel spärlich bis mäßig nur in Regionen mit dicht gedrängtem Wachstum perlfarben (2ba) nach 6 Tagen; es färbt sich gelblich (1 ba) nach 11 Tagen. Die mikroskopische Untersuchung ergab nach 27 Tagen keine Sporen.

Nach 6 Tagen weisen isolierte Kolonien erhobene radial gefaltete Zentren auf. Nach 18 Tagen erstrecken sich einige radiale Verzahnungen (indentations) innerhalb 0,5 mm bis an den Rand der Kolonien. Isolierte Kolonien von 2¹Z₄ mm am 3. Tage erreichen 8 bis 11 mm nach 18 Tagen. Von oben betrachtet, sehen die isolierten Kolonien hellsenffarben gelblich (2 Ie) aus mit Ausnahme der Zentren, die austrocknen und zusammenfallen und cremefarben aussehen (I^ ca).

Ein zwischen dem 3. und 11. Tage sehr hell bräunliches lösliches Pigment wird nach 18 Tagen schwach diffus grünlichbraun.

Medium Nr. 3: Nähr-Agar

Hervorragendes Wachstum. Luftmycel mäßig bis kräftig bedeckt 2,0 mm Kolonien am dritten Tag, jedoch keine Zunahme während sich das Wachstum auf 4 bis 6 mm am 11. Tage sich ausdehnt. Luftmycelfarbe austernweiß (b) bis perlfarben, muschelfarben (2 ba) bis elfenbeinfarben (2 cb), während die Bebrütung fortschreitet. Es werden bei mikroskopischen Untersuchungen am 11., 18. und 27. Tag keine Sporen beobachtet.

Gut isolierte Kolonien in 6 bis 11 Tagen, 4 bis 6 mm Durchmesser, mit radialen Falten und einer einzigen hervorragenderen diametralen Spalte, begrenzt hauptsächlich auf den erhöhten luftmyceltragenden zentralen Teil von 2,0 mm. Das restliche Wachstum dehnt sich flach über die Agar-Oberfläche bis zu einer gut definierten Kante aus. Das Wachstum dehnt sich nicht in den Nähr-Agar über die Grenzen des Oberflächenwachstums aus.

Dunkleres Substrat, nelkenbraun, tiefbraun (3 pl) bis dunkelbraun, kaffee-, sepiabraun, seehundbraun (seal) (3 ph) nach 6 bis 11 Tagen, wird nelkenbraun (3 nl) in 18 Tagen. Helleres Substrat unter den kein Luftmycel aufweisenden Teilen adobebraun, hellbraun, zimtbraun, (3 Ig) nach 11 Tagen, ändert sich in ahorngelb (3 mg) nach 18 Tagen.

Lösliches Pigment tiefbraun, nelkenbraun (3 pl) nach 6 Tagen, ist tief braun (4 pl) nach 11 Tagen und diffus senf braun (2pl) nach 18 Tagen.

Medium Nr. 4: Glukose-Agar

Das Wachstum in diesem Medium ist schnell und kräftig. Kein Luftmycel entstanden während 27 Tagen und kein lösliches Pigment beobachtet.
2 mm glatte, matte Kolonien nach 3 Tagen, breiten sich nach 6 Tagen flach auf 4 bis 4¹I₂ mm aus, mit symmetrisch radialen Spalten oder Verzahnungen, wobei der erhöhte zentrale Teil gekräuselt ist. Während das Wachstum weitergeht, breitet es sich nicht unter die Agar-Oberfläche wie in anderen organischen Medien mit weniger Glukose aus.

Substratfarbe in den dunkleren Kolonienzentren ist senffarbig, altgold (2 Ie) nach 6 Tagen, danach keine Änderung. Das hellere Substrat des neu sich ausbreitenden Wachstums ist bambus, chamoisfarben (2gc).

MediumsNr. 5: Carvajal Haferflocken-Agar
Während 27 Tagen Bebrütung findet auf diesem

Medium kein Wachstum statt.

Medium Nr. 6: Czapeks-Lösung-Dextrose-Agar

Wachstum beginnt langsam mit nadeiförmigen Kolonien nach 3 Tagen, fortschreitend zu 7,0 mm isolierten Kolonien nach 18 Tagen. Spärliches gelbes (1 ba) Luftmycel nach 6 Tagen beobachtet in den zentralen Papillen von 1 bis 17₂mm Kolonien. Am 11. Tag befindet sich das perlfarbene, muschelfarbene Luftmycel (2 bc) als ein spärlicher Ring um den kein Luftmycel aufweisenden zentralen Teil. Von oben betrachtet, ist dieses Zentrum senffarben-altgold (2 Ie). Substrat von Streifen- und Koloniezentren nach 11 Tagen pergamentfarbig (IV₂ db). Nach 18 Tagen beträgt das Oberflächenwachstum der Kolonie un-

7 8

gefähr 3,0 mm, der Rest breitet sich unter der Agar- Nach 18 Tagen 9,0 mm Kolonien mit fünf radialen

Oberfläche bis 7 mm aus. Verzahnungen. Zone der Hydrolyse 13,0 mm Durch-

In 27 Tagen kein lösliches Pigment gebildet. Mikro- messer. Nach 27 Tagen Kolonie 19,0 mm — Hydro-

skopische Prüfung keine Sporen nach 27 Tagen. lyse 34 mm.

Medium Nr. 6c: Czapeks Lösung-Maisstärke-Agar Medium Nr. 11: Tryptose-Blut-Agar

Nach 3 Tagen mäßiges farbloses Wachstum in Reichlich mattes trocknes Wachstum ohne Luft-Streifen. Isolierte Kolonien federartig ΐγ₂ bis 2 mm, mycel, keine Hämolyse während 18 Tagen Bebrütung, es wird keine Hydrolyse festgestellt. Nach 6 Tagen Es findet eine stark dunkle, beinahe schwarze VerWachstum verbleibt farblos. Isolierte Kolonien mit io färbung des umgebenden Mediums benachbart zu dem 3,0 bis 3V₂ mm. Partielle Hydrolyse von 2,0 mm farg- Wachstum innerhalb 3 Tagen statt. Es können bei lieh nahe stark wachsender Streifen. Am 11. Tage genauer Betrachtung unversehrte rote Zellen entdeckt Hydrolyse fraglich — trüber Hof um das Wachstum werden.

mit kleiner Zone von partieller Aufklarung darüber ■», ,. " -»_T "",«" ^, * ·

hinaus. Nach 18 Tagen viele Kolonien mit reichlich 15 - Medium Nr. 13: Gelatmepfropfen

grünen bis blaugrünen Luftmycelsporen — isolierte Bis 3 Tage ist das Wachstum nicht sichtbar, jedoch

Kolonien breiten sich dicht in den Agar 2,0 mm unter gut am 6. Tag mit spärlichem austernweißem (b)

das Oberflächenwachstum aus. Typische Messung: Luftmycel und mäßig bis reichlich ebenholz-, teak-

Durchmesser des Oberflächenwachstums 9,0 mm, farbenem (3 po) löslichem Pigment unter der Oberfläche

unterhalb Agar bis 11,0 mm, wolkiger Hof bis 15 mm 20 der Kahmhaut. Nach 18 Tagen ist die Kahmhaut

und schwache bis mäßige Hydrolyse bis 22,0 mm. schwer und das Pigment tief braun. Gelatine wird

Aufklarzone beurteilt gegenüber der Vergleichsprobe während der 27 Bebrütungstage nicht verflüssigt.

mit Agar, nicht gegenüber dem wolkigen inneren Hof. , * ν + & * i.-u s j %

. Medium Nr. 14: Kartoffelschube (wedge)

Medium Nr. 7: Dextrose-Asparagin-Agar _aJ. _{Nach einem langsamen Beginn ist das Wachstum}

Wachstum ist mäßig bis gut in diesem Medium. Das gut bis hervorragend. Nach 6 Tagen besteht die Mehrstärkstpigmentierte Substrat ist nach 6 Tagen perga- zahl des Wachstums aus zahlreichen trocken erhobenen mentfarben (1V₂ db). Dies bleibt die tiefste Farbe, die Kolonien ohne Luftmycel. Kärgliches Luftmycel ist in den zentralen Teilen der isolierten Kolonien erhalten an dem dünnen oberen Teil des Schrägrohrs vorhanden, wird. Neueres Wachstum zeigt Substratfarben gelb 30 Faltenbildung nach 11 Tagen mit zahlreichen feinen (1 ba) bis farblos, mit Annäherung an die Kante des radialen Spalten und Verzahnungen. Das kein Luftsich ausdehnenden Wachstums. Luftmycele sind mäßig mycel aufweisende Wachstum ist adobebraun, zimtgelb (1 ba) bis austernweiß (b), nach 27 Tagen Be- braun, leicht braun (3 Ig) nach 6 Tagen und wird goldbrütung keine Bildung von löslichem Pigment oder braun, tabakbraun (3pl) bis tiefbraun, nelkenbraun Sporen. 35 (3 pl) nach 11 Tagen. Das kärgliche Luftmycel auf der Medium Nr. 8: Calciummalat-Agar Oberseite des Sdträgmhrs ist elfenbeinfarben (2 db).

Es findet nur em maßiges Dunkeln der Kartoffeln

Das Wachstum ist hervorragend, die Verwertung während der 27 Bebrütungstage statt,
des Malats gut bis beträchtlich. Am 3. Tag bestehen ., ,. _XT ... _, , , .„
die Kolonien, die aüe sogar in eng gehäuften Streifen 40 - Medium Nr. 15: Glukosebomllon
isoliert sind, aus 2,0 mm flachen filmartigen kein Nach Beimpfung besteht das gesamte Wachstum in Luftmycel enthaltenden Kolonien. Geschätzt bei diesem Medium aus abgetrennten Kolonien unter der >95°/o Wachstum. Der Rest der kleinen Kolonien Oberfläche, die an den Seiten und an dem Boden des wies Luftmycel auf. Nach 6 Tagen wird schwaches Röhrchens anhaften. Nach 11 Tagen zeigen die Aufklaren des Malat-Agars bemerkt. Alle Kolonien 45 Kolonien an den Seiten dunklere und hellere Teile, haben jetzt gelbe (1 ba) Luftmycele, ausgenommen die aus einem dichten Zentrum strahlen; typisch für einige Flecken von mandelgrüner Farbe (23 Ig). Es strahlartige Faltenbildung auf günstigem festem wurde nicht bemerkt, ob die grünen Luftmycel- Medium. Am 18. Tage befindet sich das gesamte kolonien diejenigen sind, die zuerst mit Luftmycel Wachstum am Boden der Röhre. Es bildet sich keine nach 3 Tagen erschienen. Nach 11 Tagen ist die 50 Kahmhaut; daher kein Luftmycel oder Substrat-Digestion auffallend 5 bis 6 mm von der Streifenkante, pigment bemerkt. Das Wachstum war farblos. Es wird und ehemaliges Luftmycel ist jetzt s^rk grau bis kein lösliches Pigment beobachtet,
schieferfarben. Nach 18 Tagen ist die Masse des Luft- „ ,. _XT ,,- ^, ' , τ· · -^
mycels austernfarben weiß (b) bis leicht elfenbein- Medium Nr. 16: Czapeks Losung mit Dextrose

farben, eierschalenf arben (2ca), und nach 27Tagen sind 55 Während 27tägiger Bebrütung findet kein Wachstum

reichlich neue grüne Luftmycelkolonien in dem Streifen. statt.

Mikroskopische Prüfung des grünen Mycels ergibt Medium Nr. 17: Lakmusmilch

übermäßige Sporulation. Wachstum besteht aus partieller Kahmhaut. Am

Medium Nr. 9: L-Thyrosin-Schrägagar _fi "· Jage sind zwei breite gekräuselte Kolonien vor-

⁶⁰ handen. Das Rohrchen wird gründlich geschüttelt,

Es wird von den zahlreichen Kolonien, die sich um das Wachstum zu verteüen. Am 18. Tage hat keine

zuerst langsam, aber mit fortschreitender Bebrütung bemerkenswerte Änderung stattgefunden. Nach

während 27 Tagen entsprechend entwickeln, kein 27 Tagen hat keine Koagulation oder Peptonisierung

lösliches Pigment gebildet. stattgefunden. End-pH-Wert am 27. Tage beträgt 5,7.

Medium Nr. 10a: Stärkeagar Nr. 1 mit Maisstärke Medium Nr. 18: Hefeextrakt Maltose-Agar

Nach 3 Tagen kein sichtbares Wachstum, nach Es findet reichliches und schnelles Wachstum in

6 Tagen eine Kolonie, nach 11 Tagen eine Kolonie. diesem Medium statt. Die getrennten Kolonien ent-

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halten kein Luftmycel. Mäßiges Luftmycelin gehäuften Lactose bzw. Rohrzucker oder Kombinationen dieser

Wachstumsregionen austernweißfarbig (b). Bei mikro- Kohlenhydrate, eine Quelle für organisch gebundenen

skopischer Prüfung des Luftmycels werden am 11., 18. Stickstoff, wie Sojabohnenmehl, Maisquellwasser oder

und 27. Tag keine Sporen beobachtet. Pepton, Wuchsstoffe enthaltende Substanzen, wie Hefe,

Die Substratfarbe ist bambusfarben, chamois (2 ge) 5 Rückstände der Melassevergärung (distillers solubles)

am 6. Tage, wird honiggelb, hellgold (2 ic) am 11. Tag oder Melasse, Mineralsalze, wie Natriumchlorid, ein

und goldbraun ungefähr (3 pg) am 18. Tag. Gut iso- unlösliches Puffermittel zum Abfangen von Säure wie

lierte Kolonie ohne Luftmycel 4 bis 5 mm am 6. Tage, Calciumkarbonat und ein ungiftiges Antischaummittel,

konvex mit zahlreichen symmetrischen, radialen z. B. ein Pflanzenöl. Sobald die Organismen eine hin-

Spalten oder Kräuseln. Diese erreichen 8,0 mm am io reichende Menge an Antibiotikum erzeugt haben, wie

11. Tage mit flachen sich ausdehnenden Teilen. Der es durch Prüfung der Hemmwirkung gegenüber

zentral erhöhte Teil ist radial mit Spalten durchzogen, . Bazillus subtilis ermittelt werden kann, wird die ganze

die in einer kleinen zentralen Grube oder Senkung Kultur auf Antibiotikum aufgearbeitet. Die in der

zusammenführen. Das Wachstum an den Kolonie- flüssigen Phase vorhandene Menge der aktiven Sub-

kanten dehnt sich nicht in das Agar über das Ober- 15 stanz hängt vom pH-Wert ab, da das Antibiotikum

flächenwachstum hinaus. Es wird kein lösliches eine schwache Base mit geringer Wasserlöslichkeit ist.

Pigment bemerkt. Die mit den filtrierten bzw. zentrif ugierten Kultur-

_TT , „ , lösungen durchgeführten Versuche zur Bestimmung

Medium Nr. 19: Tomatenpaste — Haferflocken-Agar _{der ant}i_bioti_schen Aktivität vermögen deshalb die

Schnelles und reichliches Wachstum findet statt. Es 20 erzeugte Gesamtaktivität nicht wiederzugeben. Es ist ist reichlich austernweißes (b) Luftmycel in dichten notwendig, vor der Durchführung einer Probe eine Wachstumsregionen nach 3 Tagen vorhanden. Iso- Säurebehandlung der gesamten Kultur durchzuführen, lierte Kolonien, typisch für diejenigen, die für andere Der größere Teil des Antibiotikums bei einer guten organische Medien beschrieben sind. Nach 18 Tagen Fermentierung wird in den festen Anteilen der Kultur erscheint Luftmycel auf isolierten Kolonien in Flecken 25 gefunden. Das Antibiotikum wird deshalb zweck- oder als dünner Ring um das kein Luftmycel auf- mäßigerweise aus der ganzen Kultur und nicht aus weisende erhöhte radial gefaltete und gewundene dem Filtrat oder dem flüssigen Teil extrahiert. Es wird Zentrum. In den dichten Wachstumsregionen erscheint ein Lösungsmittel verwendet, wobei von der geringen Luftmycel im Zentrum der Kolonie, indem es die Löslichkeit der Substanz in Wasser unter alkalischen Kolonie an den dichtesten Stellen überdeckt. Es wird 30 Bedingungen und der hohen Löslichkeit der Substanz keine Farbveränderung des Mediums beobachtet. Das in Wasser unter sauren Bedingungen Gebrauch ge-Luftmycel nimmt keine grüne Farbe während 27 Tagen macht wird.

Bebrütung an. Mikroskopische Prüfung des Luft- Das für die Verwendung in Schüttelflaschen ge-

mycels nach 27 Tagen zeigte keine Sporen. Maximale eignete Inoculat kann durch Verwendung des Pilzes Größe einer einzelnen Kolonie nach 27 Tagen 21,0 mm. 35 in Tryptonschrägagarröhrchen erhalten werden. Dieses

Medium kann auch zur Erhaltung geeigneter lebens-

Morphologie der Sporen Medium nach P r 1 d h a m _{fähi das} Antibiotikum erzeugender Kulturen durch

und G ο 1111 e b Grundnahrmedium mit Dextrin übertragung von Schrägröhrchen zu Schrägröhrchen

als Kohlenstoffquelle verwendet werden. Im allgemeinen erwies sich jedoch

Sporen von etwa 0,8 · 1,0 μ entstehen in einzelnen 40 das Erhalten der M-188-Kultur in Erde oder gefrierbiegsamen Ketten unter Bildung von Schleifen, Spulen getrocknet als zuverlässiger. Der Pilz in den Schräg-(coils) und einfachen Spiralen. Es wurden keine echten röhrchen wird zum Beimpfen von Schüttelkolben verSpiralen beobachtet. Die Ketten erscheinen im allge- wendet, welche ihrerseits zum Beimpfen von Fermentern meinen als Büschel an den Enden von Mycelfäden oder im Laboratorium verwendet werden können. Eine kurzen Zweigen von Mycel, gelegentlich jedoch als 45 andere Verfahrensweise besteht in der Verwendung Einzelketten von einem primären Zweig. Die Büschel der Schüttelkolben zum Beimpfen von geeigneten werden durch mehrere Ketten erzeugt, die durch ganz Metallgefäßen, vorzugsweise aus Aluminium, mit unmittelbare Verzweigung und Wiederverzweigung einem Gehalt an einem geeigneten Medium, welches des Mycels und nicht durch Abstreifen von einem zum Beimpfen von halbtechnischen Fermentern oder einzelnen Ursprung entstehen. 50 Keimbehältern (seed tanks) technischer Fermenter

Aufnahmen im Elektronenmikroskop zeigen, daß dient. Das Wachstum der Organismen in Fermentern die reifen Sporen mit zahlreichen Furchen und stumpfen mit einem Fassungsvermögen von 23 bis 380001 Graten versehen sind. Junge Sporen sind verhältnis- erreicht im allgemeinen sein Maximum nach 3 bis mäßig glatt. Manche von diesen scheinen zweikernig 4 Tagen, obwohl für die Zwecke der Herstellung von zu sein. Die auf Grand der oben angegebenen Messungen 55 Impfmaterial die Bebrütung 24 Stunden betragen kann, beschriebene ovoide bis bazillenförmige Gestalt wird In den Fermentern herrschen aerobe Bedingungen, durch die Aufnahmen im Elektronenmikroskop be- indem durch eine Dispergier- bzw. Zerteilvorrichtung stätigt. am Boden des Fermenters sterile Luft gepreßt wird.

Das neue Antibiotikum M-188 kann man dadurch Der Anteil der in das Kulturmedium gepreßten Luft gewinnen, daß man Streptomyces caelestis, Stamm 60 hängt etwas von der Größe und Form des Fermentier-NRRL 2821, bzw. dessen Varianten oder Mutanten, gefäßes ab. Es erwies sich eine Belüftungsgeschwindigin geeigneter Weise züchtet und das Antibiotikum aus keit von V₅ bis 1 Volumen Luft pro Volumen der Mycel und Kulturlösung isoliert. Die Kultivierung Kultur pro Minute als zufriedenstellend. Schäumt das erfolgt bei einer Temperatur von 24 bis 32° C, unter Kulturmedium während der Fermentierung zu stark, submersen Bedingungen (submerged fermentation), 65 so können ungiftige Pflanzenöle als Antischaummittel unter Rühren und Belüften und unter Verwendung in einer zur Beseitigung des Schaumes hinreichenden von Medien, die eine Kohlenhydratquelle enthalten, Menge zugesetzt werden. Während der Fermenwie Glycerin, Stärke, Dextrin oder die Zuckerglukose, tierungsperiode wird das Kulturmedium bewegt. Ih

11 12

den Fällen, in welchen die Ausbeute an Antibiotikum wobei Luft mit einer Geschwindigkeit von 1 Volumen

wichtig ist, wird das Rühren durch Rührvorrichtungen Luft pro Volumen Flüssigkeit pro Minute durchge-

bewerkstelligt, wobei das Ausmaß der Bewegung von leitet wurde.

der Konstruktion der verschieden großen Fermen- Nach Beendigung der Fermentation war die

tationsgefäße abhängig ist. Die Organismen Strepto- 5 Vermehrung oft so stark, daß es nötig war, die

myces caelestis Stamm NRRL 2821 können die ge- Kultur mit Wasser zu verdünnen, um sie pumpen zu

wünschten Antibiotika in ausreichenden Mengen in können.

verschiedenen Nährmedien bei Temperaturen von Versuche mit unbehandelten Kulturen waren wegen mindestens 24 bis 32° C erzeugen. Es ist nicht erfor- der Unlöslichkeit des Antibiotikums von geringem derlich, eine exakte Belüftung oder ein spezielles Aus- io oder keinem Wert für die Bestimmung der Wirksammaß der mechanischen Bewegung aufrechtzuerhalten. keit der Kulturen am Endpunkt. Durch folgende

Behandlung der Kulturen wurden diese Unter-

Beispiel 1 suchungen brauchbarer: 50ecm der gesamten Kultur

Züchtung in einem 190-1-Gefäß mit einem Medium wurden auf einen pH-Wert von 2 mit Salzsäure einge-

aus Sojabohnenmehl, Maisquellwasser und Hefe ¹S stellt und diese angesäuerte Kultur 30 Minuten lang geschüttelt, anschließend durch drei Lagen eines What-

Die Organismen des Streptomyces caelestis Stamm man-1-Filterpapiers unter Anwendung von Vakuum

NRRL 2821 wurden auf einem Typtonschrägagar filtriert. Dieses Filtrat war nach Einstellung des

6 Tage lang bei 28 ⁰C gezüchtet. Die Agarkultur wurde pH-Wertes auf 4,0 mit Natronlauge zur Bestimmung

in einigen ecm Wasser suspendiert und zwei 500-ccm- ao bereit. Der in diesem Beispiel beschriebene Fermen-

Erlenmeyer-Kolben mit 150 ecm Keimmedium fol- tationsversuch ergab eine Aktivität von 225 Einheiten

gender Zusammensetzung beimpft: pro Kubikzentimeter.

781 fermentierte Kultur wurden mit Schwefelsäure

Glukosemonohydrat 15 g/l auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und dann zur

Sojaflockenmehl 15 g/l ²5 Entfernung des Mycels drei Stunden gerührt und dann

Kochsalz 5 a/1 filtriert. Daraufhin wurde das Filtrat mit 10°/oiger

'"" ' Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,3 eingestellt und

Calciumkarbonat lg/1 _{ein Sec}h_st_el des Volumens Amylacetat zugesetzt,

woraufhin die Mischung 30 Minuten gerührt wurde.

Die beiden je 150 ecm dieses Medium enthaltenden 30 Die beiden Phasen wurden durch Zentrifugieren geKolben waren 25 bis 30 Minuten lang bei 120° C steri- trennt und die nahezu keine antibiotische Wirkung lisiert worden. Nach dem Abkühlen wurde der Kolben- zeigende wäßrige Phase verworfen. Die Amylacetatinhalt mit den oben beschriebenen Agarkulturen be- phase wurde mit etwa V₄₀ Volumen Wasser, mit impft. Die so beimpften Kolben wurden 48 Stunden Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt, lang in einer Rüttelvorrichtung mit einem Hub von 35 extrahiert und die Phasen getrennt. Die wäßrige 57,15 mm (274 inch) bei 28° C geschüttelt. Der ge- Lösung wurde dann unter kräftigem Rühren auf einen samte Inhalt dieser Kolben wurde in einen belüfteten pH-Wert von 9,5 mit Natronlauge gebracht. Die Auf-Metallkolben, der etwa 121 faßte und 101 folgenden schlämmung wurde abfiltriert und der Filterkuchen Mediums enthielt, zur Beimpfung gegeben. mit destilliertem Wasser mit einem pH-Wert von etwa

40 9,0 sorgfältig gewaschen. Die Feststoffe wurden im

Sojabohnenmehl 10 g/l Vakuum bei 45°C getrocknet und ergaben 10,5 g mit

Glukosemonohydrat 10g/l ^einer Wirksamkeit von 474 Einheiten pro MMi-

Calciumkarbonat lg/1 Sr*?£_profee ^ ^_n ^ ^^ ._{q trockeQem}

Umgeestertes Pflanzenöl 5 g/l ₄₅ Äther gelöst und Chlorwasserstoff durch den

Äther geleitet, wodurch das Chlorwasserstoffsalz aus-Der Behälter samt Inhalt war 80 Minuten lang bei fiel.

120°C sterilisiert und dann auf 28° C abgekühlt worden. Um die Aktivität der verschiedenen Präparate des

Der belüftete Behälter wurde bei 28° C 48 Stunden Antibiotikums M-188 zu bestimmen, wurde eine Agarlang bebrütet. Während der Zeit perlte Luft aus einer 50 Plattenprüfung unter Verwendung des Bacillus subtilis am Boden befindlichen Röhre mit einer Geschwindig- ATCC-10707alsTestorganismusundeinM-188-Präpakeit von 101 in der Minute durch die Flüssigkeit. Der rat miteinerAktivitätvon320 Einheitenpro Milligramm gesamte Inhalt des Behälters wurde dann zur Be- verwendet. Die Bestimmungen wurden nach D. C. impfung eines 1901 fassenden Behälters verwendet, der Grove und W. A. Randall, »Assay Methods of bereits 1151 folgenden Mediums enthielt, das vorher 55 Antibiotics and a Laboratory Manual«, Medical 1 Stunde bei 124° C sterilisiert und auf 32° C abgekühlt Encyclopedia, Inc., 30 E. 60th Street, New York 22, worden war. N. Y. (1955), S. 34/35 und 38, durchgeführt. Das Agar-

medium war Streptomycin-Prüfagar mit Hefeextrakt

Stärke 10 g/l <j_er Baltimore Biological Laboratories, und zwar

Sojabohnenmehl 20 g/l 60 10 ecm je Platte. Die Testlösung wurde in einem

Maisquellwasser (Naßgewicht) 10 g/l l%igen Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0

Ganze getrocknete Bierhefe 5 g/l f^Γ^^ηηί'_τ ^{in S}ijfi^e° ^a™ Stahlblech (hergestellt von

_,,.,, „ ,, Labline, Inc., 3070-82 West Grand Avenue, Chicago

Calciumkarbonat 3 g/l _{22 m) gefMt und diese 16 feis 17 Stunden lang bei}

Umgeestertes Pflanzenöl 30 g/l 65 37°C bebrütet. Der Bereich der Brütkurve lag bei 2, 4,

6, 8, 16 Einheiten pro Kubikzentimeter, wobei der

Das so beimpfte Medium in dem Behälter wurde Wert bei 4 Einheiten pro Kubikzentimeter als Bezugs-4 Tage bei einer Temperatur von 32° C heftig gerührt, wert genommen wurde. Einer 2-g-Probe der freien

Base wurde willkürlich eine Aktivität von 320 Einheiten pro Milligramm zugeordnet. Alle vorhergehenden Aktivitätswerte sind Vergleichsangaben hierzu. Auf dieser Basis stellen Proben von M-188 mit 600 Einheiten pro Milligramm hochgereinigtes Material dar, die sich der maximalen Aktivität nähern.

Nachdem man die Organismen 4 Tage gezüchtet und sich eine geeignete Konzentration des Antibiotikums in der Fermentationsflüssigkeit eingestellt hatte, konnte dieser Stoff auf verschiedene Weise von den Kulturen abgetrennt werden. Da der Stoff weitgehend unlöslich in neutralem oder alkalischem Wasser ist, befand sich der Hauptteil in der festen Phase. Es konnte z. B. die Kultur durch Filtration abgetrennt und das Filtrat, wie nachstehend beschrieben, weiterbehandelt werden, während die feste Phase mit einem organischen Lösungsmittel, wie Azeton, oder einem Alkohol, worin die Base löslich ist, extrahiert wurde. Oder es wurde die Fermentationsflüssigkeit angesäuert und gerührt, bis sich das Antibiotikum auflöste. Darauf wurde die Kultur abfiltriert und das Filtrat zur Gewinnung des gewünschten Stoffes weiterbehandelt.

Um nun M-188 aus der oben erhaltenen wäßrigen Lösung zu gewinnen, war es zweckmäßig, die Lösung alkalisch zu machen und die aktive Substanz mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel zu extrahieren. Eine große Anzahl von Lösungsmitteln konnte für diese Extraktion _ verwendet werden. Bevorzugt wurden Chloroform, Äthyl- oder Amylacetat. Um nun M-188 aus dem organischen Lösungsmittel zu gewinnen, konnte man die Lösung zur Trockene eindampfen; zweckmäßigerweise extrahierte man das Antibiotikum mit verdünnter wäßriger Säure. Man verwendete hierfür genügend Säure, um die freie Base im organischen Lösungsmittel zu neutralisieren, und brachte sie in einem kleinen Wasservolumen, d. h. etwa l°/o des Volumens der ursprünglichen Kultur, in Lösung. Bei Zugabe von Alkali, wie Natronlauge, zu der erhaltenen Lösung fiel die gewünschte Substanz als freie Base aus. Die freie Base konnte durch Chromatographie gereinigt werden, doch war dies zur Herstellung einer vollständig einheitlichen Substanz unzweckmäßig. Schickte man eine Chloroformlösung der freien Base M-188 durch eine mit Magnesiumsilikat gefüllte Kolonne und eluierte die aktive Substanz mit l°/o Äthanol enthaltendem Chloroform, so wurde eine Fraktionierung des Stoffes herbeigeführt, die durch Beobachtung der optischen Dichte bei 280 ΐημ verfolgt werden konnte.

Beispiel 2

Gewinnung des Antibiotikums aus der 115-1-Fermentation unter Verwendung von Amylacetat bei einem pH-Wert von 8,4 zur Extraktion

In zwei 190-1-Fermentern im wesentlichen nach Beispiel 1 gezüchtete Kulturen wurden vereinigt und ergaben 2251. Der pH-Wert wurde mit Hilfe von 10°/_oiger Natronlauge auf 8,4 eingestellt und mit ¹I₅ Volumen Amylacetat extrahiert. Nach Abtrennung

ao der Amylacetatschicht wurde diese mit ungefähr dem halben Volumen destillierten Wassers, mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt, ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit 10 °/o Natronlauge auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt. Diese Lösung mit dem Antibiotikum wurde unter vermindertem Druck auf 31 eingedampft und mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,0 eingestellt, wobei das Antibiotikum ausfiel. Dieses wurde abfiltriert und mit destilliertem Wasser mit einem pH-Wert von 9,0 sorgfältig gewaschen. Der Filterkuchen wurde bei 45° C unter vermindertem Druck getrocknet und ergab 26 g Antibiotikum M-188 mit einer Wirksamkeit von 435 Einheiten pro Milligramm.

17 g Antibiotikum mit einer Wirksamkeit von 395 Einheiten pro Milligramm (Elf_aß_max = 278 ηαμ. / = 236) wurden in 100 ecm Chloroform gelöst. Diese Lösung wurde einer Kolonne aufgegeben, die mit 500 g Magnesiumsilikatadsorptionsmittel beschickt war. Es

wurde mit 1% Äthanol in Chloroform entwickelt. Fraktionen von 15 ecm wurden aufgefangen und hinsichtlich der im Ultraviolett gezeigten Maxima wie folgt vereinigt.

Fraktion

Entwicklungslösung UV-Absorption

Aktivität

in Einheiten

pro Milligramm

Ausbeute

Ibis 59ml

60 bis 75 ml

76 bis 90 ml

91 bis 105 ml

106 bis 122 ml

122 bis 132 ml

Kolonneneluat des Bodenteils
Kolonneneluat des Kopfteils*

1 %Äthanol in Chloroform desgl. desgl. desgl. desgl. desgl.

100°/₀Äthanol desgl.

196
217
258
254
254
212
234
189

382
470
532
550
550
430
380
269

0,302

3,1

2,6

2,0

1,0

0,60

2,0

0,96

Die gefärbten Verunreinigungen wurden weitgehend am Kolonnenkopf zurückgehalten.

60 g des Antibiotikums mit einer Aktivität von 395 Einheiten pro Milligramm (EJJL = 236, λ_ηαχ — 278 πιμ) wurden in 200 ecm Chloroform gelöst und auf eine mit 120 g Magnesiumsilikat gefüllte Kolonne gegeben. Diese wurde dann mit 1% Methanol in Chloroform gewaschen, wobei man zwei Fraktionen erhielt:

Fraktion	E₁ ¹I bei 280ηι,ίί	Aktivität in Einheiten pro Milligramm	Ausbeute g
A B	237 225	560 450	43,6 2,2

16

Streptomyces caelestis Stamm NRRL 2821 bildet mehrere antibiotische Stoffe. Wie sich aus papierchromatographischen Analysen ergibt, enthalten die besten Ansätze mehr als einen biologisch aktiven Stoff. Zwei biologisch aktive Verbindungen, die als Verunreinigungen in den besten Ansätzen des Antibiotikums M-188 vorliegen, wurden als gereinigte Präparate erhalten. Ihre antibakteriellen Eigenschaften stimmten mit denen des Hauptbestandteils im wesentlichen überein. Somit muß das in dieser Beschreibung beschriebene Antibiotikum nicht 100% rein sein, um 100%ig aktiv zu sein.

DasAntibiotikumM-188 ist in gereinigtemZustand ein amorphes weißes Pulver, das in Wasser bei 25° C nur zu 2,5 mg im Kubikzentimeter löslich ist. Die Verbindung ist in den meisten organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Chloroform, Äthylacetat und Benzol, leicht löslich, in gesättigten Kohlenwasserstoffen unlöslich und in verdünnten wäßrigen Mineralsäuren leicht löslich. Die elektrometrische Titration in so 50%igem wäßrigem Äthanol zeigt die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe vom pKa = 6,7 an. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der freien Base in Chloroform weist ein Maximum bei 279 τημ, Εϊ*_η = 280 auf, ein Minimum liegt bei 232 mji, E\"L = 29. Das «5 Ultrarotabsorptionsspektrum des gereinigten M-188 ist aus der Zeichnung zu ersehen.

Die Elementaranalyse der freien Base M-188 ergibt einen Gehalt an Kohlenstoff von 60,37%, 8,21% Wirkungsbereich des Antibiotikums M-188

Organismus

Geringste Hemmkonzentration nach 48 Stunden in y/ml

Staphylococcus aureus 209-P .. Staphylococcus aureus Treaster. Staphylococcus aureus Wise 391

Staphylococcus albus

Streptococcus pyogenes

Streptococcus faecalis

Streptococcus agalactiae

Streptococcus dysgalactiae

Enterococcus 89

Enterococcus 93

Enterococcus Blaschke

Clostridium sporogenes ........

Clostridium perfringens

Corynebacterium species

Sarcina lutea

Diplococcus pneumoniae

Lactobacillus casei

Salmonella enteritidis

Aerobacter aerogenes

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Pasteurella multocida ATCC 10

Wasserstoff7l,9i% Stickstoff und 29,51% Sauerstoff" 30 Pasteurella multocida (Hühner) Für diese Werte paßt die Formel C₃₈H₆₁NO₁₄ mit Shigella sonnei folgenden theoretischen Werten: 60,38% Kohlenstoff,

8,13% Wasserstoff, 1,85% Stickstoff und 29,63%

Neisseria catarrhalis

Actinomyces bovis

Aspergillus niger .......

Chaetomium globoscum . Saccharomyces cerevisiae Candida albicans

0,5

0,75

0,25

0,13

0,25

48 64

0,25

0,06

0,25

0,5 256 256 128

4 96

512 512 32 512

Sauerstoff. Das berechnete Molekulargewicht ist 756.

Die sauren Additionssalze des Antibiotikums M-188 35 können durch Behandlung einer Lösung der freien Base in Wasser^ oder ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol, Äthylacetat oder Methylenchlorid, mit der äquivalenten Menge der wäßrigen Lösung einer Säure, wie Salzsäure, Oxalsäure, Salicylsäure oder 40 ^ζαΐ Bekämpfung von Sinusitis bei Truthühnern und Zitronensäure, und anschließendes Eindampfen der Coccidiose sehr geeignet ist. Gute Heilerfolge bei in-

Es wurde festgestellt, daß das Antibiotikum M-188

Lösung zur Trockene erhalten werden. Man kann jedoch auch eine Lösung des Antibiotikums in einem organischen Lösungsmittel mit einer bestimmten Säure oder deren Lösung behandeln, worauf das entsprechende saure Additionssalz unmittelbar aus der Lösung ausfällt. Beispiele für derartige Salze sind das Chlorhydrat, das Oxalat, Salicylat, Citrat, Benzoat und das Sulfat. Für therapeutische Zwecke müssen natürlich pharmakologisch verträgliche Salze verwendet werden.

Sinngemäß kann man selbstverständlich zur Herstellung des Antibiotikums M-188 nicht nur den Stamm Streptomyces caelestis NRRL 2821 verwenden, sondern grundsätzlich jede Abart, die durch mutationsauslösende Mittel, wie Röntgenstrahlen, UV-Licht, Stickstoff-Lost-Verbindungen u. dgl. gebildet wird.

Das Antibiotikum M-188 und seine sauren Additionssalze besitzen ein breites antibiotisches Wirkungsspektrum. Die Aktivität des Antibiotikums gegen zahl- reiche Organismen ist der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen.

fektiöser Sinusitis bei Truthühnern ließ sich erzielen, wenn man 25 bis 50 mg des Antibiotikums M-188 unmittelbar in die Nebenhöhlen der infizierten Tiere injizierte. Ebenso wurde festgestellt, daß man durch Zusatz des Antibiotikums zu Hühnerfutter in einer Menge von 0,05% bis 0,10 Gewichtsprozent des Gesamtfutters bei starker Infizierung der Hühner mit Coccidiose, infolge der Anwesenheit der Protozoenart Elmeria tenella, die Coccidiose sehr gut bekämpfen konnte.

Claims

Patentanspruch:

Verwendung von Streptomyces caelestis NRRL 2821 zur Herstellung des Antibiotikums M-188 auf üblichem biologischem Wege und Isolierung aus dem Kulturmedium.

In Betracht gezogene Druckschriften: Chemisches Zentralblatt, 1956, S. 10 506 bis 10 507.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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