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Immunologische Reagenzien Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung eines verbesserten Antiserums, welches Antikörper zu humanem Chorion-Gonadotropin
(nachfolgend als HCG bezeichnet) zur Verwendung in immunologischen Schwangerschaftsuntersuchungen
enthält.
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Die Schwangerschaft kann durch Feststellen von HCG in Urinproben oder
Serum festgestellt werden; HCG ist während der Schwangerschaft vorhanden, sonst
aber normalerweise abwesend. Da HCG antigen ist, kann die Untersuchung durch Behandeln
der Probe mit einem Reagens, welches HCG-Antikörper enthält und durch Beobachten
der immunologischen Reaktion nach einer der herkömmlichen Verfahrensweisen durchgeführt
werden. Beispielsweise wurden Schwangerschaftsuntersuchnungen beschrieben unter
Verwendung des Precipitinverfahrens (französische Patentschrift 973 915), des Komplement-Bestimmungsverfahrens
(belgische Patentschrift 605517)
und der Agglutinierungsverfahren unter Verwendung
von entweder roten Blutkörperchen (belgische Patentschrift 605 826 und 610 085)
oder Polystyrolpartikeln (belgische Patentschrift 613 680).
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Ein Antiserum, welches HCG-Antikörper enthält, wird durch Immunisieren
eines Tieres mit HCG, zusammen mit einem Hilfsmittel (vorzugsweise einem öligen
Hilfsmittel), Sammeln des Bluts des Tieres und durch Abtrennen des Serums hergestellt.
Jedoch ist das im Handel erhältliche HCG nicht rein, sondern enthält antigene Verunreinigungen;
und daher kann das Antiserum nicht allein HCG-Antikörper enthalten, sondern ebenso
sekundäre Antikörper, welche auf Grund der antigenen Verunreinigungen gebildet wurden.
Die sekundären Antikörper können mit den antigenen Bestandteilen des Urins oder
Serums reagieren, ob HCG vorhanden ist oder nicht, und diese nichtspezifische Reaktion
kann ein falsches positives Ergebnis in den Fällen erbringen, wo HCG nicht vorhanden
ist.
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Es wurden Untersuchungen vorgenommen, um diese Schwierigkeit durch
Verwendung eines in hoher Weise gereinigten HCG zum Immunisieren der Tiere zu vermeiden,
aber selbst in diesem Falle war es oft erforderlich, besondere Verfahrensstufen
einzuschalten, um sekundäre Antikörper an der Beeinträchtigiuig der Schwangerschaftsuntersuchung
zu hindern. In der belgischen Patentschrift 605 517 wird beispielsweise das Antiserum
vor der Verwendung mit Humanserum von Nichtschwangeren behandelt, um die sekundären
Antikörper zu sättigen.
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Es wurde nunmehr gefunden, daß die sekundären Antikörper im Titer
in bezug auf den HCG-Antikörper zunehmen, wenn die Immunisierung verlängert wird
oder wenn die Immunisierungsdosis von HCG groß ist. Es ist daher vorzuziehen, eine
sehr kurze Reihenfolge von Injektionen von mäßigen Dosen an HCG zu verwenden und
ein in hoher Weise spezifisches Antiserum zu erhalten.
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Bisher wurde ein Antiserum, welches HCG-Antikörper enthielt, unter
Verwendung einer Reihenfolge von vielen Injektionen von HCG, oftmals in sehr großen
Dosen, hergestellt. In der belgischen Patentschrift 605 826 wurde beispielsweise
Kaninchenantiserum durch Injektion von 12 000 Internationalen Einheiten von HCG
in wöchentlichen Zeitabschnitten über 5 bis 6 Wochen hergestellt. In der belgischen
Patentschrift 605 517 wurde Antiserum durch Immunisieren von Kaninchen mit 12 500
I. E. HCG dreimalig in Zeitabständen von 3 Wochen, wobei diesen drei Behandlungen
4 bis 6 Wochen später eine vierte Injektion von 3000 I. E. HCG folgte, hergestellt.
Nach der belgischen Patentschrift 613 680 wurde Kaninchenantiserum hergestellt durch
intramuskuläre Injektion von 50 000 I. E. HCG, welcher 3 Wochen später 3 intravenöse
Injektionen von 10 000 I. E. an aufeinanderfolgenden Tagen folgten.
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Nach der belgischen Patentschrift 610 085 wurden einem Kaninchen neun
Injektionen von insgesamt 2250 I. E. verabreicht.
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Jedoch konnte bei der Anwendung der obengenannten Verfahren nicht
die Bildung von sekundären Antikörpern im Serum vermieden werden.
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Nach der vorliegenden Erfindung wird ein verbessertes Antiserum, welches
HCG-Antikörper zur Verwendung in immunologischen Schwangerschaftsuntersuchungen
enthält,
hergestellt durch wiederholte intramuskuläre Injektion von HCG bei- Tieren -und
Gewinnung des gebildeten Anti-HCG-Serums 1 bis 3 Wochen nach der letzten Injektion,
wobei zwei Injektionen mit einer unter 1000 1. E./kg Körpergewicht liegenden Einzeldosishöhe
vorgenommen werden.
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Für diesen Zweck geeignete Tiere- sind Säugetiere, wie Kaninchen 'und
Pferd. ' -Vorteilhaft werden bei einem Kaninchen zwei Injektionen mit je 1500 I.
E. und bei einem Pferd zwei Injektionen mit je 7500 I. E. vorgenommen.
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- -Zur. Verwendung bei Schwangerschaftsuntersuchungen kann das Antiserum
dieser Erfindung, frei von mikrobischer Verunreinigung, gewonnen und in Ampullen
dargeboten werden. Das Antiserum wird zweckmäßigerweise gefroren- gelagert, beispielsweise
bei -20° C. Wahlweise kann das Antiserum in Ampullen gefriergetrocknet werden und
zur Durclifühtung- der Untersuchung verwendungsfähig gemacht werden. Zur Verwendung
bei einer Haemab glutinations-Schwangerschaftsuntersuchung kann es zusammen mit
einer äquivalenten Menge HCG-sensitivierter roter, Blutkörperchen gefriergetrocknet
werden, wie dies in der belgischen Patentschrift 605 826 beschrieben-ist.
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Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung: - Kaninchenäntiserum
. Kaninchen von ungefähr 2 -kg G'ewic'ht werden intramuskulär in- die Weiche
mit -1500 Einheiten HCG (Leo) in 0,5 ml Kochsalzlösung, gemischt und homogenisiert
mit einem gleichen Volumen unvollständigem Freund-Hilfsmittel, injiziert. Ein solches
Hilfsmittel umfaßt ein Wasser-in-Öl emulgiertes System, in welchem die wäßrige:Komponente
Antigen enthält und das Öl ein Mineralöl, wie beispielsweise Paraffin ist. Die Injektion
wurde 28 Tage später wiederholt. Den Tieren wurde 10 bis 14 Tage später Blut entnommen,
das Serum abgetrennt und bei -20° C gelagert. Die Titer des nach diesem Verfahren
erhaltenen Serums lagen zwischen 1/2ooo und 1/sooo bei einer Haemagglutinationsreaktion
mit HCG-sensitivierten Zellsuspensionen.
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Pferdeantiserum Ein Pferd von ungefähr 600 kg Gewicht wurde intramuskulär
im Hals mit 7500 Einheiten HCG (Leo) in 2,5 ml Kochsalzlösung, gemischt und homogenisiert
mit einem gleichen Volumen unvollständigem Freund-Hilfsmittel, injiziert. Die Injektion
wurde 28 Tage später wiederholt. Dem Pferd wurde 2 Wochen später Blut entnommen,
das Serum abgetrennt und bei 4° C gelagert. Das Serum wurde mit 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin-lactat
(»Rivanol«) behandelt, die Ausfällung von nicht spezifischen Haemagglutininen und
anderen unerwünschten Proteinen entfernt, wodurch der gewünschte HCG-Antikörper
in Lösung zurückblieb. Das behandelte Antiserum wurde bei 4° C gelagert. Die Titer
des durch dieses Verfahren erhaltenen Serums lagen zwischen 1/l0 ooo und 1/2o ooo
bei einer Haemagglutinationsreaktion mit HCG-sensitivierten Zellsuspensionen.
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Wenn verschiedene Antisera mit HCG-sensibilisierten Blutkörperchen
auf spezifische Antikörper und mit NHS-sensibilisierten Blutkörpdrchen auf ünspe=
zifische Antikörper untersucht werden, zeigt der Vergleich der Ergebnisse die relative
Menge der anwesenden Antikörper.
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Im nachfolgenden werden die Ergebnisse der Untersuchungen aufgeführt.
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Ein Antiserum, welches unter Verwendung von Kaninchen hergestellt
wurde, wobei diesen Kaninchen zwei Dosen von 1500 Einheiten HCG in Freundscher Lösung
im Abstand von 28 Tagen verabfolgt worden waren, hatten folgende relative Titer:
| Titer |
| HCG-Zellen ..................... 1/sooo |
| NHS-Zellen ..................... 1/20o |
Nach einer weiteren Dosis Antigen wie oben ergibt sich folgendes Bild:
| Titer |
| HCG-Zellen ...................... 1/sooo |
| NHS-Zellen ..................... 1/soo |
Nach einer weiteren Dosis Antigen ergibt sich folgendes Bild:
| Titer |
| HCG-Zellen ..................... 1/500o |
| NHS-Zellen ..................... 1/looo |
Da die Antikörpermenge umgekehrt proportional zu den Titerwerten ist, ergibt sich
hieraus, daß durch weitere Injektionen lediglich die Konzentration der spezifischen
Antikörper erhöht wurde.
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Im Falle von Pferde-Antisera würde gdfunden, daß zwei Dosen von 7500
Einheiten HCG, die in einem Abstand von 28 Tagen verabfolgt wurden, Antisera mit
den folgenden Merkmalen ergaben:
| Titer |
| HCG-Zellen ..................... 1/2o ooo |
| NHS-Zellen ..................... 1/5o |
Es wurde gefunden, daß dieses Antiserum das geringste bekannte Verhältnis von spezifischen
zu unspezifischen Antikörper ergab.