DE1648999C3 - Verfahren zur immunochemischen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern - Google Patents

Description

° 4

£ hsWiche Zweifel an der Genauigkeit der erhältlichen ren, vor der Bestimmung dieses Musters von den

e_ Ergebnisse zu. Trägerteilchen abgetrennt Der Vorteil dieser

IgJ₁ Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Arbeitsweise geht aus dem folgenden Beispiel

eia Verfahren zu schaffen, mit dem sich Antigene und hervor:

£. Antikörper in flüssigen Probe» auch dann sicher nach- 5 Zur Bestimmung von HCG im Serum einer f| weisen lassen, wenn sie nur in geringer Konzentration schwangeren Frau werden 0,025 ml Serum mit ψ vorhanden sind, und mit dem sich gleichzeitig der 6 ml eines geeigneten Puffers vermischt Za dem £ Einfluß störender Faktoren ausschalten läßt Gemisch werden 0,2 ml verdünntes Antiserum § Diese Aufgabe wird erfmdungsgernäß dadurch ge- und 0,3 ml einer Suspension von sensibilisierten "' löst, daß man bei einem Verfahren der eingangs be- ίο Erythrocyten zugefügt. Nach Inkubation des Reschriebenen Art den Träger aus dem Reaktioiis- aktionsgemisches werden die Erythrocyten wiegemisch abtrennt und ihn, gegebenenfalls nach vor- der isoliert und auf die oben beschriebene Weise herigem Auswaschen, in einem geeigneten flüssigen behandelt
*■ Medium suspendiert, worauf man das Sedimentationsmuster des Trägers abliest 15 Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Ver-■ΐ Die Abtrennung des Trägers von den übrigen Be- fahrens kann erhöht werden, wenn man in das Vers standteilen des Reaktionsgemisches hat gegenüber fahren vor der Zugabe der sensibilisierten Trägerteildem bisherigen Verfahren, bei dem das Resultat vom chen eine Inkubation der Testflüssigkeit und der Anti-Träger abgelesen werden mußte, solange dieser noch serumlösung einschaltet Ein Bebrüten über Nacht bei in Kontakt mit den anderen Verbindungen der Test- so Kühlschranktemperatur (oder von zwei Stunden bei flüssigkeit stand, folgende Vorteile: Raumtemperatur) ist ausreichend. Durch diese sogenannte Voiinkubation kann die Empfindlichkeit des Verfahrens mindestens auf das Doppelte erhöht 1. Die Erfordernisse beim Ablesen der Versuchs- werden.

ergebnisse bringen eine gewisse Begrenzung des 35 Nach der immunochemischen Reaktion kann der Maximalvolumens für das Reaktionsgemisch mit Träger auf übliche Weise, beispielsweise durch Filtrasich. So ist beispielsweise bei der Schätzung von tion, von dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden, HCG mittels der von Wide (s. oben) beschrie- jedoch wird er vorzugsweise abzentrifugiert, da hierbenen Reaktion zur Haemagglutinationsverhin- durch eine rasche und völlige Trennung zu erreichen derung das Volumen der Reaktionsflüssigkeit 30 ist Er wird dann zweckmäßigerweise ausgewaschen begrenzt durch den Absetzprozeß der Erythrocy- und in einem kleinen Volumen Flüssigkeit resuspenten, der innerhalb einer vernünftigen Zeit beendet diert. Man läßt ihn dann in einem Röhrchen mit runsein muß. Beim Glasplattentest darf das VoIu- dem Boden sich absetzen, worauf man aus dem Sedimen des Reaktionsgemisches nur ein paar Trop- mentationsmuster das Resultat der Reaktion ablesen fen betragen, die auf der Glasplatte gehalten 35 kann.

werden können. Als Träger bei Anwendung des erfindungsgemäßen

Dagegen steht bei dem erfindungsgemäßen Ver- Verfahrens können alle Arten von bekannten Trägern

fahren für die Reaktio- zwischen den verschie- dienen, jedoch sind Erythrocyten und Latexteilchen

denen Komponenten ein wesentlich größeres besonders gut geeignet.

Volumen als das zum Ablesen des Resultates 40 Das Verfahren eignet sich zum Nachweis von Antinotwendige zur Verfügung. So werden beispiels- körpern gegen verschiedene Antigene, ζ. B. von Antiweise bei der Bestimmung des LH, das im Urin körpern gegen pathogene Bakterien, wie sie im Urin meist in geringen Konzentrationen auftritt, 6 ml in geringen Konzentrationen zu finden sind. Es ist Urin vermischt mit 0,2 ml verdünntem Antiserum nunmehr auch möglich, Antigene und Antikörper zu HCG, das immunochemisch eine »Überkreuz- « nachzuweisen, die im Serum in so niedrigen Konzen-Reaktion« mit dem LH eingeht, und 0,2 ml an trationen vorkommen, daß sie sich bisher der Bestimmit HCG sensibilisierten Erythrocyten. Die Re- mung in verdünnten Sera entzogen haben, wobei jeaktion zwischen Antigen und Antikörper verläuft doch die Verdünnung notwendig ist, um eine Störung während einer dem Vermischen der Reagenzien bei der Agglutinierung zu verhindern,
folgenden Inkubation. Die Erythrocyten werden 50 Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung des dann, vorzugsweise durch Zentrifugieren, von erfindungsgemäßen Verfahrens,
dem übrigen Teil des Reaktionsgemisches abgetrennt, gegebenenfalls in 0,5 ml eines geeigne- . · « «
ten Puffers suspendiert und in ein Röhrchen mit Beispiel 1
eir^m vollkommen regelmäßigen runden Boden 55 Bestimmung von
überführt. Man läßt nun die Suspension sin bis menschlichem chorionischem Gonadotropin
zwei Stunden stehen, worauf man das Sedimen- (chorionic gonadotropin) (HCG)
tationsmuster ablesen kann (s. L. Wide, Acta

Endocrin. [1962], Suppl.70). Während mit der Es wird ein Phosphatpuffer mit einem pH-Wert ursprünglichen Methode etwa hundert Einheiten 60 von 7 und folgender Zusammensetzung hergestellt:

HCG je Liter bestimmt werden können, lassen Je Liter:
sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zehn

Einheiten (oder sogar weniger) an HCG je Liter 2 g Äthylendiamintetraacetat (EDTA)

bestimmen.

₆₅ 2 g Na₂HPO₄

2. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden 0 72 g KH PO

die Verunreinigungen der Testflüssigkeit, die ' * *

unter Umständen das Sedimentationsmuster stö- 1,125 g NaCl

Nach Zugabe von 0,1«/« (Gewicht/Volumen) Rin- lumen) Erythrocyte^ sensibitesiert mit HCG, werden

derserumalbumin zu dem Puffer werden damit eine einer Inkubation von 30 Minuten bei 37° C unter-

Reihe von HCG-Vecdünnungen bereitet Zu 6 ml worfen. Das Gemisch wird dann zentrifugiert und die

jeder HCG-Lösung werden 0,2 ml Antiserum für Erythrocyten einmal mit O,9^e/oiger Kochsalzlösung ge-

IJCG hinzugefügt, die auf die gewünschte Stärke ver- 5 waschen und dann wieder in Phosphatpuffer suspen-

dünnt sind mit einem ZUrat|*jffer vom pH 6,5, der im diert Die Suspension wird in eine Ampulle mit run-

Liter9gNaCl,40gNatriumzitrat-2H20undO,l^e/o dem Boden überführt. Nach zwei Stunden Stehen RiadeEserumalbumin enthält; außerdem gibt man läßt Mch das Sedimentationsmuster feststellen.

0,2 ml einer l,75°/oigen (Volumen/Voluiaen) Suspen- Die LH-Konzentration des Urins wird ausgedrückt

sion von Etytbrocyten, sensibilisiert mit HCG im io in internationalen Einheiten (I. U.) LH im Liter. Das

Phosphatpuffer, zu. Nachdem das Gemisch 30 Minu- LH kann bestimmt werden in Konzentrationen von

tem bei 37° C einer Inkubation unterworfen wurde, 251. U. LH je Liter oder höher. Durch dieses Verfah-

wiird es 10 Minuten mit etwa 2000 Umdr./Min. zen- ren kann der Anstieg in der LH-Sekretion, der etwa

triftigiert Die Erythrocyten werden mit O,9°/oiger gleichzeitig mit der Ovulation stattfindet, bestimmt

Kochsalzlösung gewaschen, worauf sie in Phosphat- 15 werden, ohne daß der Urin konzentriert werden muß. puffer aufgenommen und zu einem Gesamtvolumen

vom 0,5 ml resuspendiert werden. Die Suspension wird , . . .

in eine Ampulle mit rundem Boden überführt. Nach B e1sp1e14

2 Stunden kann man das Sedimentationsmuster fest- Bestimmung von Luteinisierungshormon (LH)

stellen. Durch diese Methode können noch 10 inter- »ο J_1n Jj_nJ_{n von s}terilen Patienten nationale Einheiten HCG je Liter bestimmt werden.

Die Empfindlichkeit der im Beispiel 3 beschriebenen Bestimmung kann erhöht werden durch Inku-

Beispiel 2 bation der Testflüssigkeit mit Antiserumlösung vor

r, ^. ,,. , „, , , as Zugabe der Suspension von sensibilisierten Erythro-

Bestimmung von menschhchem Wachstumshormon ³S ^⁰^ _s^_nanMe Vorinkubation kann über

v^HUH' Nacht zwischen 0 und 10° C stattfinden. Das Ver-Von der Aufbereitung des Wachstumshormons fahren wird dann gemäß Beispiel 3 weitergeführt. Das wird eine Reihe von Verdünnungen bereitet, die in LH kann in Konzentrationen von 10 I. U. je Liter dem phosphatpufferhaltigen Rinderserumalbumin ge- 30 oder höher bestimmt werden, wobei man das zweite maß Beispiel 1 untersucht werden. (2nd) IRP-HMG (s. Beispiel 3) als Standard nimmt. Zu 6 ml der jeweiligen Verdünnung werden 0,2 ml Diese Methode mit ihrer hohen Empfindlichkeit kann Antiserum gegen HGH in Zitratpuffer (entsprechend benutzt werden zur Diagnose, wenn es um die EntBeispiel 1) und 0,2 ml einer Suspension von Erythro- scheidung geht, ob ein Fall von Sterilität seinen Grund cyten, sensibilisiert mit HGH (l,75°/oVolumen/Vo- 35 in der Hypophyse oder im Ovarium hat lumen) in Phosphatpuffer, hinzugefügt. Das Gemisch

wird einer 30 Minuten langen Inkubation bei 37° C R-IS

unterworfen, worauf die Erythrocyten abgetrennt, mit Beispiele

physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie- Bestimmung von menschlichem Serumalbumin (HSA) der in Phosphatpuffer aufgenommen und suspendiert 4»

werden, so daß man ein Gesamtvolumen von 0,5 ml Gemäß Beispiel 1 wird eine Reihe von Verdünnunenthält Die Suspension wird dann in eine Ampulle gen der zu untersuchenden HSA-Aufbereitung in dem mit rundem Boden überführt und nach zwei Stunden Phosphatpuffer mit 0,1 %> Rinderserumalbumin her-Stehen kann das Sedimentationsmuster abgelesen gestellt Zu 4 ml jeder HSA-Verdünnung werden werden. 45 0,2 mi eines sorgfältig verdünnten Kaninchen-Anti-Die Aktivität der untersuchten Zubereitung von HSA-Serums zugefügt. Man läßt das HSA und das Wachstumshormon betrug 1,5 U je mg. Es hatte den Antiserum während einer Inkubationszeit von 20Stun-Anschein, daß sich HGH noch in einer Konzentration den bei 5° C miteinander reagieren. Zu dem Reakvon 15 m. U. oder 10 μg je Liter nachweisen und be- tionsgemisch fügt man 0,2 ml einer Suspension von stimmen läßt so Schafsblut-Erythrocyten zu. die gemäß L. Wide,

Acta Endocrin, Supplement 70 (1962) mit Formalin Beispiel 3 _untj Tannin behandelt und mit HSA sensibilisiert Bestimmung von Luteinisierungshormon (LH) ^w<?^rde" ⁸S?'*"* ²J*"¹* dieser Erythrocyten er-

im Urin einer Frau mit normalem Menstruations- ^f?^l& die Weiterbehandlung nach Beispiel 1 Die bei

_klus 55 diesem Ansatz erreichbare Empfindlichkeit betragt

^y 2,5 μg je Liter. Durch Erhöhung des Volumens der

Von dem zu untersuchenden Urin wurden folgende Testflüssigkeit von z. B. 4 ml auf 8 ml kann man die

Verdünnungen hergestellt: unverdünnt, 1:2, 1:4, Empfindlichkeit entsprechend steigern. 1:8 und 1:16. Die Verdünnungen wurden mit einem Phpsphatpuffer gemäß Beispiel 1 mit 0,1 °/o Rinder- öo

serumalbumin bereitet. Außerdem wurde eine Stan- Beispiel 6

dardserie der »Second International Reference Pre- Bestimmung von menschlichem chorionischem

£? ^TTmn tSLES™ ?^eu M^P^SOAadotroP¹¹¹ (chorionic) Gonadotropin (HCG) in Serum

(2nd IRP-HMG) im gleichen Puffer in den Konzen- ^v

trationen 0, 12, 18, 25 und 35 internationale Einhei- 65 Zu dem Serum einer gesunden Frau werden 0,1, 2, ten je Liter hergestellt. 6 ml Testflüssigkeit mit 0,2 ml 3 und 6 I. U. HCG je ml hinzugegeben und das Geeiner Verdünnung von Antiserum gegen HCG und misch auf das 240fache mit dem Phosphatpuffer aus 0,2 ml einer Suspension von l,75%(Volumen/Vo- Beispiel 1 verdünnt. Dann werden zu 6 ml des ver-

dünnten Serums 0,2 ml einer Lösung von Antiserum in Zitratpuffer (s. Beispiel 1) und 0,3 ml einer Suspension von 3,5¹Vo (Volumen/Volumen) Erythrocylen zugesetzt.

Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 37° C wird das Gemisch zentrifugiert, worauf die Erythrocyten mit Phosphatpuffer gewaschen und schließlich in dem Puffer auf ein Volumen von 1,5 ml suspendiert werden. 0,5 ml der Suspension werden in eine Ampulle mit rundem Boden überführt. Nach zwei Stunden wird der Erfolg der Reaktion abgelesen. Auf diese Weise lassen sich 3 I. U. HCG je ml Serum nachweisen.

Beispiel 7
Verwendung eines Spezialversuchsröhrchens

Die in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Nachweise werden durchgeführt in einem Röhrchen aus Glas oder Kunststoff mit vollkommen regelmäßig rundem, transparentem Boden, einem Innendurchmesser von 11 mm und einer Länge von 10 bis 11 cm; das Röhrchen muß stark genug sein, um die beim Zentrifugieren auftretenden Kräfte auszuhalten und so geformt sein, daß es leicht mit einer abnehmbaren Kappe verschlossen werden kann, so daß die gewaschenen und wieder suspendierten Erythrocyten nicht in ein anderes Gefäß überführt werden müssen.

Beispiel 8

Bestimmung von
menschlichem chorionischem Gonadotropin (HCG)

mit Hilfe einer Agglutionierungs-Verhinderungsreaktion unter Verwendung von Latex

»Bacto-Latex« (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) wird, wie in Beispiel 1 der niederländischen Palentanmeldung 6 504 823 vom 15. April 1965 beschrieben, mit HCG sensibilisiert. 2 ml des Phosphatpuffers nach Beispiel 1 mit einem Gehalt an 0,1 °/o Rinderserumalbumin, worin das HCG in Konzentrationen zwischen 20 und 200 I. U. je Liter gelöst wurde, werden vermischt mit 0,03 ml (einem Tropfen) einer Antisenimlösung in Zitratpuffer (s. Beispiel 1) und 0,03 ml (einem Tropfen) einer Latexsuspension. Das Reaktionsgemisch wird einer Inkubation von 30 Minuten bei 37° C unterworfen. Der Latex wird durch Zentrifugieren vom übrigen Reaktionsgemisch

ao abgetrennt undl so viel davon in dem Phosphatpuffer mit 0,1⁰Ai Ririderserum suspendiert, daß das Endvolumen 0,1 ml beträgt. Die Suspension wird au! einer Glasplatte zu einer Kreisfläche von etwa 3 cm Durchmesser ausgebreitet. Die Platte wird untei

as leichtem Neigen von einer Seite zur anderen langsair in Rotation versetzt. Nach 3 Minuten stellt es sich heraus, ob ein Agglutinieren eingetreten ist oder nicht Auf diese Weise lassen sich noch Mengen vor 50 internatiomilen Einheiten im Liter bestimmen.

50963»

Claims (1)

1. y stellt in ein Gestell nät einem schwenkbaren Spiegel,

   Patentanspruch: der den Boden des Röhrcheris reflektiert. Während

   , etwa 60 bis 90 Minuten läßt man die Erythrocyten

   Verfahren zur immu. lochemischen Bestimmung sich absetzen; sie bilden dann ein typisches Sedimenvon Aotigenen oder Antikörpern in einer flüssi- 5 tationsraus&r am Boden des Röhrchens, das ausgegen Probe, worin sie in geringer Konzentration wertet werden kann.

   enthalten oder von störenden Faktoren begleitet Ein anderes Beispiel ist die Bestimmung des Rheu-

   φιά, bestehend aus folgenden Einzelstufen: Ad- mafaktors nach der Methode von J. M. Singer und sorbierea einer der Komponenten der immuno- C. M. Plotz (Am. J. Med. 21 [1950], S. 888). chemischen Reaktion auf einem Träger und Um- io 0,5 ml einer Suspension von PolystyroI-LatexteUchen setzen dieser Komponente oder beider Kompo- (Durchmesser 0,8 μ), sensibilisiert mit menschlichem nenten der immunochemischen Reaktion mit der y-Globuiin, wird vermischt mit dem gleichen Volumen zu untersuchenden Flüssigkeit, dadurch ge- an gegebenenfalls verdünntem Testserum. Nach Inkennzeichnet, daß man den Träger aus dem kubation bei 56° C und dann bei 4° C wird das Röhr-Reaktionsgemisch abtrennt und ihn, gegebenen- 15 chen mit dem Reaktionsgemisch einige Zeit bei einer falls nach vorherigem Auswaschen, in einem ge- gewissen Umdrehungszahl zentrifugiert. Für das Reeigneten flüssigen Medium suspendiert, worauf sultat ist die Trübung der überstehenden Flüssigkeit man das Sedimentationsmuster des Trägers abliest. maßgebend.

   Das letzte Beispiel, nämlich der Nachweis von

   ao HCG in Urin mittels Latexteilchen, an welche das Hormon adsorbiert wird, ist beschrieben in der niederländischen Patentanmeldung 6504 823 vom

   15. April 1965. Bei diesem Test werden ein Tropfen der zu untersuchenden Flüssigkeit, ein Tropfen ver-

   35 dünntes Antiserum zu HCG und ein Tropfen einer Suspension des sensitivierten Latex auf einer Glas-

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur immuno- platte vermischt. Das Resultat kann abgelesen werehemischen Bestimmung von Antigenen oder Anti- den, nachdem die Glasplatte einige Minuten gerüttelt körpern in einer flüssigen Probe, worin sie in geringer wurde.

   Konzentration enthalten oder von störenden Faktoren 30 Diese Methoden liefern brauchbare Resultate, wenn begleitet sind, bestehend aus folgenden Einzelstufen: das zu bestimmende Antigen (bzw. die Antikörper) in Adsorbieren einer dsr Komponenten der immuno- der Testflüssigkeit in ausreichender Konzentration chemischen Reaktion auf einep Träger und Umsetzen vorhanden sind und andere Komponenten die Reakdieser Komponente oder beider Komponenten der tion nicht stören. Trifft eine von diesen Bedingungen irnmunochemischen Reaktion mit der zu untersuchen- 35 nicht zu, so versucht man gewöhnlich, die zu unterden Flüssigkeit. suchende Flüssigkeit einer Konzentration oder Frak-

   Zum Nachweis oder der Schätzung von Antigenen tionierung zu unterwerfen.

   oder Antikörpern gibt man bekanntlich die für die Ein Beispiel hierfür ist die Fraktionierung der Sera

   immunochemische Reaktion notwendigen Kompo- von Patienten, die an rheumatoider Arthritis leiden, inenten in geeigneten Volumina zusammen, worauf in 40 wobei der Rheumafaktor bestimmt wird. Eine Überdem Gemisch die Reaktion verläuft und daraus dann sieht über diese Methoden wird gegeben von das Resultat abgelesen wird. So wird beispielsweise K. J. Bloch (Bull. Rheum. Dis. 9 [1959], S. 185).
   ibei der Bestimmung der ABO-Blutgruppe ein Tropfen J. M. Dominguez und O.H.Pearson haben

   einer Suspension von Erythrocyten in einem Reagenz- eine Bestimmung von Wachstumshormon in fraktioglas oder auf einer Glasplatte mit einem Tropfen des 45 nierten menschlichen Sera mit Hilfe der Reaktion zur zu untersuchenden Serums gemischt. Nach einer In- Haemagglutinationsverhinderung beschrieben (siehe kubation von einer Stunde bei Raumtemperatur J. Clin.Endocr. Metab. 22 [1962], S. 865). Die Autowird die Reaktion ausgewertet ren stellen fest, daß durch die Fraktionierung die Fak-Auf gleiche Weise wird der Gehalt an Antikörpern toren, welche die Reaktion stören, von dem zu begegen Thyroglobulin idi Serum von Patienten, die an 50 stimmenden Hormon abgetrennt werden, wobei das der Hashimotoschen Krankheit leiden, mit Erythro- letztere gleichzeitig konzentriert wird,
   cyten bestimmt, welche nach der Methode von Andere Beispiele sind die Methoden der Urinkon-S. V. Boyden, beschrieben in J. Exp. Med. 93 zentration mr Bestimmung des Luteinisicrungshor-(1951), S. 107, mit Tannin behandelt wurden und mons (luteinizing hormone) (LH),
   dann mit Thyroglobulin sensibilisiert worden sind. SS Neben biologischen LH-Bestimmungen in Urin-Ein Tropfen des zu untersuchenden verdünnten extrakten wurden in den vergangenen Jahren die im-Serutns wird auf einer Glasplatte vermischt mit einem munochemischen Methoden entwickelt, z. B. durch Tropfen sensibilisierter Erythrocyten. Das Gemisch L. Wide (Acta Endocrin. [1962], Suppl. 70) und wird 10 Minuten in Rotation gehalten, worauf das durch D. R. Mishell (Am. J. Obst Gyn. 95, S. 747 Resultat abgelesen wird. &> [1966]).

   L. Wide beschreibt in Acta Endocrin. (1962), Alle von anderen Gebieten übernommenen Metho-

   Suppl. 70, die Bestimmung von menschlichem chorio- den zur Konzentration von LH haben gewisse Nachnischem Gonadotropin (chorionic gonadotropin, teile, von denen einer darin besteht, daß während der HCG) mittels des Testes zur Haemagglutinationsver- Behandlung der Testflüssigkeit Hormon verloren Minderung. Urin (0,4 ml) wird in einem Röhrchen mit 65 gehen kann. Ein weiterer Nachteil all dieser Verfahrundem Böden mit einem Tropfen verdünnten Anti- ren besteht darin, daß zusammen mit dem Hormon serum und einem Tropfen einer Suspension von auch etwa vorhandene störende Substanzen konzen-Erythrocyten vermischt. Das Röhrchen wird einge- triert werden. Diese Unvollkommenheiten lassen er-