DE2651139A1

DE2651139A1 - Reagens zur durchfuehrung eines direktagglutinationstests zum schwangerschaftsnachweis und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2651139A1
Application number: DE19762651139
Authority: DE
Inventors: Gail Hoff; Metka Prevorsek
Original assignee: Warner Lambert Co LLC
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1976-06-01
Filing date: 1976-11-09
Publication date: 1977-12-15
Also published as: NO148200C; AR210183A1; NL7613350A; DE2651139B2; NO763966L; FR2353858A1; NO148200B; FR2353858B1; DK574776A; BE849085A; LU76374A1; DK142513B; JPS52148618A; AU505765B2; SE422501B; IE44204B1; IE44204L; IT1066737B; CH631266A5; AT349650B

Description

Warner-Lambert Company Möhlstraße 37

D-8000 München

Morris Plains, N.J., V.St.A.

Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkld Telegramme: ellipsoid

Ε NOV. 1976

Reagens zur Durchführung eines Direktagglutinationstests zum Schwangerschaftsnachweis und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Direktagglutinations te streagens zum Schwangerschaftsnachweis in Form einer Suspension von Polystyrollatexteilchen, die mit einer Globulinfraktion eines Antiserums gegen Human-Choriongonadotropin (HCG) sensibilisiert sind. Beim Vermischen mit HCG enthaltendem Urin oder Blutserum agglutiniert dieses Reagens und stellt damit einen positiven Befund für eine bestehende Schwangerschaft sicher.

Direktagglutinationstests, die die Grundlage der vorliegenden Erfindung bilden, sind ebenso wie die Theorie, nach der sie arbeiten, bekannt. Aus der US-PS 3 171 783 sind derartige Diagnosetests bekannt, aaO heißt es jedoch, daß sie zum Gebrauch wegen fehlender Empfindlichkeit nicht zu"empfehlen sind.

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Die vorliegende Erfindung hat nun zahlreiche der bekannten Schwierigkeiten gelöst. Wenn der Schwangerschaftsnachweis durch Direktagglutination in der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Weise erfolgt, lassen sich auch hierbei die den klassischen Agglutinationsverfahren eigenen Eigenschaften, nämlich einfache Durchführbarkeit und Genauigkeit, realisieren. Weiterhin ist der gemäß den Vorschlägen der Erfindung durchgeführte Schwangerschaftsnachweis 100 bis 600% empfindlicher als die mit einschlägigen handelsüblichen Reagentien durchgeführten bekannten Direktagglutinationstests. Es hat sich insbesondere gezeigt, daß das erfindungsgemäß einen Teil des Reagenssystems bildende spezielle Puffersystern in höchst unerwarteter Weise falsche positive Befunde auf ein Mindestmaß verringert. Es hat sich ferner gezeigt, daß sich unter Benutzung der erfindungsgemäßen Vorschläge der Schwangerschaftsnachweis mit der denkbar einfachsten Vorrichtung rasch und genau durchführen läßt.

Human-Choriongonadotropin (HCG) findet sich im Blut und im Urin schwangerer Frauen. Dieses Hormon bildet sich im Laufe der Fötusbildung und erreicht seinen höchsten Gehalt etwa am 50. bis 90. Tag nach dem ersten Tag des letzten Menstruationszyklus. Der Nachweis von HCG als positiver Befund einer Schwangerschaft ist erfindungsgemäß etwa vom 40. Tag an möglich.

Erfindungsgemäß läßt sich der Schwangerschaftsnachweis durch einfache Agglutination einer Suspension von Polystyrollatexteilchen einer Teilchengröße im Bereich von 0,15 bis 0,9, vorzugsweise 0,36 Mikron, die mit einer Globulinfraktion eines Antiserums gegen HCG sensibilisiert worden

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ist, führen, indem man den Latex mit dem Serumglobulin etwa 2 h lang in Wasser inkubiert und dann ein gleiches Volumen einer schwachen Säurelösung, die unter Verwendung eines 0,5m-Piperazindihydrochlorid/NaOH-Puffers mit pro 5000 Teile Puffergemisch 0,0025 bis 0,1-, vorzugsweise 0,02m-Glycin, 6% NaCl und einem Teil Merthiolat auf einen pH-Wert von 6,4 gepuffert ist, zusetzt. Das Puffergemisch kann anstelle des Glycins gleiche Mengen Glycylglycin enthalten.

Es wurden bereits die verschiedensten Vorschläge hinsichtlich Direktagglutinationstests zum Schwangerschaftsnachweis gemacht, in der Regel handelte es sich hierbei jedoch um eine Fehlbezeichnung. Gemäß den Lehren der US-PS 3 171 werden mit HCG-Antiserum imprägnierte Agarplatten verwendet. Bei der Durchführung des bekannten Verfahrens wird eine unbekannte Urinprobe durch Adsorption an Kaolin konzentriert, worauf möglicherweise vorhandenes HCG eluiert und dann bekannte Agarbohrungs-Tests durchgeführt werden. Die Entwicklung auf der Agarplatte dauert 4 h.

Ein weiterer Test, der einfach und rasch durchzuführen sein soll, ist in der US-PS 3 309 275 beschrieben. Gemäß den Lehren dieser Literaturstelle wird ein Latex mit HCG durch 4- bis 6-wöchiges Erhitzen des mit HCG gemischten Latex sensibilisiert. Jegliches in einer Urinprobe vorhandene HCG neutralisiert beim Vermischen mit bekannten Mengen HCG-Antiserum das Anti-HCG, wenn die Frau, von der die Urinprobe stammt, schwanger ist. Bei der Durchführung des in der zuletzt genannten Literaturstelle beschriebenen Tests erfolgt im Falle einer Schwangerschaft keine Agglutination des Latex.

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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen:

Beispiel 1

Kaninchen-Anti-Human-Choriongonadotropin-Globulin:

Gegen HCG vorsensibilisierten Kaninchen wird eine bestimmte Menge Blut abgezapft. Das gewonnene Blut wird dann bei Raumtemperatur gerinnen gelassen, worauf das Serum aus dem Gerinnsel entfernt und auf eine Temperatur von 4⁰C gekühlt wird. Sämtliche bei der Zubereitung verwendete. Reagentien werden ebenfalls auf eine Temperatur von 4⁰C gekühlt.

Das Serum wird durch Zugabe einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung fraktioniert. Deren Menge ist so groß, daß man nach beendeter Zugabe (der gesättigten Ammoniumsulfatlösung) eine 40#ige Ammoniumsulfatlösung vorliegen hat. Der Niederschlag, der sich bei Zugabe des Ammoniumsulfats bildet, enthält Anti-HCG. Dieser wird von der später zu verwerfenden überstehenden Flüssigkeit durch Filtrieren, Zentrifugieren und dergleichen abgetrennt. Dann wird der gesammelte Niederschlag erneut in einer Waschlösung von hO% gesättigten Ammoniumsulfats suspendiert, um sämtliche Spuren von Verunreinigungen in Form der vorher vorhandenen Flüssigkeit zu entfernen. Nach erneuter Sammlung des Niederschlags wird dieser in einer 0,85 gew.-96igen Natriumchloridlösung in einer solchen Menge gelöst, daß eine Anti-HCG-Konzentration von etwa 40% seiner ursprünglichen Konzentration im Gesamtserum erreicht wird. Diese Lösung wird

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durch Dialysieren gegen eine 0,85%ige Natriumchloridlösung weiter gereinigt. Das erhaltene Dialysat kann sofort verwendet oder zum zukünftigen Gebrauch bei einer Temperatur von -20⁰C eingefroren werden.

Beispiel 2

296ige Polystyrollatexsuspension:

Polystyrollatexteilchen einer Teilchengröße zwischen etwa 0,15 und 0,9 Mikron werden in der gewünschten Konzentration in einer ausreichenden Menge destillierten Wassers suspendiert. Obwohl nicht zwingend erforderlich, ist es von Vorteil, die Konzentration durch kolorimetrische Standardisierung sicherzustellen.

Beispiel 3
Anti-HCG-Latex-Reagens:

25 ml eines Piperazindihydrochlorid-Puffers eines pH-Werts von 6,4 mit O,02m-Aminoessigsäure, 6% Natriumchlorid und 1 : 5000 bis 1 : 15000 Merthiolat (Thimerosal) werden in 25 ml destilliertes Wasser eingetragen, worauf das Ganze auf eine Temperatur von 50⁰C erwärmt wird. Etwa 8 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten Anti-HCG-Globulins werden dann rasch mit 50 ml der gemäß Beispiel 2 zubereiteten Latexsuspension versetzt, worauf die Mischung etwa 2 h lang bei einer Temperatur von 56⁰C inkubiert wird. Nach beendeter Inkubation wird das Reagens mit etwa 0,5 bis etwa 20, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 396 Rohrzucker (sucrose) und

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etwa 0,1 bis etwa 20, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 1,096 Rinderserumalbumin versetzt. Nach gründlichem Durchmischen wird das Reagens auf eine Temperatur von 4⁰C gekühlt und bei dieser Temperatur gelagert. Das in der geschilderten Weise zubereitete Reagens ist bei einer Temperatur von 4°C bis zu 3 Jahren lagerfähig.

Das zur Ausfällung des HCG-Antiserums im Beispiel 1 verwendete gesättigte Ammoniumsulfat kann in einer solchen Menge zugesetzt werden, daß seine Endkonzentration in Kombination mit dem Serum zwischen 33 und 60, vorzugsweise 40 und 5096 Sättigungsgrad liegt.

Die im Beispiel 3 gewählte Inkubationstemperatur für den Latex von 56⁰C stellt zwar die bevorzugte Temperatur dar, die Inkubationstemperatur ist jedoch nicht kritisch und kann unter Berücksichtigung der Inkubationsdauer (kürzer bei höherer Temperatur bzw. länger bei niedrigerer Temperatur) nach beiden Seiten hin variiert werden.

Die im Beispiel 3 dem Latex zugesetzte Menge Anti-HCG wird derart gesteuert, daß die Teilchen gerade eben vollständig bedeckt sind. Hierdurch läßt sich die Notwendigkeit eines wiederholten Waschens zur Entfernung jeglichen Überschusses an nicht-adsorbiertem Globulin von dem Reagens vermeiden.

Das im Beispiel 3 in dem Reagenssystem verwendete Puffersystem gestattet eine Verwendung des Reagenses sowohl für Serumproben als auch beim üblichen Urintest. Weiterhin verringert es weitestgehend falsche positive Befunde in-

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folge von in den Seren enthaltenem Rheumafaktor. Schließlich ermöglicht es auch einen Schwangerschaftstest mit blut- oder eiweißhaltigen Urinproben.

Durch den Zusatz des Rohrzuckers und des Rinderserumalbumins im Beispiel 3 läßt sich das Reagens nicht nur hinsichtlich einer Unterscheidbarkeit positiver und negativer Befunde verbessern, sondern auch auf Karten auftragen und trocknen (wobei das Reagenssystem eine noch weiter verbesserte Stabilität bei Raumtemperatur erhält).

Beispiel 4

Getrocknete Testkarten:

50 Lamda der gemäß Beispiel 3 zubereiteten Reagenssuspension werden auf aus Glas, Kunststoffen, Pappe und dergleichen bestehende, wegwerfbare "Objektträger" verteilt. Dann wird das Reagens auf den Objektträgern bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die trockenen Prüflinge sind dann für den im Beispiel 5 geschilderten Schwangerschaftstest gebrauchsfertig .

Beispiel 5
Schwangerschaftstest:

Der von der Versuchsperson gesammelte Urin wird zur Entfernung von Verunreinigungen filtriert. Die Filtration erfolgt vorzugsweise mit der aus der US-PS 3 698 556 bekannten Vorrichtung. Man kann sich jedoch zum Filtrieren der Urinprobe auch anderer Filtrationsmaßnahmen bedienen.

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Ein Tropfen des filtrierten Urins wird auf einen klaren Glasobjektträger appliziert und mit einem Tropfen des gemäß Beispiel 3 zubereiteten Latexreagenses gemischt. Der Objektträger wird etwa 2 min lang schwach vor- und zurückgeschwenkt. Wenn die Urinprobe HCG enthält, bilden sich für das bloße Auge ohne weiteres unterscheidbare einzelne Latexteilchen oder -klumpen. Wenn das Urin kein HCG enthält, verändert der Latex seine gleichmäßige Suspensionsform nicht.

Anstelle des filtrierten Urins kann bei dem geschilderten Test selbstverständlich auch Serum verwendet werden. Anstelle des klaren Glasobjektträgers kann der Urin- oder Serumtropfen auch auf die gemäß Beispiel 4 hergestellten Testkarten aufgebracht werden. Hierdurch läßt sich die Notwendigkeit der Zugabe eines Tropfens des Latexreagenses vermeiden.

Der erfindungsgemäße Schwangerschaftstest wurde mit Urinproben von 215 schwangeren und 414 nicht-schwangeren Frauen durchgeführt, wobei es sich letztlich zeigte, daß eine Genauigkeit von 99,3% erzielt wurde.

Das erfindungsgemäße Testreagens bzw. Testsystem ist, wie das folgende Beispiel 6 ausweist, bereits bei etwa 1,0 IU oder HCG pro ml Urin empfindlich.

Beispiel 6

Vergleich mit mit handelsüblichen Testreagentien durchgeführten Schwangerschaftstests:

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13 handelsübliche Schwangerschaftstestreagentien werden hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit unter Verwendung bekannter Mengen von im Urin einer nicht-schwangeren Frau gelösten Human-Choriongonadotropin (HCG) getestet. 7 beruhen auf dem Prinzip einer Latexagglutinationsinhibierung (indirekter Objektträgertest), einer stellt ein auf demselben Prinzip beruhender Röhrchentest dar, 3 beruhen auf dem Prinzip einer passiven Hämagglutinationsinhibierung (HAI) und 3 (einschließlich des erfindungsgemäßen Testsystems) beruhen auf einer direkten Latexagglutination.

Human-Choriongonadotropin (HCG): Urinfreie Zubereitung A der Division Biological Standards, National Institute of Health, Bethesda, Maryland. Der Inhalt einer Phiole mit 5000 i.u. (internationalen Einheit) HCG wird in 5 ml destillierten Wassers gelöst, wobei man eine Konzentration von 1000 i.u./ml erhält. Unter Verwendung von filtrierten Urinproben nicht-schwangerer Frauen werden weitere erdünnungen auf Konzentrationen von 10 i.u./ml bis 0,6 i.u./ml zubereitet. Auf diese Weise erhält man bekannte Konzentrationen an HCG unterschiedlicher Größen.

Der von nicht-schwangeren Frauen gesammelte Urin wird durch handelsübliche Filterpapiere (Whatman 42 und DE81) filtriert. Ein aliquoter Teil jeder Urinprobe wird als negative Vergleichsprobe für den Schwangerschaftstest aufbewahrt. Der Rest wird zur Herstellung von HCG-Verdünnungen verwendet.

Die folgende Tabelle zeigt, daß die unter Verwendung des NIH-Standards ermittelte Empfindlichkeit auf HCG im Bereich von 0,6 bis 5 i.u./ml reicht.

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Al

Tabelle Empfindlichkeit von Schwangerschaftstest

Bezeichnung

Art

angegebene Empfindlichkeit (i.u./ml)

gefundene Empfindlichkeit (i.u./nil)

A
B
C
D
E
F
G
H
I

LDS¹

LIS"

LIS

LIT^:

LDS

erfindungsgemäß LDS

J
K
L

HAI HAI HAI

nicht festgestellt 1,5 - 2,5 2
3

3,5 - 2 - 2

0,75 0,75

3-4

2,5 2,5 2,5 2,5 1,25 - 2,5 1,25 - 2,5

<0,6 1,25 - 2,5

0,6 - 1,25 0,6 - 1,25

<0,6

Fußnoten:

1 Latex-Direktobjektträgertest

2 Latex-Indirektobjektträgertest

3 Latex-Indirektröhrchentest

4 Hämagglutinationsinhibierung (Röhrchentest)

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Claims

Patentansprüche

1. Flüssiges Reagens, das beim Inberührunggelangen mit Human-Choriongonadotropin enthaltenden Flüssigkeiten agglutiniert, dadurch gekennzeichnet, daß es einen polymeren Latexträger einer Teilchengröße von etwa 0,15 bis etwa 0,9 Mikron, der mit Kaninchen-Anti-Human-Choriongonadotropinserum beschichtet ist, enthält und mit Hilfe eines Puffers, der etwa 0,005 bis etwa 1,Öm-Piperazindihydrochlorid, Wasser und eine zur Gewährleistung des (gewünschten) gepufferten pH-Werts ausreichende Menge Natriumhydroxid enthält, auf einen pH-Wert von 5,0 bis etwa 8,6 gepuffert ist.

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einem Polystyrollatex einer Teilchengröße von etwa 0,36 Mikron besteht, daß es auf einen pH-Wert von 6,4 gepuffert ist und daß es ferner etwa 0,0025- bis etwa 0,1m-Aminoessigsäure_f etwa 1 bis etwa 10% Natriumchlorid und etwa 1 Teil Merthiolat pro 5000 Teile Reagens enthält.

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3. Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß

es O,Sm-Piperazindihydrochlorid/Natriumhydroxid-Puffer, O,02m-Aminoessigsäure und 6% Natriumchlorid enthält.

4. Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich etwa 2% Rohrzucker und etwa 0,596 Rinderserumalbumin enthält.

5. Flüssiges Reagens, das beim Inberührunggelangen mit Human-Choriongonadotropin enthaltenden Flüssigkeiten agglutiniert, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem Puffer system aus PiperazindihydroChlorid, Natriumhydroxid, Aminoessigsäure, Natriumchlorid, Merthiolat und Wasser polymere Latexteilchen einer Teilchengröße von etwa 0,15 bis etwa 0,9 Mikron, die mit Antihuman-Choriongonadotropinserum beschichtet sind, enthält und einen pH-Wert von etwa 5 bis etwa 8,6 aufweist.

6. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich etwa 0,5 bis etwa 20% Rohrzucker und etwa 0,1 bis etwa 20% Rinderserumalbumin enthält.

7. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es etwa 2% Rohrzucker und etwa 0,5% Rinderserumalbumin enthält.

8. Verfahren zur Zubereitung eines Reagenses, das beim Inberührunggelangen mit Human-Choriongonadotropin enthaltenden Flüssigkeiten agglutiniert, dadurch gekennzeichnet, daß man Kaninchen eine bestimmte Menge Human-Choriongonadotropin injiziert und die Kaninchen Antikörper gegen das Choriongonadotropin bilden läßt; einen Teil des Kaninchenbluts abzapft und das Blut in üblicher Weise

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gerinnen läßt; das Serum vom Blutkuchen trennt, den Globulinteil des Serums durch Zusatz einer etwa 35-bis 6O96igen Ammoniumsulfatlösung ausfällt, den Niederschlag zur Entfernung sämtlicher Spuren an (überstehenden) Verunreinigungen reinigt, den Niederschlag in einer physiologischen Kochsalzlösung (normal saline solution) löst, die erhaltene Globulinlösung mit Polystyrollatexteilchen einer Teilchengröße zwischen etwa 0,15 und 0,9 Mikron mischt, die erhaltene Mischung bei einer Temperatur von etwa 56°C inkubiert, etwa 0,005-bis 1m-Piperazindihydrochlorid-Puffer eines pH-Werts von etwa 5,0 bis 8,6, der 0,0025- bis O,1m-Aminoessigsäure und 1 bis 10 Gew.-% Natriumchlorid enthält, zusetzt, das erhaltene Gemisch nochmals eine bestimmte Zeit lang inkubiert und das Gemisch mit etwa 0,5 bis etwa 2096 Rohrzucker und etwa 0,1 bis etwa 20% Rinderserumalbumin versetzt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine bestimmte Menge des in der geschilderten Weise erhaltenen Reagenses auf wegwerfbare Objektträger appliziert und dann auf den Objektträgern trocknet.

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