DE1294310B

DE1294310B - Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsaeure durch Zuechten von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1294310B
Application number: DEK53133A
Authority: DE
Inventors: Mizuhara Kunizo; Kinoshita Shukuo; Suzuki Takeo; Kawamori Yoshiaki; Miyamura Yoshinobu
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1963-06-06
Filing date: 1964-06-05
Publication date: 1969-05-08
Also published as: DK107541C; US3389058A; BR6459797D0; NL6406325A; BE648914A; ES300587A1; GB1070802A; CH432528A

Description

1 2

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her- 5'-Inosinsäure erzielt werden, ohne daß wesentliche stellung von 5'-Inosinsäure durch Züchten von Mengen unerwünschter Begleitstoffe im Züchtungs-Mikroorganismen in Kohlehydrate, Stickstoff- medium gebildet werden. Die Aufarbeitung und Substanzen und anorganische Salze enthaltenden Reingewinnung der 5'-Inosinsäure wird dadurch Nährmedien. 5 wesentlich erleichtert.

Es sind eine Anzahl von Verfahren zur Herstellung Das erfindungsgemäße Verfahren hat insbesondere von 5'-Inosinsäure, die zusammen mit Guanylsäure, im Vergleich zu bekannten Verfahren, bei denen die Xanthylsäure und anderen Purinnucleotiden in zu- Hypoxanthinfermentation und die 5'-Inosinsäurenehmendem Maße als Würze oder Aromastoff ver- fermentation völlig gesondert durchgeführt werden, wendet wird, im technischen Maßstab bekannt. Diese io die folgenden Vorteile: (a) es wird die Hälfte der Verfahren umfassen die direkte Fermentation mittels Verfahrensanlagen eingespart, (b) mehrere VerMikroorganismen und Umwandlung von Nuclein- fahrensstufen können entfallen, da keine Notwendigbasen, die durch Synthese erhalten worden sind, keit zur Abtrennung und Reinigung von Hypodurch Mikroorganismen in Nucleotide. So werden xanthin besteht, und (c) die Kosten für die Ausz. B. in den französischen Patentschriften 1 307 352 15 gangsmaterialien werden auf die Hälfte gesenkt,
und 1317 549 Verfahren zur Herstellung von Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganis-5'-Inosinsäure durch Fermentation von Mikro- men, die die Fähigkeit zur Produktion einer großen Organismen in einem Adenin bzw. Hypoxanthin oder Menge Hypoxanthin aufweisen, sind Brevibacterium andere Purinbasen enthaltenden Nährmedium be- ammoniagenes ATCC 15454 und Brevibacterium schrieben. Auch die Phosphorylierung von mikro- 20 ammoniagenes ATCC 15187 (eine Mutante von biologisch hergestellten Nucleosiden auf chemischem ATCC 6872, erhalten durch Behandeln mit chemi-Wege wäre hier zu erwähnen. sehen Mitteln).

Nachteilig an den bisher vorgeschlagenen Ver- Diese Mikroorganismen werden in einem Medium

fahren sind vor allem die mit ihnen verbundenen gezüchtet, das die Ansammlung großer Mengen

technischen Schwierigkeiten. Stets erforderte es große 25 Hypoxanthin ermöglicht. Dieses Medium wird hier

Mühe und umfangreiche und kostspielige Vorrich- als Impf- oder Stammkulturmedium bezeichnet. Es

tungen, um die 5'-Inosinsäure, die fast immer im Ge- enthält Kohlehydrate (wie Glucose, Amylodextrin

misch mit zahlreichen anderen Stoffen erzeugt wurde, und andere Saccharide oder Abfallmelassen), Stick-

zu isolieren und zu reinigen. Dies war um so schwie- stoffquellen (wie Harnstoff, Ammoniak oder Ammo-

riger, als die 5'-Inosinsäure nur in sehr geringer 30 niumsalze) und anorganische Salze (wie primäres

Konzentration anfiel. oder sekundäres Calciumphosphat, Magnesiumsulfat,

Aufgabe der Erfindung ist ein unkompliziertes Kaliumsulfat, Natriumchlorid und Calciumchlorid),

biotechnisches Verfahren zur Herstellung größerer Erforderlichenfalls enthält das Medium Hefeextrakt,

Mengen an 5'-Inosinsäure. Caseinhydrolysat, Sojabohnentreberhydrolysat, Pep-

Der Gegenstand der Erfindung geht von einem 35 ton, Maisquellwasser und andere Bestandteile, die Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure durch Faktoren zur Beschleunigung des Wachstums der Züchten von Mikroorganismen in Kohlehydrate, genannten Mikroorganismen und somit zur An-Stickstoffsubstanzen und anorganische Salze ent- Sammlung von Hypoxanthin enthalten. Das Medium haltenden Nährmedien aus und ist dadurch gekenn- kann ferner kleine Mengen Biotin, Adenin u.dgl. entzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes 40 halten, die dem gleichen Zweck dienen.
ATCC 15187 oder ATCC 15454 entweder symbio- Mit den angegebenen hypoxanthinbildenden Stämtisch mit Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 men wird das Impfkulturmedium der obengenannten züchtet oder daß man ATCC 15187 oder Zusammensetzung beimpft und etwa 16 bis 24 Stun-ATCC 15454 und ATCC 6872 zunächst gesondert den bei 30° C angezüchtet, wobei die Zellen gut züchtet, danach die Kultur von ATCC 15187 oder 45 wachsen. Anschließend werden die gezüchteten ATCC 15454 mit der Kultur von ATCC 6872 ver- Zellen in das Stammkulturmedium übergeführt. In mischt und die Mischung weiterzüchtet. diesem Stammedium werden die Stämme 2 bis

Der genaue Mechanismus des erfindungsgemäßen 4 Tage weitergezüchtet, wobei sie unter Rühren bei Verfahrens ist nicht bekannt, kann jedoch mit ge- 28 bis 40° C belüftet werden. Es ist zweckmäßig, den wisser Wahrscheinlichkeit in folgender Weise erklärt 50 pH-Wert während der Züchtung mit Ammoniak oder werden: Hypoxanthin ist eine Purinbase, die ein Harnstoff auf 6,0 bis 8,0 einzustellen. Hypoxanthin Bestandteil der 5'-Inosinsäure darstellt, und sie kann wird allmählich unter Verbrauch von Sacchariden eine Vorstufe dieser Säure sein. Nucleotidphosphory- angehäuft, bis die Menge etwa 3 bis 8 mg je Kubiklase ist eine Sammelbezeichnung für die Enzyme, die Zentimeter Medium beträgt. Die erhaltene Flüssigkeit Nucleotide synthetisieren. Mikroorganismen, die eine 55 wird hier als Kulturflüssigkeit A bezeichnet,
hohe Phosphoribosylpyrophosphorylaseaktivität be- Als Mikroorganismus, der die Fähigkeit zur sitzen, bilden 5'-Inosinsäure in Gegenwart von Hypo- Bildung von Syntheseenzymen, d. h. von Nucleotidxanthin und D-Ribosa-5-phosphorsäure. Ein System pyrophosphorylase besitzt, wird Brevibacterium für ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von ammoniagenes ATCC 6872 verwendet. Wenn man 5'-Inosinsäure muß zweckmäßigerweise also ihre 60 diesen Stamm in der gleichen Weise wie die hypoBestandteile, d. h. Hypoxanthin und D-Ribose- xanthinbildenden Stämme züchtet, wird eine Kultur-5-phosphorsäure, sowie auch das Enzymsystem, das flüssigkeit mit hoher Nucleotidpyrophosphorylasediese Bestandteile vereinigt, enthalten. aktivität erhalten. Beim Rühren der belüfteten Kultur

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die wird im Laufe von etwa 24 Stunden ein allmähliches

biotechnische Herstellung von 5'-Inosinsäure in ein- 65 Anwachsen der Nucleotidpyrophosphorylaseaktivität

fächer und wirtschaftlicher Weise erreicht. Mit Hilfe beobachtet. Die Aktivität erreicht ihr Maximum in

der erfindungsgemäßen symbiotischen Züchtungs- 54 bis 68 Stunden, wenn der Zucker in dem Medium

arbeitsweise können besonders hohe Ausbeuten an so weit verbraucht ist, daß der Gehalt auf 4 bis 2%

gefallen ist. Die in dieser Weise erhaltene Flüssigkeit wird hier als Kulturflüssigkeit B bezeichnet.

Die Kulturflüssigkeiten A und B werden in einem geeigneten Verhältnis vermischt und der weiteren Züchtung unter Rühren und Belüften unterworfen. Das Verhältnis, in dem die Flüssigkeiten vermischt werden (A: B) kann zwischen etwa 1:1 und 2: 1 liegen. Bevorzugt werden die Flüssigkeiten aber in ungefähr gleichen Mengenanteilen vermischt.

In dem Mischkulturmedium wird Hypoxanthin biochemisch mit D-Ribose-5-phosphorsäure zu 5'-Inosinsäure umgesetzt. Die für die Weiterzüchtung des Mischkulturmediums erforderliche Zeit beträgt gewöhnlich etwa 24 bis 36 Stunden, hängt aber von den in den Kulturflüssigkeiten A und B angesammelten Mengen an Vorstufen und Enzym ab. Die enzymatische Umsetzung kann beschleunigt und stabilisiert werden, indem man den Kulturflüssigkeiten A und B nach dem Vermischen verschiedene Saccharide oder andere Nährstoffe zusetzt.

Nachdem die Ansammlung der 5'-Inosinsäure in dem Mischkulturmedium erfolgt ist, werden die Zellen, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt. Die erhaltene Flüssigkeit kann in der folgenden Weise einer Ionenaustauschbehandlung unterworfen werden: Die zellenfreie Flüssigkeit wird durch ein Ionenaustauscherharz, das ein sulfoniertes Mischpolymerisat aus Styrol und Divinylbenzol ist (Dia-ion SK 1 A), geschickt, das anschließend mit Wasser eluiert wird. Die Fraktion unter pH 2,0 wird an einem stark basischen Ionenaustauscherharz aus Polystyrol mit quaternären Ammoniumgruppen (Dia-ion SA 21 A) adsorbiert und die Inosinsäure enthaltende Fraktion durch Elution mit 0,5 n-Salzsäure gewonnen. Reines Na-5'-Inosinat wird aus der Elutionsflüssigkeit erhalten, indem diese mit Natriumhydroxyd neutralisiert und anschließend eingeengt wird.

Außer der obigen Arbeitsweise, bei der die Kulturflüssigkeiten A und B getrennt gezüchtet und anschließend vermischt werden, ist es auch möglich, nur ein einziges Kulturmedium gleichzeitig oder in kurzem Abstand mit einem der genannten hypoxanthinbildenden Stämme und dem Stamm mit Nucleotidpyrophosphorylaseaktivität zu beimpfen, um 5'-Inosinsäure zu erhalten. Dies ist ein typisches Beispiel für die symbiotische Züchtung von zwei verschiedenen Stämmen. Auch in diesem Falle kann die 5'-Inosinsäure mittels einer Kombination von Kationen- und Anionenaustauscherharzen isoliert und gereinigt werden, wie es bereits oben beschrieben wurde.

Bei der Durchführung dieser erfindungsgemäßen Arbeitsweise ist es z. B. möglich, die verschiedenen Stämme in verschiedenen Teilen des gleichen Impfkulturmediums vorzuzüchten. Danach können die verschiedenen Zellen in das Stammkulturmedium übergeführt werden, wo die Züchtung in symbiotischer Weise durchgeführt wird. Die Zusammensetzung der bei dieser Ausführungsform verwendeten Medien ist die gleiche wie bei den zuvor beschriebenen Arbeitsweisen.

Beispiel 1
Herstellung der Kulturflüssigkeit A

(1) Impfkultur ^6s

Ein Züchtungsmedium aus 3,0 % Glucose, 2,0 ⁰Zo Hefeextrakt, 1,0% Pepton und O,25⁰/o Natriumchlorid wird 15 Minuten bei 120° C sterilisiert. Dann wird das Medium mit Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15454 beimpft und 24 Stunden unter Schütteln bei 30° C gezüchtet.

(2) Stammkultur

3 1 eines Mediums aus 10% Glucose, 0,5% Hefeextrakt, 0,4% primärem Kaliumphosphat, 0,4% sekundärem Kaliumphosphat, 0,4% Magnesiumsulfat und 0,01% Calciumchlorid werden in einen 5 1 fassenden Gärkolben gegeben, 20 Minuten bei 120⁰C sterisiliert und mit 300 ecm der wie oben hergestellten Impfkulturflüssigkeit beimpft. Nach 3 Tagen, wobei der pH-Wert mittels Ammoniakwasser auf 7,0 gehalten wird, wird die Menge an Hypoxanthin in dem Kulturmedium zu 4,1 mg/ccm bestimmt.

Herstellung der Kulturflüssigkeit B

(1) Impfkultur

Ein Medium aus 3% Glucose, 2,0% Hefeextrakt, 1,0% Pepton und 0,25% Natriumchlorid wird 15 Minuten bei 120° C sterilisiert und mit Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 beimpft, das in diesem Medium 24 Stunden unter Schütteln bei 30° C gezüchtet wird.

(2) Stammkultur

3 1 eines Mediums aus 8% Glucose, 0,4% Hefeextrakt, 0,4% primärem Kaliumphosphat, 0,4% sekundärem Kaliumphosphat, 0,4% Magnesiumsulfat und 0,01% Calciumchlorid werden in einen 5 1 fassenden Gärkolben gegeben, 10 Minuten bei 120° C sterilisiert, mit 300 ecm der oben hergestellten Impfkultur beimpft und 3 Tage unter Rühren und Belüften gezüchtet, wobei der pH-Wert mittels Ammoniakwasser bei 7,0 gehalten wird.

1,5 1 der Kulturflüssigkeit A werden mit der gleichen Menge der Kulturflüssigkeit B vermischt. Das Gemisch wird auf einen Glucosegehalt von 5% des gesamten Volumens gebracht und weitere 3 Tage unter Belüften gezüchtet, wobei der pH-Wert konstant mittels Ammoniakwasser auf 7,0 eingestellt wird. Nach Beendigung der Züchtung wird die Menge an 5'-Inosinsäure zu 12,6 mg/ccm bestimmt.

5 1 der erhaltenen Flüssigkeit werden zur Koagulation der Zellen erwärmt. Das Gemisch wird zentrifugiert, und die Zellen werden abgetrennt. Dann wird die Flüssigkeit durch ein Ionenaustauscherharz aus einem sulfonierten Mischpolymerisat aus Styrol und Divinylbenzol (Dia-ion SK IA von der Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Japan) geschickt, das Ionenaustauscherharz mit Wasser eluiert, der Anteil unterhalb pH 2,0 an einem stark basischen Ionenaustauscherharz aus Polystyrol mit quaternären Ammoniumgruppen (Dia-ion SA 21A von der Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Japan) adsorbiert und dann mit 0,5 η-Salzsäure eluiert, wobei 240 ecm einer Inosinsäure enthaltenden Fraktion erhalten werden. Diese Fraktion ergibt nach Neutralisieren mit Natronlauge und Einengen 42,8 g kristallines Natrium-5'-inosinat.

Beispiel 2

Herstellung der Kulturflüssigkeit A
(1) Impfkultur

Ein Medium aus 3,0% Glucose, 4,0% löslichem Fischextrakt, 1,0% Pepton und 0,25 % Natrium-

chorid wird 15 Minuten bei 120° C sterilisiert, mit Brevibacterium ammoniagenes ATCC15187 beimpft und 24 Stunden unter Schütteln gezüchtet.

(2) Stammkultur

31 eines Mediums aus 10% Glucose, 1,0% Reiskleie, 1,0% Sojatreberhydrolysat, 0,6% primärem Kaliumphosphat, 0,6% sekundärem Kaliumphosphat, 0,6% Magnesiumsulfat und 0,01% Calciumchlorid werden in einen 5 1 fassenden Gärkolben gegeben, 20 Minuten bei 120° C sterilisiert und dann mit 300 ecm der oben gezüchteten Kultur des Stamms beimpft. Der pH-Wert wird mit Ammoniakwasser auf 7,0 gebracht, und die Kultur wird weitere 3 Tage

gehalten wurde. Dann wird das gleiche Medium mit 300 ecm der Impfkultur von Stamm (b) beimpft und weitere 72 Stunden gezüchtet. Die Ansammlung der 5'-Inosinsäure in der Kulturflüssigkeit beträgt 5,0 mg/ccm.

21 dieser Kulturflüssigkeit werden in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 behandelt. Nadeln von Natrium-5'-inosinat werden in einer Menge von 8,2% an reinem Produkt erhalten.

Beispiel 4

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15454 wird als hypoxanthinbildender Stamm verwendet und

bei 30° C gezüchtet. 60 Stunden nach dem Beimpfen 15 72 Stunden in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 wird der Gehalt an Hypoxanthin in dem Medium zu gezüchtet. Die Menge des im Medium angesammelten Hypoxanthins Medium wird zur

3,2 mg/ccm bestimmt.

Herstellung der Kulturflüssigkeit B (1) Impfkultur

entspricht 4,3 mg/ccm. Dieses Abtrennung der Zellen zentrifugiert, und zu der restlichen Flüssigkeit werden 10% Glucose, 0,4% primäres Kaliumphosphat, 0,4% sekundäres Kaliumphosphat, 0,4% Magnesiumsulfat, 30 γβ. Biotin und 2γ /ecm Calcium-D-pantothenat gegeben. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 120° C sterilisiert und mit Brevibacterium ammonia-

Ein Medium aus 3,0% Glucose, 2,0% Maisquellwasser, 1,0% Pepton und 20 γβ Biotin wird durch
15 Minuten Erwärmen auf 120° C sterilisiert, mit
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 beimpft 25 genes ATCC 6872 in einer Menge von ungefähr 5% und 18 Stunden unter Schütteln gezüchtet. der Gesamtmenge beimpft, das in der gleichen Weise

,-, „, , ,. wie im Beispiel 1 gezüchtet worden ist. Dieser Stamm

(2) Stammkultur _{wird 96 Stunden bei 30}o _{c gezüchte}t_{5 wobei der}

3 1 eines Mediums aus 8% Glucose, 1,0% Mais- pH-Wert mit Ammoniakwasser auf 7,0 eingestellt quellwasser, 0,4% primärem Kaliumphosphat, 0,4% 30 wird. 9,8 mg 5'-Inosinsäure werden je Kubikzentisekundärem Kaliumphosphat, 0,4% Magnesium- meter des Mediums gebildet. Beim Behandeln in der sulfat, 0,01% Calciumchlorid und 30 γβ Biotin werden in einen 5 1 fassenden Gärkolben gegeben,
20 Minuten bei 120° C sterilisiert und mit 300 ecm
der Impfkultur beimpft. Das Medium wird 48 Stun- 35
den bei 30° C belüftet und gerührt, wobei der
pH-Wert mittels 15%iger Harnstofflösung auf 6,8 bis
8,0 gehalten wird.

21 der Kulturflüssigkeit A werden mit 11 der

Kulturflüssigkeit B vermischt. Das Gemisch wird bei 40 arbeitet. 5,2 mg/ccm Hypoxanthin wurden in dem 32° C weiter belüftet und gerührt. 48 Stunden nach Kulturmedium angesammelt. Das Medium wird in dem Vermischen wird die Menge an Inosinsäure in
der Flüssigkeit zu 8,5 mg/ccm bestimmt. 21 dieser
Flüssigkeit ergeben nach Behandlung in der gleichen
Weise wie in Beispiel 1
5'-inosinat.

Beispiel 3
(1) Impfkultur

Ein Medium aus 3,0% Glucose, 2,0% Hefe- 50 Temperatur bei 30° C gehalten wird. 30 Stunden extrakt, 1,0% Pepton und 0,25% Natriumchlorid nach dem Zusatz wird die Menge an 5'-Inosinsäure in wird 15 Minuten bei 120° C sterilisiert. In getrennten
Anteilen dieses Mediums werden der hypoxanthinbildende Stamm Brevibacterium ammoniagenes
ATCC15454 (a), und der Nucleotidpyrophosphory- 55
läse bildende Stamm Brevibacterium ammoniagenes

gleichen Weise wie im Beispiel 1 werden aus 21 der Flüssigkeit 12,4 g reines Natrium-5'-inosinat erhalten.

Beispiel 5

Nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde mit Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15187 als hypoxanthinbildender Stamm ge-

der Wärme sterilisiert und dann zu einem in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 erhaltenen Medium von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 11,35 g kristallines Natrium- 45 hinzugegeben, mit dem in einem 51 fassenden Gär-

kolben gezüchtet wird. Der Zusatz erfolgt nach 24, 36 und 48 Stunden, jeweils in einer Menge von 80% ^^es g^esamten Mediums. Das durch diese Mischung erhaltene Medium wird langsam gerührt, wobei die bi ° l id

den einzelnen Gärkolben
werte sind folgende:

bestimmt, die Analysen-

24 Stunden unter Schütteln bei

ATCC 6872 (b),
30° C gezüchtet.

(2) Stammkultur

31 eines Mediums aus 12% Glucose, 1,0% Hefeextrakt, 0,5% primärem Kaliumphosphat, 0,5% sekundärem Kaliumphosphat, 0,5% Magnesiumsulfat und 0,01 % Calciumchlorid werden in einen 51 fassenden Gärkolben gegeben, 20 Minuten bei 120° C sterilisiert, mit 300 ecm der Impfkultur von Stamm (a) beimpft und 120 Stunden unter Rühren und Belüften gezüchtet, wobei der pH-Wert bei 7,0

Zeit des Zusatzes

24 Stunden nach Beginn

36 Stunden nach Beginn

48 Stunden nach Beginn

Menge an 5'-Inosinsäure

5,8 mg/ccm 7,6 mg/ccm 8,1 mg/ccm

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure durch Züchten von Mikroorganismen in Kohlehydrate, Stickstoffsubstanzen und anorganische

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Salze enthaltenden Nährmedien, dadurchge- ATCC15187 oder ATCC15454 und ATCC 6872

kennzeichnet, daß man Brevibacterium zunächst gesondert züchtet, danach die Kultur

ammoniagenes ATCC15187 oder ATCC15454 von ATCC 15187 oder ATCC 15454 mit der

entweder symbiotisch mit Brevibacterium ammo- Kultur von ATCC 6872 vermischt und die

niagenes ATCC 6872 züchtet oder daß man 5 Mischung weiterzüchtet.

909 519/459