DE2240471A1

DE2240471A1 - Diagnostisches mittel zum nachweis von bilirubin

Info

Publication number: DE2240471A1
Application number: DE2240471A
Authority: DE
Inventors: Dieter Dr Rer Nat Berger; Werner Dr Rer Nat Guethlein; Hans-Georg Dr Rer Nat Rey; Peter Dr Rer Nat Rieckmann; Walter Dr Rer Nat Rittersdorf
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1972-08-17
Filing date: 1972-08-17
Publication date: 1974-03-14
Also published as: KE2830A; ATA715273A; DE2240471B2; BE864030Q; DE2240471C3; CH572213A5; GB1389368A; JPS4960591A; AT326277B; HK16378A; FR2196717A5; US3880588A; JPS5759497B2

Description

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH · . 1830

Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Bilirubin

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes diagnostisches Mittel zum schnellen und empfindlichen Nachweis von Bilirubin in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise in Urin.

Der Nachweis von Bilirubin in Urin ist von großer Bedeutung bei der Diagnose von Leber- und Gallenerkrankungen. So tritt, bei Leberschädigungen und Gallengangsverschlüssen schon frühzeitig Bilirubin im Urin auf, noch bevor der Bilirubin-Gehalt im Serum steigt und klinische Anzeichen einer Gelbsucht vorliegen. Andererseits kann man diese Art von Gelbsucht vom sogenannten hämolytischen Icterus unterscheiden, bei welchem nur im Serum, nicht aber im Urin ein erhöhter Bilirubinspiegel festgestellt werden kann.

Nachweismethoden von Bilirubin in Urin sind seit-langem bekannt. Von Bedeutung sind hierbei die Methoden, die auf der Auswertung der bei der Kupplung von Diazoniumsalzen mit Bilirubin gebildeten farbigen Verbindungen beruhen. Hierfür wurde bisher meist die Diazosulfanilsäure verwendet.

In der letzten Zeit haben sich in der ärztlichen Praxis und im klinischen Labor als diagnostische Hilfsmittel mehr und mehr sogenannte Schnellteste eingeführt. Dies sind einfache Vorrichtungen, meist Testpapiere, die die Durchführung des Nachweises oder der halbquantitativen Bestimmung von pathologischen Körperinhaltsstoffen schnell und sicher auch durch ungeschulte Kräfte, wie medizinisches Hilfspersonal gestatten.

So ist beispielsweise.in der deutschen Auslegeschrift 1.102.444 eine ein Diazoniumsalz und eine starke Säure enthaltende

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Reagenztablette beschrieben, die auf ein mit der Körperflüssigkeit befeuchtetes Testplättchen gelegt wird und nach dem Befeuchten mit Wasser das Bilirubin als violetten Ring auf der Unterlage sichtbar macht.

Es ist ersichtlich, daß ein solches diagnostisches Mittel relativ umständlich zu handhaben ist. Für die breite Anwendung in der ärztlichen Praxis und am Krankenbett ist es aber wünschenswert, daß Schnellteste so beschaffen sind, daß sie nach einfachem Eintauchen in die zu untersuchende Körperflüssigkeit ohne weiteres ablesbar sind. Diesen Zweck erfüllen am besten sogenannte Testpapiere; das sind saugfähige Träger, die mit allen für die Nachweisreaktion notwendigen Reagenzien imprägniert sind.

Es ist zwar beispielsweise aus der deutschen Offenlegungsschrift 2.007.013 bereits bekannt, Testpapiere, welche gewisse 2,4- und 2,5-disubstituierte Diazoniumsalze zum Nachweis von Bilirubin in Serum und Harn enthalten, zu verwenden. Jedoch ist diese Methode relativ unempfindlich, und weist nach eigenen Untersuchungen hinsichtlich der Reaktionsgeschwindigkeit und Empfindlichkeit noch Mängel auf, die ihre Verwendbarkeit in der Praxis infrage stellen. Es besteht nun die Möglichkeit, die Empfindlichkeit der Nachweisreaktion durch Aktivatoren zu erhöhen; hierbei tritt jedoch eine neue Schwierigkeit auf. Das im Harn ebenfalls vorkommende ürobilinogen reagiert nämlich in Anwesenheit dieser Aktivatoren ebenfalls und täuscht einen erhöhten Bilirubingehalt vor. Außerdem werden hierdurch die normalen Störreaktionen mit Harninhaltsstoffen ebenfalls aktiviert, was sich in Fehlfärbungen oder sogar falsch positiven Anzeigen äußern kann.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß bei Verwendung von Diazoniumsalzen der allgemeinen Formel I

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-3- 224Ü471

^Ri

^R2

in welcher X^ ein stabilisierendes Anion und R₁ und R ein Halogenatom, eine niedere Alkyl- oder Alkoxygruppe und R₃ und R. Wasserstoff, ein Halogenatom, eine Nitro-, eine niedere Alkyl- oder Alkoxygruppe bedeuten, wobei der aromatische Ring entweder 1-3 Halogenatome oder eine Nitrogruppe, aber nicht beide gemeinsam, enthält,

die oben genannten Schwierigkeiten nicht mehr auftreten, auch wenn man gleichzeitig Aktivatoren zugibt. Man erhält Teststreifen, die sowohl im Harn als auch im Serum selektiv reagieren.

Die- Diazoniumsalze der Formel I sind sämtlich bekannt oder können aus bekannten aromatischen Aminen durch Diazotierung hergestellt werden. Unter niederen Alkyl- bzw. Alkoxygruppen werden Restemit 1-3 Kohlenstoffatomen verstanden. Die Diazoniumsalze I werden zweckmäßigerweise als Fluoborate eingesetzt, deren Stabilität bekannt ist; andere stabile Salze wie Arylsulfonate, speziell Naphthalin-1,5-disulfonate, sind ebenfalls brauchbar. Bevorzugt werden Diazoniumsalze der allgemeinen Formel I, in welcher R, und R₃ ein Halogenatom, insbesondere Chlor- oder Bromatom, und die übrigen Reste.ein Wasserstoffatom bedeuten.

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Als Aktivatoren eignen sich neben anionischen Netzmitteln besonders Verbindungen der allgemeinen Formel II

R₆-O OH

in welcher R₅ und R, einen gegebenenfalls substituierten aliphatischen, cycloaliphatischen, araliphatischen oder aromatischen Rest bedeuten.

Die Reste R5 und R^ sind vorzugsweise identisch, da derartige Phosphorsäurediester besonders einfach hergestellt werden können. Die aliphatischen Reste R5 und Rg können geradkettig und verzweigt sein und 1-18 Kohlenstoffatome enthalten, wobei die Wirksamkeit der entsprechenden Ester zunächst mit steigender Anzahl der Kohlenstoffatome wächst und schließlich ab einer Kettenlänge von etwa 14 Kohlenstoffatomen, bedingt durch den zunehmend hydrophoben Charakter der Ester, wieder abnimmt. Als Cycloalkylreste haben sich diejenigen mit 5-8 Kohlenstoffatomen als brauchbar erwiesen. Als Substituenten der aliphatischen oder cycloaliphatischen Reste kommen Halogenatome, vorzugsweise Chlor und Brom, und Nitro-, sowie niedere Alkoxygruppen mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen infrage. Hinsichtlich der Stabilität der Teststreifen sind Phosphorsäurediester II, bei denen Re und Rg einen aromatischen Rest darstellen, bevorzugt. Als aromatische Reste haben sich ein- und mehrkernige, unsubstituierte und substituierte Arylreste, wie z.B. der Phenyl-, XyIyI-, Tolyl-, Chlorphenyl-, Nitrophenyl- oder Naphthylrest bewährt. Als araliphatische Reste eignen sich insbesondere Phenyl- oder Naphthylreste die über eine niedere Alkylenbrücke mit 1-3 Kohlenstoffatomen mit dem Phosphorsäurerest verbunden sind.

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Zur Herstellung erfindungsgemäß besonders brauchbarer Testpapiere wird ein saugfähiger Träger, vorzugsweise Filterpapier, mit einer Lösung getränkt, die 0,01 - 2,0 g vorzugsweise 0,05 - 0,5 g (pro 100 ml), eines Diazoniumsalzes gemäß der allgemeinen Formel I, sowie 3-2Og, vorzugsweise 5 - 15 g (pro 100 ml), eines Phosphorsäurediesters gemäß der allgemeinen Formel II und 2-3Og einer festen anorganischen oder organischen Säure enthält, und anschließend getrocknet. Es ist jedoch auch möglich, die Diazotierung in der Tränklösung oder auf dem Papier vorzunehmen. In diesem Fall geht man von dem betreffenden Amin aus, das in an sich bekannter Weise mit einem Nitrit umgesetzt wird.

Die erfindungsgemäßen Bilirubin-Testpapiere können weiterhin Stabilisierungsmittel für Diazoniumsalze enthalten, wie z.B. Natriumfluobor.at, Magnesiumsulfat, Natriummetaphosphat, Arylsulfonate und andere.

Des Weiteren können sie Netzmittel enthalten, um die Saugfähigkeit der Testpapiere zu verbessern. Es kommen prinzipiell alle Netzmittel infrage, die in dem stark sauren Milieu nach dem Eintauchen in die Körperflüssgkeit noch oberflächenaktiv sind und zwar kationische (z.B. Laurylpyridiniumchlorid), nichtionogene (z.B. Polyoxyäthylen-triglycerid) und von den anionischen besonders die Sulfonate und Sulfate (z.B. Dodecylbenzolsulfonat). Letztere können zusätzlich aktivierende Eigenschaften besitzen.

Die Netzmittel werden in Konzentrationen von 0,1 - 2 %, vorzugsweise 0,2 - 0,5 %, eingesetzt.

Als Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemische für die Imprägnierung kommen alle diejenigen infrage, die nicht mit Diazoniumsalzen reagieren, in denen alle Bestandteile löslich sind und

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die einen niedrigen Siedepunkt besitzen, damit die Diazoniumsalze beim Trocknen nicht zu hohen Temperaturen ausgesetzt zu werden brauchen. Es hat sich auch bewährt, einzelne Bestandteile in getrennten Arbeitsgängen zu imprägnieren. So wird beispielsweise das Gemisch aus Diazoniumsalz und Metaphosphorsäure aus Wasser vorimprägniert und mit Phosphorsäurediphenylester in Essigester oder Chloroform nachimprägniert.

Als saugfähige Träger kommen vor allen Dingen Filterpapiere infrage, aber auch andere saugfähige Träger wie Glasfaserpapiere, Kunstfasergewebe und -vliese aus säurefesten Fasern wie Polyester und Polypropylen sind geeignet. Der Begriff "Testpapiere" soll auch diese Materialien umfassen.

Gegenstand der Erfindung sind demnach Testpapiere zum Nachweis von Bilirubin in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Diazoniumsalz der Formel I und eine für die Kupplungsreaktion ausreichende Menge einer Säure enthalten.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Diazoniumsalzen der allgemeinen Formel I zur Herstellung von Testpapieren zum Nachweis von Bilirubin in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Urin.

Phosphorsäurediester der allgemeinen Formel II sind an sich bekannt (Method, d. Org. Chem. Houben-Weyl, Bd. XII/2 226ff). Da die Verbindungen II selbst sauer reagieren, können sie die für die Kupplungsreaktion nötige Säure zumindest teilweise ersetzen. Meist sind jedoch zusätzliche Säurezugaben erforderlich. Hierfür kommt eine ganze Reihe von festen Säuren infrage. Bewährt haben sich vor allem Oxalsäure, Zitronensäure, Kaliumbisulfat und insbesondere im Hinblick auf die Stabilität des Diazoniumsalzes die käufliche Metaphosphorsäure, die ca. 60 % ihres Natriumsalzes enthalten kann.

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Die erfindungsgemäßen Testpapiere reagieren mit bilirubinhaltigem Urin nach ca. 5-30 Sekunden mit roten bis blauen Farbtöneni Mit Normalurinen erhält man gelbe Reaktionsfarben. Urobilinogen reagiert ohne zu stören mit gelber Farbe, wobei Rottöne nur auftreten, wenn es in ungewöhnlich großen Mengen (mehr als ca. 8 - 10 mg%) im Urin enthalten ist. Der Nachweis von Serumblirubin ist erfindungsgemäß selbstverständlich ebenfalls möglich.

Die Testpapiere können in lange Streifen geschnitten und auf Rollen aufgewickelt werden, von denen man sich nach Bedarf kleine Stücke abschneidet. Sie können auch in kleine Vierecke geschnitten und auf das untere Ende von schmalen Kunststoffstreifen aufgeklebt oder aufgesiegelt werden. Von besonderem Vorteil ist es, wenn die Testpapiere zwischen zwei Kunststoff-Folien gemäß DOS 1.546.307 oder zwischen einer Kunststoff-Folie und einem Netzwerk gemäß Anmeldung Aktenzeichen P 21 18 455.4 eingesiegelt sind, weil dann keine'Gefahr besteht, daß die Reagenzien beim Eintauchen in die Körperflüssigkeit ausgewaschen werden.

Die Erfindung soll in den nachstehenden Beispielen näher erläutert werden:

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Beispiel

Filterpapier wird mit folgenden Lösungen nacheinander imprägniert und bei 4O°C getrocknet:

Lösung I:

2,6-Dichlorbenzoldiazoniumfluoborat 0,08 g

Metaphosphorsäure 10,0 g

Zitronensäure 3,0 g

destilliertes Wasser ad 100,0 ml

Lösung II:

Phosphorsäurediphenylester ... 5,0 g

Dodecylbenzolsulfonsäure, Na-SaIz 0,4 g

Essigester ad 100,0 ml

Beim Eintauchen in bilirubinhaltigen Urin erhält man je nach Konzentration nach ca. 10-20 Sekunden rote bis violettrote Färbungen der Testpapiere; die Empfindlichkeitsgrenze liegt bei ca. 0,1-0,3 mg% Bilirubin. Mit Normalurin erhält man gelbe Färbungen, desgleichen mit Urobilinogen-haltigem Urin. Enthält der Urin mehr als ca. 8-10 mg%, so geht diese Gelbfärbung nach ca. 1 Minute langsam in eine Rotfärbung über.

Mit bilirubinhaltigem Serum erhält man rotviolette Färbungen mit steigender Intensität, wobei die Empfindlichkeitsgrenze bei etwa 0,4-0,6 mg% liegt.

In analoger Weise reagieren Testpapiere, welche 2,6-Dibrombenzoldiazoniumfluoborat enthalten.

Testpapiere analoger Zusammensetzung, die jedoch 2,4-Dichlorbenzoldiazoniumfluoborat enthalten (vgl. DOS 2 007 013) reagieren mit Bilirubin mit blauer Farbe. Mit urobilinogenhaltigem Urin weisen diese schon nach wenigen Sekunden eine tiefe violette Färbung auf.

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Beispiel

Testpapiere, die denen im Beispiel 1 beschriebenen analog reagieren, erhält man, wenn man den Phosphorsäuredipheny1-ester durch folgende Phosphorsäureester ersetzt:

Phosphorsäure-di-o-tolyl-ester
Phosphorsäure-di-p-tolyl-ester
Phosphorsäure-bis-3,5-xylyl-ester
Phosphorsäure-bis-o-chlorphenyl-ester Phosphorsäure-bis-p-chlorphenyl-ester Phosphorsäure-bis-p-nitrophenyl-ester Phosphorsäure-dicyclohexyl-ester
Phosphorsäure-dipenty!ester

Beispiel

Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 4O°C getrocknet:

2,6-Dichlorbenzoldiazoniumfluoborat 0,16 g

Metaphosphorsäure 15,0 g

Dodecylbenzolsulfonsäure, Natriumsalz l»0 g

Methanol 20,0 ml

Wasser, dest. ad 100,0" ml

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Dieses Testpapier reagiert nach 20 - 30 Sekunden mit violetter Farbe mit bilirubinhaltigem Urin (Empfindlichkeit ca. 0,7 - 0,9 mg%). Mit stark urobiligenhaltigern Urin (ca. 8-12 mg) tritt nach ca. 1-2 Minuten eine schwache :Rotfärbung auf.

Ein Testpapier gleicher Zusammensetzung, welches 2,4-Dichlorbenzoldiazoniumfluoborat enthält, reagiert mit Bilirubin mit blauvioletter Farbe, mit urobilinogenhaltigem Urin tritt bereits nach kurzer Zeit eine störende Violettfärbung ein.

Beispiel

Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 40 C getrocknet:

2-Methoxy-4,6-dibrombenzoldiazoniumfluoborat 0,12 g

Zitronensäure 10,0 g

Natriummetaphosphat 3,0 g

Wasser, dest. ad 100,0 ml

Dieses Papier wird mit einer 5%igen Lösung von Phosphorsäurediphenylester in Essigester nachimprägniert.

Die Eigenschaften dieses Testpapiers, sowie von Testpapieren mit äquimolaren Mengen von Diazoniumsalzen der nachfolgenden Tabelle I, entsprechen im wesentlichen denen von Beispiel 1. Die Reaktionsfarben mit Bilirubin sind bei den Halogenalkyl-Verbindüngen mehr blauviolett; bei den Alkoxy- bzw. Nitroverbindungen mehr graublau.

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- ii - 22A0471

Tabelle I

2-Methyl-4,6-dibrombenzoldiazoniumfluoborat 2-Methyl-4-chlor-6-brombenzoldiazoniumfluoborat 2-Methyl-4-brom-6~chlorbenzoldiazoniumfluoborat 4-Methyl-2,6-dibroiribenzoldiazoniumfluoborat 4-Äthyl-2,6-dibrombenzoldiazoniumfluoborat 4-Methyl-2,6-dijodbenzoldiazoniumfluoborat 2,e-Dimethyl-S-nitrobenzoldiazoniumfluoborat 2 -Äthoxy-4, 6-dibrombenzoldiazoniumf luoborat 4-Methoxy-2,6-dibroiribenzoldiazoniumfluoborat 2,6-Dimethoxy-3,5-dibrombenzoldiazoniumfluoborat 2, 6-Dimethoxy~4-nitrobenzoldiazoniumfluoborat 2, 5-Dimethyl-4, 6-dibronibenzoldiazoniuinf luoborat

Beispiel 5

Bei 5 - 1O°C wird eine Lösung folgender Zusammensetzung bereitet, die auf Filterpapier imprägniert und bei 40 C getrocknet wird:

2-Methyl-6-chloranilin 0,14 g

Natriumnitrit 0,07 g

Metaphosphorsäure 10,0 g

Wasser, dest. ad 100,0 ml

Dieses Testpapier wird mit einer lO%igen Lösung Phosphorsäure-diphenylester in Essigester nachimprägniert und bei getrocknet.

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Analoge Testpapiere kann man mit äquimolaren Mengen folgender Aniline herstellen:

2, 6-Dimethyl-3-bromanilin
2,6-Dimethyl-4-bromanilin
2,6-Dimethoxy-3-bromanilin
2,6-Dimethoxy-4-chloranilin

Die Eigenschaften der Testpapiere entsprechen in etwa denen der Beispiele 1 und 4.

Beispiel

Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 40 C getrocknet;

2,4,e-Trichlorbenzoldiazonium-toluolsulfonat 0,3 g Metaphosphorsäure 10,0 g

Wasser, dest. ad 100,0 ml

Dieses Papier wird mit einer l0%igen Lösung von handelsüblicher i-Octy!phosphorsäure in Methylenchlorid ηachimprägniert. Diese Säure ist ein Gemisch aus ca. 55 % Diester und 45 % Monoester der Phosphorsäure mit isomeren C₀-Alkoholen.

Die Eigenschaften dieses Testpapiers entsprechen denen von Beispiel 1.

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Praktisch die gleichen Eigenschaften besitzen Testpapiere, die äquimolare Mengen der folgenden Diazoniumsalze enthalten:

2,4, 6-Tribron±>enzoldiazonium-naphthalindisulfonat 2,4,6-Tribrom-3-methylbenzoldiazoniumf luoborat 2-Methyl-4,e-dibrom-S-chlorbenzoldiazoniumfluoborat. 2,4,6-Tribrom-3-methoxybenzoldiazoniumfluoborat 2,3,6-Tribrom-benzoldiazoniumfluoborat

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Claims

Patentansprüche

in welcher Χ^σ ein stabilisierendes Anion und R, und R ein Halogenatom, eine niedere Alkyl- oder Alkoxygruppe und R_ und R- Wasserstoff, ein Halogenatom, eine Nitro-, eine niedere Alkyl- oder Alkoxygruppe bedeuten, wobei der aromatische Ring entweder 1-3 Halogenatome oder eine Nitrogruppe, aber nicht beide gemeinsam, enthält,

und eine für die Kupplungsreaktion ausreichende Menge einer Säure enthalten.
2. Testpapiere gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich einen Aktivator enthalten.

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3. Testpapiere gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Diazoniumsalz ein 2,6-Dichlorbenzoldiazoniumsalz enthalteti .
4. Testpapiere gemäß Anspruch 1 und 2„ dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Stabilisier- tmd/oder Netzmittel enthalten .
5. Verwendung von Dxazonxumsalzen der allgemeinen Formel I
zur Herstellung von Testpapieren zum Nachweis von Bilirubin in Körperflüssigkeiten.

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