DE1271660B

DE1271660B - Verfahren zur Herstellung eines Enzymkomplexes

Info

Publication number: DE1271660B
Application number: DEP1271A
Authority: DE
Inventors: Eunice Jean Napier
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1964-05-26
Filing date: 1965-03-26
Publication date: 1968-07-04
Also published as: NL6506419A; IT1035001B; US3330738A; NL145901B; BE664444A; FR1568722A; GB1048887A; DK114402B

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

C12d

Deutsche Kl.: 6 a - 22/04

Nummer: 1271660

Aktenzeichen: P 12 71 660.8-41 (G 43709)

Anmeldetag: 26. Mai 1965

Auslegetag: 4. Juli 1968

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Enzymkomplexes mit Protease-, Laminarinase-, Chitinase-, Keratinase-, Ekstase- und Lipaseaktivität sowie cytolytischer Wirkung.

Enzympräparate finden in der Industrie zunehmende Verwendung für verschiedene Zwecke. So finden z. B. proteolytische Enzyme zahlreiche Anwendungen, z. B. in der Back-, Gerberei- und Brauindustrie. Aus den britischen Patentschriften 810566, 860 312, 931635 sowie aus der USA.-Patentschrift 2848 371 und der französischen Patentschrift 1190 658 sind Enzyme bekannt, die lediglich keratinolytische oder proteolytische Aktivität besitzen. In der britischen Patentschrift 911103 wird ein Enzym beschrieben, das sowohl proteolytische als amylolytische Aktivität aufweist.

Demgegenüber wurde nun ein Bakterium gefunden, das einen Enzymkomplex mit besonders wertvollen Eigenschaften, so z. B. einem breiten Wirkungsspektrum zusammen mit hoher Spaltgeschwindigkeit, produziert.

Das Bakterium, das isoliert wurde und das den neuen Enzymkomplex produziert, gehört zur Gattung Cytophaga. Es wurde in der »National Collection of Industrial Bacteria« in Aberdeen, Schottland, unter der Nummer NCIB 9497 hinterlegt. Das Bakterium wird im folgenden als Cytophaga NCIB 9497 bezeichnet.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Enzymkomplexes geschaffen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Bakterium Cytophaga NCIB 9497 auf oder in einem üblichen, assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltenden Nährmedium 'unter aeroben Bedingungen und üblichen Temperaturen züchtet.

Zu den besonders brauchbaren Stickstoffquellen zählt Pilzmycel, wie Mycel der Gattungen Cephalosporium oder Penicillium, außerdem ist als Stickstoffquelle Malzextrakt, Fleischextrakt, Pepton und/ oder Maisquellwasser geeignet.

Das Bakterium Cytophaga NCIB 9497 wächst auch zufriedenstellend auf einem Nährmedium, das Fleischextrakt, Pepton und Natriumchlorid enthält.

In einigen Fällen kann ein Nährmedium erforderlich sein, das unter anderen assimilierbaren Kohlenstoffquellen Kohlenhydrate enthält; geeignete Kohlenhydrate sind Saccharose, Maltose und/oder Glucose.

Die Züchtung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 26° C durchgeführt.

Da das Mycel der Stämme Cephalosporium und

Verfahren zur Herstellung eines Enzymkomplexes

Anmelder:

Glaxo Laboratories Limited,
Greenford, Middlesex (Großbritannien)

Vertreter:

Dr. F. Zumstein, Dr. E. Assmann,

Dr. R. Koenigsberger

und Dipl.-Phys. R. Holzbauer, Patentanwälte,

8000 München 2, Bräuhausstr. 4

Als Erfinder benannt:
Eunice Jean Napier,
Mattingley, Hampshire (Großbritannien)

ao Beanspruchte Priorität:

Großbritannien vom 26. Mai 1964 (21770)

Penicillium sich besonders gut als Stickstoffquelle eignet, ist es möglich, die Abfall-Mycelrückstände aus der Herstellung von Antibiotika zu verwenden. Spurenelemente, die notwendig sein können, umfassen Magnesium, Eisen und Zink; der pH-Wert des Mediums liegt vor der Sterilisation zwischen 5,0 und 8,0 und vorzugsweise zwischen 5,5 und 6,0. Die Kultivierung wird bei einer Temperatur zwischen 20 und 35° C, vorzugsweise zwischen 22 und 32° C, gehalten; geeignete Kulturzüchtungszeiten erstrecken sich auf 20 bis 50 Stunden.

Die entstehende Kulturflüssigkeit kann als solche auf Grund ihrer enzymatischen Aktivität verwendet oder der Enzymkomplex kann auch isoliert werden. Die Isolierung kann einfach dadurch bewirkt werden, daß die gesamte Nährlösung getrocknet wird, oder die Nährlösung kann wahlweise geklärt werden, z. B. durch Zentrifugieren, und die klare Lösung kann getrocknet werden, z. B. durch Gefriertrocknung. Gewünschtenfalls kann der Enzymkomplex einer gewissen Reinigung unterworfen werden, z. B. nach in der Enzymtechnologie üblichen Methoden, wie Ausfällung aus wäßriger Lösung mit Protein-Ausfällungsmitteln, wie Aceton oder Ammoniumsulfat, Dialyse usw. Der Enzymkomplex kann beispielsweise auf Kaolin durch Zusatz von 20 % (G/V) oder mehr Ammoniumsulfat zu der Nährlösung niedergeschlagen werden.

809 568/204

3 4

Das relativ unreine Enzymsystem, das nach dem Wie gezeigt wurde, besitzt der Enzymkomplex eine

erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen wird, kann zusätzliche lytische Wirkung gegen verschiedene

in Form eines trockenen, frei fließenden, schwach pathogene Fungi, z.B. M.canis, Trichophyton rubrum

cremefarbigen Pulvers vorliegen, das bei 4° C und T.sulphureum.

monatelang stabil ist. Die Substanz löst sich in Was- 5 Die Fähigkeit, Pilzmycel aufzulösen, erlaubt auch

ser bei einer Konzentration von 0,1 % und ergibt die Verwendung des erfmdungsgemäßen Enzymkom-

eine opaleszente Lösung. plexes beim Einsatz von Abf allmycel aus der Anti-

Wie oben erwähnt, besitzt der neue erfindungs- biotikaproduktion, besonders von Cephalosporin-

gemäße Enzymkomplex unter anderem Protease-, produkten. So kann z. B. solches Abfallmycel mit

Laminarinase- und Chitinasewirkung. Der Enzym- io dem Enzym abgebaut werden, und das so hergestellte

komplex besitzt auch Keratinase-, Elastase- und lösliche Material kann als Nährmedium bei der wei-

Lipaseaktivität, ebenso wie die Fähigkeit, die Myce- teren Fermentierung verwendet werden. Der Grad,

lien verschiedener Pilzorganismen aufzulösen. bis zu dem der Enzymkomplex auf Pilzmycelien

Die Wirkung des Enzymkomplexes kann z. B. wirkt, hängt von der Art des betreffenden Mycels

durch seine Fähigkeit gezeigt werden, Gelatine und 15 ab. Im Fall von Cephalosporium und den drei oben-

Kasein zu lösen, durch seine Wirkung auf Keratine erwähnten Dermatophytenarten findet z. B. eine voll-

und seine auflösende Wirkung gegen verschiedene ständige Lösung der Zelle statt. In anderen Fällen,

Pilzmycelien, z. B. Schimmelpilze der Gattung Peni- z. B. bei Penicillium chrysogenum, Aspergillus fumi-

cillium und Cephalosporium. Seine ungewöhnlich gatus und Rhizopus nigricans, findet jedoch insofern

hohe Spaltgeschwindigkeit ist besonders hervorzu- 20 eine verstärkte Wirkung statt, daß die jungen Hy-

heben. phen schnell semitransparent werden, der Zellen-

Der überraschende technische Fortschritt des er- inhalt verschwindet oder plasmolysiert wird. Obwohl

findungsgemäßen Ll-Enzymsystems ist unter ande- eine geringe Menge N-Acetylglucosamin freigesetzt

rem darin zu erblicken, daß es auf Grund seiner un- wird, bleiben die Zellwände im wesentlichen unver-

gewöhnlichen Kombination von Enzymen eine große 25 ändert.

Mannigfaltigkeit von Anwendungsmöglichkeiten auf- Die Keratinasewirkung des erfindungsgemäßen

weist: Enzymkomplexes ist ausgeprägt, wobei das Enzym

Backen ^au^ ^das **^{aar und das} Stratum corneum zu wirken

Herstellung von Getreidenährmitteln, scheint.

Mürbemachen von Fleisch, ³° ^Der erfindungsgemäße Enzymkomplex kann in

Kältestabilisierung von Bier, ^{einer Art und Weise} verwendet werden, die in der

Herstellung von Tiernahrungsmitteln, Enzymtechnologie üblich ist. Beim Auflösen von

Herstellung von Proteinhydrolysaten, Pilzmycel zeigt das Enzym em Optimum an pH und

Beizen und Enthaaren von Häuten, Wirkungstemperatur Λ ^der Größenordnung von

Fleckenentfernung in der Trockenreinigung, 35 pH 7 und 37° C. Bei der proteolytischen Aktivität

Entschlichten von Textilien, ^betra& ^das Opümum an pH und Temperatur etwa

medizinische Verwendungszwecke, einschließlich P^H ° ^{und 37} . ^c· ^De,^r Enzymkomplex ist nicht in-

Lösen von Wundklammern und Behandlung duktiv Die lytische Aktivität gegen Pilzmycelien geht

von Entzündungen, Blutgerinnseln und Quet- ^{bei 50 c} ™^d darüber schnell verloren, die pro-

schuneen ⁴° t^eotyt^lscne Aktivität bei 60 C und darüber.

Im folgenden wird eine Darstellung der Eigen-

Zwei Anwendungsgebiete verdienen besonders schäften des Bakteriums Cytophaga NCIB 9497 gehervorgehoben zu werden, da sie den erfindungsge- geben,
maß zu erzielenden überraschenden technischen
Fortschritt besonders deutlich machen: 45 Morphologie

a) Lysis von Pilzhyphen: Der erfindungsgemäß Beobachtet mit Hilfe eines Phasenkontrastmikrohergestellte Enzymkomplex kann zur Lysis von skops mit einem X20-Objektiv nach dem Züchten in Pilzhyphen, wie z. B. Dermatophyten, herange- einer Nährlösung 24 Stunden bei 20° C:

zogen werden Es muß besonders hervorgehoben _{Stdf k d Stäbch ziemlich dü}
werden daß die Lysis wirksamer und vollsten- _seitenparallel Enden abgerundet, einzeln und diger IS^ als sie mit einem kunstlichen Gemisch _paarwe_ise. Ähnliches Aussehen in Pepton-Wasall der Enzyme erreicht werden kann, die dafür f. „„ , _q1,_q„„„ 1, · o_no ^
ui * · j j η · j· v» i j* ·ι j τ 11 sex und ebenso bei 30 C.
bekannt sind, daß sie die Bestandteile der Zellwand angreifen (Chitin, Laminarin, Protein). Gram-Färbung von Agar-Nährmedium, 3 Tage bei Hierin ist zweifellos ein überraschender Vorteil 20° C:
gegenüber dem Stand der Technik zu erblicken. Gram-negativ, kurze, gerade Stäbchen, Seiten-

b) Verwendung beim Waschen: Der erfindungsge- parallel, Enden abgerundet; die Anfärbung zeigt maß hergestellte Enzymkomplex ist besonders ein ungleichmäßiges gestreiftes Aussehen. Ähnnützlich beim Waschen, und in diesem Fall 60 liches Aussehen auf Glucosepepton-Agar, Anstellt die Anwesenheit einer Anzahl von Pro- färbung erfolgt auch auf Blutagar.

teasen einen bemerkenswerten Vorteil dar, da

die verschiedenen Arten von Flecken, die üb- Aussehen der Kolonien

licherweise für verschmutzte Wäsche und Klei- . _., . _ , . _nnn _

dung in Frage kommen (z.B. Blut, Schweiß, 6_S Nahragar, 4Tage bei 20 C:

Nahrungsmittel usw.), offensichtlich einen weiten Gelblich, durchscheinend, kreisförmig, konvex,

Bereich von Proteasen erfordern, um wirksam vollständig, glatt, klar;

entfernt werden zu können. 1,0 bis 1,5 mm Durchmesser, stechender Geruch.

5 6

Glucosepepton-Agar, 4 Tage bei 20° C: wurden mit einer Schlaufe voll einer Kultur des

Gelblich, durchscheinend, kreisförmig, konvex, Mikroorganismus Cytophaga NCIB 9497 beimpft

vollständig, glatt, klar, schleimig; «^nd ** ²f.^C »* ™ S"¹™^! i? ^Cm

1,0 bis 2,5 mm Durchmesser, stechender Geruch. Ausschlag) bei 200 UpM mkubiert Nach 2 Tagen

5 Inkubation zeigte die Kultur starke lytische Aktivität

Blutagar, 4 Tage bei 20° C: gegen Cephalosporium acremonium (Brotzu) IMI

4Q137
Grünlichgelb, durchscheinend, kreisförmig, kon-

vex, vollständig, glatt, klar; Beispiel 2

1,0 bis 2,0 mm Durchmesser, stechender Geruch, _v . „. .

tiin.» MHmnivcP ¹⁰ Konische 250-ml-Flaschen, die 100 ml des folgen-

den Mediums enthielten:

Wachstum in flüssigem Medium Fleischextrakt 1,0%

Nährlösung, 2 Tage bei 20° C: Natriumchlorid "'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 0,5%
Schwaches Wachstum, sehr schwache gleich- ¹⁵ (mit Natriumhydroxyd auf pH 8 einmäßige Trübung, geringe klebrige Ablagerung; gestellt, 1 Stunde gekocht, filtriert,
schwaches Wachstum auch bei 30° C. danach mit Salzsäure auf pH 7,2

Pepton-Wasser, 2 Tage bei 20 und 30° C: eingestellt)

Schwaches Wachstum, sehr schwache gleich- ^a° ™^{den mk}. einer Schlaufe voll einer Kultur des mäßige Trübune Mikroorganismus Cytophaga NCIB 9497 inokuliert

und bei 26° C auf einer Schüttelvorrichtung (5 cm

Glucosepepton-Wasser, 2 Tage bei 20 und 30° C: Ausschlag) bei 200 UpM inkubiert. Nach 1 Tag In-

Mäßiges Wachstum, schwache gleichmäßige ^kubati°^{n zei}S^{te die Kultur starke 1}^d"^{5 Aktivität} Trübung. ^a5 gegen C. acremonium.

Beispiel 3

Beziehung zwischen Temperatur und Wachstum _TT , „ _, ,. .._,.., „

Unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 2,

Kein Wachstum bei 5 oder 10° C. Beschränktes jedoch mit dem folgenden Medium:

Wachstum bei 37° C. Unempfindlich gegen Penicil- 30 Maisquellwasser 2,5%

Im und Streptomycin. Empfindlich gegen Chlor- Ammoniumacetat 0,55%

amphenicol und Hydroxytetracyclm. Sucrose 2 5%

Keine Säurebildung oder Gasentwicklung aus (mit Natriumhydröxyd" auf' pH' ö',5

Glucose, Saccharose, Maltose, Mannitol oder Starke pincrecteim

bei 20 bis 30° C. Keine Reaktion in Glucose-Hugh 35 «"t>«"*"V

und Leifsons-Medium. zeigte die Kultur nach 1 Tag Inkubation lytische

Lackmusmilch peptonisiert und Indikator reduziert Aktivität gegen C.acremonium.

bei 20° C, peptonisiert bei 30° C. .

Gelatine verflüssigt bei 20° C. B e 1 s ρ 1 e 1 4

Kovacs Oxidase positiv bei 20 und 30° C. 40 3 1 des folgenden Mediums, das 30 Minuten bei

Indol nicht gebildet, Methylrot negativ, Acetyl- 120° C sterilisiert worden war:

methylcarbinol nicht gebildet, Nitrat nicht reduziert Dampfgepreßtes Mycel von

bei 20 und 30° C. C acremonium 6 0%

Ammoniak gebildet von Pepton bei 20 und 30° C. Dikalium-hydrogen-phosphät' ".'.'.'.'. 0^07%

Catalase negativ, Urease negativ bei 20 und 30° C 45 Kalium-dihydrogen-phosphat 0,03%

Citrat als einzige Kohlenstoffquelle bei 20 und 30° C Magnesiumsulfat (7H₀O) 0,05%

verwendet Keine Lipase oder Lecithmase auf Eigel- Eisensulfat (7 H₂O) .: 0,001 %

bagar bei 20 oder 30° C nachgewiesen. Zinksulfat (7 H₂O) 0,0001 %

Diese diagnostischen Reaktionen die gemäß _{Glucose (ge}\_ren ² _nt sterilisiert) 0,25%

»Bergey s Manual of Determinative Bacteriology«, 50

7. Auflage, 1957 (Bailiiere Tindall and Cox, Lon- wurde mit 60 ml einer gut gewachsenen Kultur des don), durchgeführt wurden, reihen den Mikroorga- Mikroorganismus Cytophaga NCIB 9497 beimpft, nismus zu den Flavobacteria (S. 309 bis 322) oder Der Fermenter wurde bei 26° C gehalten, mit Cytophaga (S. 858 bis 863) ein. Flavobacteria und 550 UpM gerührt und belüftet mit 3 1 Luft pro Cytophaga werden jetzt zusammen als Cytophaga 55 Minute 20 Stunden lang, mit 1 l/Min, für die nächklassifiziert, sten 4 Stunden und mit 0,5 1 für die nächsten

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung: 2 Stunden.

Die Kultur wurde durch Zentrifugieren geklärt

Beispiel 1 und die überstehende Flüssigkeit gefriergetrocknet,

T^ · τ. «η !πι. j· λα 1 j ü 1 ^{6o was} 6,6 g eines cremefarbigen Feststoffes gab, der

Konische 250-ml-Flaschen, die 40 ml des folgen- _l _{tische Aktivität gegen} c.acremonium und proteoly-

den Mediums enthielten: _t[_{sche Aktivität gegen Kasein aufwies}.

Maltose 4,0% „ . . , _c

Malzextrakt 2,4% Beispiel 5

Pepton 1,0% 65 1,5 1 Kulturflüssigkeit, die wie im Beispiel 4 ge-

Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 100% wachsen war, wurde von Feststoffen durch Zentri-

(mit Natriumhydroxyd auf pH 7 ein- fugieren getrennt, mit Essigsäure auf pH 6,1 einge-

gestellt) stellt und dann unter Vakuum unter 40° C auf

250 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde langsam zu 21 Aceton gegeben und auf 5° C unter heftigem Rühren gekühlt. Das Produkt, das eine schwachbraune Farbe aufwies, wog nach dem Waschen mit Aceton und Trocknen über Phosphorpentoxyd 7,4 g. Das Produkt war hochaktiv und enthielt die Gesamtaktivität der ursprünglichen Nährlösung.

Beispiel 6

vom Filter entnommen worden waren, wurden mit ml Wasser vermischt und mit 1 g erfindungsgemäßem Enzym versetzt. Das Gemisch wurde Stunden unter gelegentlichem Rühren bei 37° C gehalten und dann bei Zimmertemperatur weitere Stunden stehengelassen.

Von der Abbaulösung wurde eine Stickstoffbestimmung durchgeführt und dann ein Penicillinnährmedium hergestellt, bei dem das Maisquellwasser bei 11 einer Kulturflüssigkeit, die wie im Beispiel 4 io derselben Stickstoffkonzentration (0,39 %) durch die gewachsen war, wurde von Feststoffen durch Zentri- obige Abbaulösung ersetzt wurde,
fugieren getrennt und mit 472 g Ammoniumsulfat Schüttelkolben-Penicillinfermentierungen wurden

versetzt. Das Gemisch wurde gerührt, bis das Am- auf diesem Medium durchgeführt, wobei ein durchmoniumsulfat gelöst war, und dann wurde das aus- schnittlicher Titer von 3975 E/ml nach 3 Tagen und gefallene Produkt abfiltriert und getrocknet, was 19 g 15 7590 E/ml nach 5 Tagen erhalten wurde. Eine des Materials ergab, das annähernd 50 % der Aktivi- »Kontrolk-Fermentierung, die in derselben Zeit mit tat der ursprünglichen Nährlösung enthielt. dem selben Medium durchgeführt wurde, mit Aus-

. ·₁₇ nähme, daß die Stickstoffquelle aus Maisquellwasser

Beispiel 7 bestand, ergab einen durchschnittlichen Titer von

21 einer Kulturflüssigkeit, die wie im Beispiel 4 20 2785 E/ml nach 3 Tagen und 7795 E/ml nach gewachsen war, wurde von Feststoffen durch Zentri- 5 Tagen,
fugieren getrennt und dann langsam unter Rühren
in 201 eisgekühltes Aceton geschüttet. Das Produkt

wurde abfiltriert, mit Aceton gewaschen und über Phosphorpentoxyd getrocknet; es wog 10 g und enthielt die Gesamtaktivität der ursprünglichen Nährlösung.

Beispiel 8

Stücke einer frischen Kalbshaut wurden in eine l°/oige Lösung des wie im Beispiel 7 hergestellten Enzympräparats in M/50 Tris-Puffer bei pH 7 eingetaucht. Nach 18 Stunden Einwirkung bei 37° C ließ sich das Haar durch leichtes Kratzen mühelos entfernen. Ähnliche Behandlung in Tris-Puffer ohne das Enzympräparat ließen das Haar intakt, so daß es auch durch heftiges Ziehen nicht entfernt werden konnte.

Beispiel 9

40

Mycel von Trichophyton rubrum (einer der Fungi, der für Dermatophytose der Füße verantwortlich ist) wurde durch Züchtung in einem Schüttelkolben bei 24stündiger Inkubation bei 26° C in einem Pepton-Malzextrakt-Medium hergestellt. Das Mycel wurde abfiltriert und in einer Konzentration von 0,2% in einer O,2°/oigen Lösung des nach Beispiel 7 hergestellten Enzympräparats in M/50 Tris-Puffer bei pH 7 suspendiert. Nach 3stündigem Stehen bei 27° C hatte sich das Mycel vollständig aufgelöst.

Beispiel 10 Adsorption des erfindungsgemäßen Enzyms an Kaolin

Zu 600 ml einer wie im Beispiel 4 hergestellten Fermentationslösung wurden 1,65 g Kaolin und anschließend portionsweise 180 g Ammoniumsulfat unter mechanischem Rühren bis zur Lösung zugegeben. Das Kaolin-Proteingemisch wurde durch Filtration getrennt, mit Wasser gewaschen und dann bei Zimmertemperatur in einem Vakuumofen getrocknet. Das Produkt wog 11,7 g und enthielt die Gesamtaktivität der ursprünglichen Nährlösung.

Beispiel 11 Enzymatisches Lösen von Penicillin-Pilz

200 g eines feuchten Mycels von einer handelsüblichen Penicillinfermentierung, die bei der Ernte

60

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Enzymkomplexes mit Protease-, Laminarinase-, Chitinase-, Keratinase-, Elastase- und Lipaseaktivität sowie cytolytischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bakterium Cytophaga NCIB 9497 auf oder in einem üblichen assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen und üblichen Temperaturen züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stickstoffquelle PiIzmycel einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pilzmycel ein Mycel der Gattungen Cephalosporium oder Penicillum einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stickstoff quelle Malzextrakt, Fleischextrakt, Pepton und/oder Maisquellwasser einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltendes Nährmedium, ein Nährmedium einsetzt, das Fleischextrakt, Pepton und Natriumchlorid enthält.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium einsetzt, das unter anderen assimilierbaren Kohlenstoffquellen Kohlehydrate enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlehydrate Saccharose, Maltose und/oder Glucose einsetzt.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 26° C durchführt.

In Betracht gezogene Druckschriften: Französische Patentschrift Nr. 1190 658; britische Patentschriften Nr. 810 566, 860 312, 911103, 931635;
USA.-Patentschrift Nr. 2 848 371.