DE1195434B - Verfahren zur Gewinnung von Nisin - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von NisinInfo
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Description
DEUTSCHES
PATENTAMT
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Int. Cl.:
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C12d
Deutsche Kl.: 30 h - 6
1195434
A 37151IV a/30 h
7. April 1961
24. Juni 1965
A 37151IV a/30 h
7. April 1961
24. Juni 1965
Die Erfindung betrift die Herstellung bzw. Gewinnung von Nisin unter Züchtung von Streptococcus
lactis in Milcheiweiß enthaltendem Kulturmedium.
Nisin ist der Name einer Substanz mit Inhibitorenwirkung bzw. einer Substanz, die beim Wachsen
eines Nisin produzierenden Stammes von Streptococcus lactis in einem Kulturmedium gegeben
wird. Nisin hat vor allem Inhibitorenwirkung gegen verschiedene Mikroorganismen, einschließlich vieler
Arten von Clostridien-Organismen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird zur Herstellung von Nisin unter Züchtung von Streptococcus
lactis in Milcheiweiß enthaltenden Kulturmedien so vorgegangen, daß das Milcheiweiß enthaltende
Kulturmedium zunächst durch Zusatz von proteolytischen Enzymen teilweise abgebaut, die Enzyme
alsdann inaktiviert und die festen Anteile an unverdautem Protein aus der Flüssigkeit abgeschieden
werden, worauf das Kulturmedium, gegebenenfalls nach vorheriger Sterilisierung, mit Streptococcus
lactis beimpft und daraus nach üblicher Züchtung das Nisin in bekannter Weise gewonnen wird.
Es ist bereits bekannt, Nisin in einem Milchkaseinogen
enthaltenden Medium durch Züchtung von Streptococcus lactis herzustellen, dann das
Kasein bzw. p-Kasein auszufällen und das Nisin durch Schaumanreicherung zu gewinnen. Überraschenderweise
lassen sich aber die Ausbeuten gegenüber diesem an sich befriedigenden Verfahren bei
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wesentlich erhöhen. Dies ist wahrscheinlich darauf
zurückzuführen, daß Verluste durch Adsorption von Nisin an den nach Ausfällung zu entfernenden
Topfen vermieden werden und die enzymatisch verdauten Proteine offenbar wertvoll als Aufbaustoffe
für die Nisin erzeugenden Organismen sind.
Zur Durchführung des Verfahrens kann als Nährmedium Milch im weitesten Sinne verwendet werden,
z. B. Vollmilch oder Magermilch als auch Milch, welche aus Vollmilch- oder Magermilchpulver
unter Veränderung der Feststoffgehalte wiederhergestellt wurde, und evaporierte Milch.
Beispiele für geeignete proteolytische Enzyme für die Verwendung in dem vorliegenden Verfahren sind
Papain, Rennin, Pepsin oder Trypsin.
Die Ausfällung des unerwünschten Proteins kann durch pH-Änderung, welche die Verdauung begleitet
oder in einigen Fällen auf Grund des pH, bei welchem die Verdauung ausgeführt wird, bewirkt werden.
Gewisse proteolytische Enzyme, wie Rennin, haben zusätzlich einen koagulierenden Effekt auf
Verfahren zur Gewinnung von Nisin
Anmelder:
Aplin & Barrett Limited,
Yeovil, Somerset (Großbritannien)
Vertreter:
Dr. M. Eule
und Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. W. J. Berg,
Patentanwälte, München 2, Hilblestr. 20
Als Erfinder benannt:
Ronald Henry Hall, Yeovil, Somerset
(Großbritannien)
Beanspruchte Priorität:
Großbritannien vom 8. April 1960 (12 584)
unverdautes Protein. Das unverdaute Protein kann durch übliche Verfahren, wie z. B. durch Zentrifugieren,
abgetrennt werden.
Die Inaktivierung des Enzyms nach dem Verdauungsvorgang und dem Ausfällen mindestens eines
Teils des unerwünschten und unverdauten Proteins kann gleichzeitig bewirkt werden durch Erhitzen der
Milch nach dem Verdauungsvorgang, wobei die Ausfällung durch eine Änderung des pH-Wertes, welche
den Verdauungsvorgang begleitet, unterstützt wird.
Der ausgefällte Topfen kann durch Absitzenlassen und Absaugen der klaren Flüssigkeit oder durch
Zentrifugieren entfernt werden.
Bei der Verwendung von roher Milch als Ausgangsmaterial wird vorzugsweise eine Hitzebehandlung
bei einer Temperatur oberhalb des Siedepunktes vor Zugabe des Enzyms bewirkt, um sowohl die
Milch zu sterilisieren, als auch das Eiweiß zu denaturalisieren; bei Verwendung von Milch, welche aus
Vollmilch- oder Magermilchpulver wiederhergestellt ist, ist ein solches Vorerhitzen unnötig.
Das Wachstum in dem neuen Kulturmedium für Streptococcus lactis und die Konzentrierung und/
oder Isolierung des Nisins wird wie üblich geführt. So kann das Nisin gewonnen werden durch
So Durchleiten von Luft durch das Nisin enthaltende
Kulturmedium, gegebenenfalls nach Zusatz geringer Menge von 0,1 Gewichtsprozent nicht übersteigen-
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den oberflächenaktiven Mitteln, Sammeln des Schaums, Einstellen des pH-Wertes auf 2,5, Zusatz
von 25 % Natriumchlorid und Gewinnung des ausgefällten Festkörpers durch Zentrifugieren und anschließende
Gefriertrocknung.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter erläutert.
45401 Magermilch werden schnell auf 105° C erhitzt,
auf dieser Temperatur 5 bis 15 Sekunden gehalten und dann auf 37° C abgekühlt und 450 g Papain
(BPC), suspendiert in einer geringen Menge steriler Milch, zu der Flüssigkeit, deren pH-Wert auf
6,5 eingestellt ist, hinzugefügt. 21 Toluol werden hinzugefügt, um bakterielles Wachstum zu unterdrücken.
Die Verdauung wird 20 Stunden lang bei 37° C fortgesetzt und die Flüssigkeit dann auf
100° C erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Die festen Anteile werden von der Flüssigkeit abgetrennt
und verworfen. Die Flüssigkeit wird bei 115° C sterilisiert und mit einem Enzym erzeugenden
Stamm von Streptococcus lactis geimpft. Nach dem Wachsen kann das Nisin in bekannter Weise
oder wie oben näher beschrieben extrahiert werden.
454 kg Trockenmilchpulver wird mit Wasser aufgenommen unter Bildung einer Lösung mit 20%
Gesamtfeststoffgehalt, der pH-Wert auf 6,5 eingestellt, auf 700C erhitzt und 450 g Papain (BPC),
welches in etwas Wasser suspendiert ist, hinzugefügt, und die Verdauung wird 5 Stunden lang bei
70° C durchgeführt und die Masse dann auf 100° C erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Die Flüssigkeit
wird mit 2270 1 Wasser verdünnt und die Verfahrensweise von Beispiel 1 dann angeschlossen.
4540 1 Magermilch werden mit Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 4,7 angesäuert und das ausgefällte
Kasein von der Molke (34001) als Schlamm (11401) entfernt. 450 g Papain werden zu 9001 der
Kaseinaufschlämmung, welche auf 37° C erhitzt worden ist und deren pH-Wert auf 6,5 eingestellt
worden ist, hinzugefügt und 400 ml Toluol hinzugesetzt. Die übrigen 2401 der Kaseinaufschlämmung
werden für diese Verfahren nicht benötigt und können wie gewünscht behandelt werden, z. B. als Tierfutter,
getrocknet u. dgl. Man läßt die Verdauung bei dieser Temperatur 40 Stunden lang ablaufen, entfernt
dann alle verbleibenden Festteile und fügt die klare Lösung der Molke zu. Das Gemisch wird dann
sterilisiert und mit einem Nisin erzeugenden Stamm von Streptococcus lactis geimpft.
45401 Magermilch werden auf 105° C erhitzt, auf
37° C gekühlt und 500 g in einer geringen Menge steriler Milch suspendiertes Pepsin (BPC) hinzugefügt.
Der pH-Wert des Gemisches wird auf 1,5 mit 50%iger Chlorwasserstoffsäure eingestellt und die
Temperatur 12 Stunden lang auf 37° C gehalten. Das Gemisch wird dann auf 100° C erhitzt, um das
Enzym zu inaktivieren, und die Feststoffe abgeschieden und verworfen. Die Flüssigkeit wird bei 115° C
sterilisiert und mit einem Nisin erzeugenden Stamm von Streptococcus lactis geimpft. Nach dem Wachsen
kann das Nisin in an sich bekannter Weise oder wie oben näher beschrieben extrahiert werden.
13501 evaporierte Magermilch mit einem Gesamtfeststoffgehalt
von 30% werden auf 37° C erhitzt,
ao der pH-Wert auf 7,8 mit Natriumhydroxyd eingestellt und 500 g Trypsin und etwas Toluol hinzugefügt.
Die Temperatur wird 6 Stunden lang auf 37° C gehalten. Der pH-Wert wird dann mit Chlorwasserstoffsäure
auf 4,5 eingestellt und der überschüssige Feststoff entfernt. Der Flüssigkeitsteil wird verdünnt,
um eine Gesamtmenge von 4500 1 zu ergeben, und der pH-Wert mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt.
Die Flüssigkeit wird bei 115° C sterilisiert, wobei unter diesen Bedingungen die Inaktivierung
des Enzyms auftritt, und mit einem Nisin erzeugenden Stamm von Streptococcus lactis geimpft. Nach
dem Wachsen kann das Nisin in an sich bekannter Weise oder wie oben näher beschrieben extrahiert
werden.
Bei Entfernung des unverdauten Proteins, wie es oben beschrieben ist, wird die nachfolgende Aufbereitung
auf Nisin erleichtert.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von Nisin unter Züchtung des Mikroorganismus Streptococcus lactis in Milcheiweiß enthaltendem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß das Milcheiweiß enthaltende Kulturmedium zunächst durch Zusatz von proteolytischen Enzymen teilweise abgebaut, die Enzyme alsdann inaktiviert und die festen Anteile an unverdautem Protein aus der Flüssigkeit abgeschieden werden, worauf das Kulturmedium, gegebenenfalls nach vorheriger Sterilisierung, mit Streptococcus lactis beimpft und daraus nach üblicher Züchtung das Nisin in bekannter Weise gewonnen wird.In Betracht gezogene Druckschriften:
Österreichische Patentschrift Nr. 204179.509 597/365 6.65 © Bundesdruckerei Berlin
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