SU201249A1 - Способ получения ферментных препаратов - Google Patents

Description

Известны способы получени  ферментных препаратов путел культивировани  продуцирующих их микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники азота, с добавлением других питательных веществ, нацример углеводов и минеральных солей, необходимых дл  роста, при температуре 20-35°С в аэробных услови х с последующим выделением ферментных препаратов из биомассы одним из известных способов, например высаливанием сульфатом аммони , адсорбцией, высущиванием культуральной жидкости.

Согласно предлагаемому способу получают препараты с высокой активностью, содержащие протеолитические ферменты, способные к расщеПоТепию кератина, в сочетании с ламинариназой , хитиназой, эластазой и липазой. Дл  этого в качестве продуцирующих микроорганизмов используют бактерии рода Цитофага (Cytofaga) «NCIB 9497.

Предлагаемый способ заключаетс  в следующем .

Культуру бактерии рода Цитофага (Cytofaga ) «NCIB 9497 выращивают на питательной среде поверхностным способол или глубинным в аэробных услови х.

раллельны, концы закруглены, разделены, а иногда спарены между собой. Окрашивают по Граму после выдерживани  на питательном агаре в течение трех дней при 20°С. Грам - отрицательные, короткие, пр мые палочки с параллельными сторонами, концы закруглены, внещний вид окраски - неровные полоски.

Аналогичный внещпий вид имеют при выращивании на агаре, содержащем пептон и глюкозу . Окращивапие однородно после культивировани  на кров ном агаре.

Рост на различных средах. На агаре (четырехдневное культивирование при 20°С) -светло-желтые , просвечивают, округлой формы , выпуклые, полностью гладкие, лосн щиес , 1 -1,5 мм в диаметре, с острым запахом.

На агаре, пептоне и глюкозе (четырехдневное культивирование при 20°С) - светло-желтые , просвечивают, округлой формы, выпуклые , полностью гладкие, лосн щиес , слизеподобны , 1-2,5 мм Е диаметре, с острым запахом .

На кров ном агаре (четырехдневное культивирование при 20°С) - серовато-желтые, просвечивают, округлой формы, выпуклые, полностью гладкие, лосн щиес , 1 -1,5 мм в диаметре, с острым запахом.

назначительное липкое, т гучее и в зкое отложение . Слабый рост . отмечалс  также при

опор

.V- j «%-- „,

На воде, содержащей пептон (двухдневное культивирование при 20 и 30°С) - рост незначительный , очень слаба  неоднородна  замутненность .

На воде, содерл ащей пептон и глюкозу {двухдневное культивирование при 20 и 30°С)-умеренный рост, слаба , неоднородна  замутненность.

Зависимость между ростом и температурой. При температуре 5 или 10°С роста не наблюдаетс . Недостаточный рост при 37°С. Отсутствует чувствительность к пенициллину и стрептомицину. Чувствительность к хлорамфениколу и гидротетрациклину. Не вызывает образовани  кислоты или газообразных продуктов в результате воздействи  па глюкозу, мальтозу, маннитол или крахмал при 20 или 30°С. Отсутствует реакци  в среде по Хьюгу и Лейфсону, содержащей глюкозу.

Лакмусовое молоко пептопизируетс , а индикатор восстанавливаетс  при 20°С и нептонизируетс  при 30°С. Желатину разжижает при 20°С. Оксидаза по Коваку положительна При 20 и 30°С. Образовани  индола не происходит, метил-красный отрицателен, ацетометилкарбинол не вырабатываетс , аммиак выдел етс  из пептона при температурах 20 и 30°С. Цитрат утилизируетс  как источник углерода в виде зол  при 20 и 30°С. Образовани  липазы или лецитиназы на агаре, содержащем желток куриного  йца, не наблюдаетс  при 20 илп 30°С.

Питательные среды, используемые дл  культивировани , содержат главным образом источник азота с добавлением в случае необходимости углевода и (или) питательных солей . К числу источников азота относ тс  солодовый экстракт, м сной экстракт, пептон, замочна  жидкость кукурузы или зерна, однако , наиболее пригодным источником азота  вл етс  мицелий, подученный как отход в производстве антибиотиков. При этом необходимо отметить, что источник азота может полностью удовлетворить потребность выращиваемого организма Цитофага «NCIB 9497 в углероде или в других питательных сол х без их добавлени . Так, например, данный микроорганиз .м сможет развиватьс  на среде, состо щей только из м сного экстракта и пептона . В некоторых случа х добавление углеводов , например глюкозы, мальтозы, оказываетс  необходимым.

К числу элементов, которые также могут оказатьс  необходимыми, относ тс  магний, железо и цинк.

Культивируют Цитофагу «NCIB 9497 при температуре 20-35°С (оптимальной  вл етс  температура 26°С), рН среды находитс  в пределах 5-8, предпочтительно 5,5-6.

Образующуюс  культуральную жидкость можно или использовать непосредственно, или извлечь из нее ферментный комплекс одним из известных способов. Так, например, куль5 туральную жидкость высущивают или осветл ют (цептрифугированием), после чего высушивают (можно методом вымораживани ), получа  при этом неочищенный препарат. Дл  получени  очищенного препарата производ т осаждение последнего ацетоном илп высаливанием сульфатом аммони , или адсорбцией на каолине.

Полученный нрепарат содержит комплекс следующих ферментов: протеазу, ламинарина5 зу, хитиназу, кератиназу, эластазу и липазу. Этот комплекс ферментов способен вызывать распад мицели  у различных грибковых организмов , например плесени рода Пенициллиум и Цефалоспориум.

0 Способность вызывать распад грибкового мицели  позвол ет использовать вышеуказанный комплекс ферментов дл  уничтожени  отходов мицели  после производства антибиотиков , особенно продуктов цефалоспорина.

5 Полученный при этом растворимый материал может быть использован как питательна  среда дл  проведени  последующих процессов ферментации. Степень, до которой ферментный комплекс воздействует па грибковый мицелий, зависит от видов мицели  в каждом конкретном случае.

Отмечалось кератиназное действие комплекса ферментов, который действует, по-видимому . Не. волосы.

5 Способен разлагать желатину, казеин, воздействовать на кератин, причем действие его протекает быстро.

Данный комплекс можно использовать: в производстве хлебобулочных изделий; 0 при изготовлении блюд из хлебных злаков (например, овс нка, кукурузные хлопь );

дл  ускоренного созревани  м са с целью его разм гчени ;

дл  защиты от охлаждени  во врем  циво5 варени ;

в производстве кормов дл  животных; в производстве протеиновых гидролизатов; дл  м гчени  крупного кожевенного сырь  и обезволашиванп  щкур;

дл  удалени  п тен по методу сухой чистки; дл  удалени  щлихты с текстильных изделий;

в медицине.

Пример 1. Конические колбы (250 мл), содержащие по 40 мл следующей среды, (%): мальтоза4

солодовый экстракт2,4

пептон1

дистиллированна  вода - до 100.

Водородный показатель рН 7 установлен dOT на аппарате путем возвратно-поступательного движени  с амплитудой 5 см, действующей при 200 об/мин при температуре окружаюш .ей среды 26°С. Через два дн  после начала инкубации культура характеризуетс  сильным литическим действием по отношению к Цефалоснориум акремониум (Бротцу) «IMI -49137. При мер 2. Конические колбы (250 жл), содержащие 100 мл следующей среды, %: м сной экстракт1 пептон1 хлористый натрий0,5. Водородный показатель среды устанавливают до значени  рН 8 добавлением гидрата окиси натри , кип т т 1 час, фильтруют, довод т среду до рН 7,2 путем добавлени  сол ной кислоты, инокулируют с помощью петли культурой микроорганизма Цитофага «NCIB 9497 и инкубируют при температуре 26°С. Содержимое колб перемешивают на аппарате с возвратно-поступательным движением, с амплитудой 5 см, при 200 об/мин. Спуст  один день после начала инкубации культура характеризуетс  сильным литическим действием по отношению к «К. акремониум. Пример 3. З.Л среды следующего состава (стерилизована 30 мин при температуре 120°С), %: мицелий «К. акремониум, отжатый в сыром виде6 кислый фосфорно-кислый калий вторичный0,07 первичный0,03 сернокислый магний 7Н2О0,05 сернокислое железо 7Н2О0,001 сернокислый цинк 7Н200,001 глюкоза (стерилизована отдельно) 0,25. Инокулируют 60 мл хорошо разросшейс  культуры микроорганизма Цитофага «NCIB 9497. Культуру выдерживают при температуре 26°С, перемешивают при 550 об/мин и аэрируют путем пропускани  воздуха со скоростью 3л/мин в течение 20 час, затем следующие 4час - со скоростью 1 л/мин и в заключение 2 час - со -скоростью 0,5 л/мин. Культуру осветл ют центрифугированием и всплывшую жидкость лиофизуют. Получают 6,6 г твердого вещества кремовой окраски, обладающего литической активностью по отношению к «К- акремониум и протеолитической активностью по отношению к казеину. Пример 4. 1,5 л жидкой культуры, выращенной , как указано в примере 3, центрифугируют , довод т среду до рН 6,1 добавлением уксусной кислоты и затем концентрируют в вакууме при температуре ниже 40°С до объема 250 Л1л. Концентрат медленно добавл ют к 2 л ацетона, охлажденного до +5°С, при энергичном перемешивании. Продукт светлокоричневой окраски в количестве 7,4 г промывают ацетоном и высушивают над п тиокисью фосфора. Полученный продукт характеризуетс  высокой активностью. Пример 5. 2л жидкой культуры, выращенной , как указано в примере 3, освобождают от твердых примесей центрифугированием и затем медленно выливают при перемешивании в 20 .л ацетона, охлаждаемого льдом. Продукт отфильтровывают, промывают водой и высушивают над п тиокисью фосфора; вес продукта - 10 г. Продукт обладает полной активностью, присушей первоначальной жидкой среде. Пример 6. Кусочки свежей тел чьей шкуры погружают в 1%-ный раствор ферментного препарата (полученного, как описано в примере 5) в буферной среде «Трис М/50 при рН 7. Выдерживают 18 час при температуре 37°С, после чего волос ной покров легко удал ют, осторожно соскребыва . Диалогична  обработка в буферной среде «Трис без добавлени  приготовленного препарата оставл ет волос ной покров таким же, каким он был до обработки. Пример 7. Мицелий «Трихофитон рубрум (один из грибков, вызывающих грибковое заболевание ног) приготовл ют путем культивировани  в сосуде, приспособленном дл  встр хивани  в течение 24 час при температуре 26°С в среде, содержащей пептон и солодовый экстракт. Полученный мицелий отфильтровывают и суспендируют на уровне 0,2% в 0,2%-ном растворе заранее приготовленного ферментного препарата (полученного, как указано в примере 5) в буферной среде «Трис М/50 при значении рН 7. Мицелий полностью раствор етс  после трехчасовой выдержки при температуре 27°С. Пример 8. Адсорбци  ферментного препарата на каолине. К 600 мл ферментационной жидкой среды, полученной, как указано в примере 4, добавл ют 1,65 г каолииа, затем отдельными порци ми внос т 180 г сульфата аммони  при механическом перемешивании до полного растворени . Смесь каолина с протеином отдел ют фильтрованием, промывают водой и затем высушивают при комнатной температуре в вакуум-сушильном шкафу. Продукт весом 11,7 г обладает полной активностью, присущей первоначальной жидкой среде. Предмет изобретени  Способ получени  ферментных препаратов путем выращивани  продуцирующих их микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники азота, с добавлением других питательных веществ, необходимых дл  роста, например углеводов и минеральных солей, в аэробных услови х, с последующим выделением ферментных препаратов из полученной биомассы одним из известных способов, отличающийс  тем, что, с целью получени  препаратов с высокой активностью, содержащих протеолитические ферменты, способные к расщеплению кератина, а также ла7 мнкарииазу, хитиназу, эластазу и липазу, в качестве продуцирующих микроорганизмов ис8 пользуют бактерии рода Цитофага (Cytofaga) К° «NCIB 9497.