DE1300488B

DE1300488B - Verfahren zur Herstellung von Saeurephytase durch aerobe Zuechtung von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1300488B
Application number: DEI28669A
Authority: DE
Inventors: Ware James H; Shieh Tsuong R
Original assignee: International Minerals and Chemical Corp
Current assignee: International Minerals and Chemical Corp
Priority date: 1964-07-28
Filing date: 1965-07-28
Publication date: 1969-08-07
Also published as: NL6509747A; BR6571644D0; US3297548A; GB1064304A; DK108207C

Description

Zahlreiche Pflanzenspezies enthalten merkliche Men- 9142, Aspergillus awamori ATCC 11 382, Aspergillus gen Phosphor in chemischer Verbindung mit orga- saitoi ATCC 11362, Saccharomyces cerevisiae nischen Molekülen. So liegt beispielsweise neben dem NRRL-Y-6728 oder Hansenula subpelliculosa NRRL-Phosphorgehalt von Nukleinsäuren Phosphor auch Y-1683 verwendet. Das Nährmedium enthält als als Phytinphosphor vor. Wenn Stoffe pflanzlichen 5 bevorzugte assimilierbare Kohlenstoffquelle Mais-Ursprungs an Tiere mit einem Magen (d. h. Geflügel, mehl. Die Züchtung erfolgt vorzugsweise unter Schweine, Hunde, Katzen u. dgl.) verfüttert werden, submersen Bedingungen.

sind die Tiere im allgemeinen fähig, den Kohlen- Der Begriff »Säurephytase«, wie er hier verwendet

hydrat- und Proteingehalt zu verwerten. Sie sind wird, umfaßt eine Enzymaktivität, die bei einem jedoch nicht in der Lage, merkliche Mengen Phytin- io pH zwischen etwa 2 und 7 wenigstens etwas Phosphor phosphor zu verdauen, und können daher den in aus Phytin als Ortophosphorsäure freisetzt, den pflanzlichen Stoffen verfügbaren Phytinphosphor Das Nährmedium zur Herstellung von Säure-

nicht verwerten. Zu solchen pflanzlichen Stoffen phytase entspricht im allgemeinen üblichen Nährgehören Getreidekörner und Nebenprodukte, wie medien und enthält eine geeignete Kohlenstoffquelle, Maismehl, Weizenkleie, Reiskleie, ölsamenmehle, 15 eine Stickstoffquelle, gegebenenfalls zusätzlicheWachsz. B. Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl und Lein- tumsfaktoren und anorganische Salze. Die Fermensamenmehl. Die als Säurephytase bezeichnete Enzym- tation kann submers unter aeroben Bedingungen in gruppe ist zur Umwandlung des Phytinphosphors der einem flüssigen Medium oder als Oberflächenkultur Pflanze in assimilierbares Phosphat fähig, und man durchgeführt werden.

kann daher dem Tierfutter vor dem Verfüttern 20 Zu den verwendbaren Kohlenhydraten gehören Phytase zusetzen, so daß der Gehalt an gebundenem beispielsweise Zucker, Dextrine und Stärken. So kann Phosphor im Futter freigesetzt und für das Tier das Medium einen Zucker, wie Glucose, Saccharose, verfügbar gemacht wird. Die Umwandlung des Fructose, Maltose oder Arabinose, sowie Gemische gebundenen Phosphors in assimilierbares Phosphat solcher Zucker oder eine Stärke, wie Maisstärke, kann vor oder nach der Futteraufnahme er- 25 Weizenstärke, Maismehl, Getreidekörner und Profolgen, dukte daraus enthalten. Die Ausdrücke »Zucker«

Säurephytase erzeugende Mikroorganismen sind und »Stärke«, wie sie hier verwendet werden, umbeispielsweise in »Bulletin of the Agricultural Chemical fassen nicht nur solche Stoffe selbst, sondern auch Society of Japan«, Bd. 5, S. 7/8 (1929); »Soil Science«, ihre offensichtlichen Äquivalente. Beispielsweise um-Bd. 87 (6), S. 305 (1959), und »Poultry Science«, 30 faßt der Ausdruck »Glucose« auch Stoffe, wie »Cere-41 (3), S. 725 (1962), beschrieben. lose« (Corn Products Company) und »Clintose«

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur (Clinton Corn Processing Company), die im Handel Herstellung von Säurephytase durch aerobe Züchtung erhältliche, durch Hydrolyse von Maisstärke hervon Mikroorganismen in einem eine assimilierbare gestellte Formen von Glucosemonohydrat darstellen. Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische 35 Die Ausdrücke umfassen auch Invertzucker-Ge-Salze enthaltenden Nährmedium, das dadurch ge- mische, wie sie beispielsweise in bekannter Weise kennzeichnet ist, daß die Züchtung der Mikroorga- durch Säureumwandlung von Zucker hergestellt nismen in einem Nährmedium erfolgt, das Orto- werden. Welches bestimmte Kohlenhydrat man für phosphat in einer Menge von 0,0001 bis 0,005 Ge- eine gegebene Fermentation wählt, hängt natürlich wichtsprozent, berechnet als Phosphor, enthält. 40 teilweise von dem verwendeten Mikroorganismus

Durch die Begrenzung des Orthophosphatgehalts ab.

im Medium, als Phosphor berechnet, zwischen 0,0001 Man kann auch andere Kohlenstoffquellen, bei-

und 0,005 Gewichtsprozent wird die Bildung der spielsweise Proteine oder Kohlenwasserstoffe, ver-Säurephytase gefördert. Höhere Mengen von Ortho- wenden.

phosphat im Medium erhöhen nur die Dichte der 45 In dem flüssigen Fermentationsmedium wird die Zellpopulation, und eine optimale Säurephytase- Kohlenstoff quelle in Mengen von wenigstens etwa ansammlung findet nur bei den oben angegebenen 0,1% verwendet und kann in Mengen bis zu 20% Mengen an Orthophosphat statt. und darüber vorhanden sein. Vorzugsweise enthält

Für das erfindungsgemäße Verfahren kommen das wäßrige Medium wenigstens etwa 2% und insganz allgemein Säurephytase erzeugende Mikro- 50 besondere wenigstens etwa 5 Gewichtsprozent Kohorganismen in Betracht. Solche Mikroorganismen lenhydrat. Welches genaue Mengenverhältnis an können Bakterien, Pilze oder Hefen sein. Kohlenhydrat im Medium verwendet und ob es auf

So erzeugen beispielsweise Pilze der Genera Asper- einmal zu Beginn oder anteil weise während der Fergillus, Penicillium, Mucor und Rhizopus, Hefen der mentation zugesetzt wird, liegt im Rahmen des fach-Genera Hansenule und Saccharomyces und Bakterien 55 männischen Könnens und richtet sich nach den der Genera Escherichia Säurephytase. Insbesondere verwendeten Mikroorganismen und den Fermenkann man Säurephytase erzeugende Mikroorganismen tationsbedingungen.

unter anderem in den Spezies Aspergillus niger, Ferner enthält das Medium eine übliche Stickstoff-

A. oryzae, A. flavus, A. flavipes, A. melleus, A. gigan- quelle, beispielsweise Ammoniak, Harnstoff, Protein teus, A. parasitecus, A. phoenicis, A. tamarii, A, ni- 60 oder andere assimilierbare organische oder anorgadulans, A. repens, A. clavatus, A. Terreus, A. saitoi, nische Stickstoffquellen. Man kann zahlreiche Am-A. awamori, Hansenula subpelliculosa, Saccharo- moniumverbindungen, z. B. das Chlorid oder Sulfat, myces cerevisiae und Escherichia coli finden. Für verwenden. Man kann sämtliche Stickstoffquellen die praktische Durchführung des erfindungsgemäßen zu Beginn oder periodisch während der Fermentation Verfahrens sind Pilze und insbesondere A. niger 65 zusetzen.

bevorzugt. Geeignete Quellen für wachstumsfördernde Stoffe,

Als bevorzugte Mikroorganismen werden Asper- die allein oder in Kombination verwendet werden

gillus niger NRRL 3135, Aspergillus niger ATCC können, sind beispielsweise Fleischextrakt, Pepton,

3 4

Maisquellwasser, Zuckerrübenmelassen und Zucker- und Subbarow, J. Biol. Chem., Bd. 66, S. 375 rohrmelassen. Es ist klar, daß man auch Vitamine (1925), bestimmt werden.

oder Aminosäuren selbst dem Medium zusetzen Verfügbares Orthophosphat kann dem Medium kann. am zweckmäßigsten als lösliches, anorganisches Ortholm Fermentationsmedium kann man zahlreiche 5 phosphatsalz zugegeben werden. Man kann beispiels-Calcium-, Kalium- und Magnesiumsalze verwenden, weise gut Kaliumphosphate, Natriumphosphate, Ambeispielsweise die Chloride oder Sulfate. Sulfationen moniumphosphate oder Calciumphosphate verwenkann man ebenfalls mit beliebigen Salzen zur Ver- den. Stoffe, wie Maisstärke, Maismehl u. dgl., entfügung stellen. Zwar kann man Salze verwenden, halten verschiedene Formen anorganischer Orthodie sowohl das Anion als auch das Kation liefern io phosphate sowie organischen Phosphors, die langsam (beispielsweise Magnesiumsulfat), die Auswahl ist in das Medium als verfügbares Phosphat freigesetzt jedoch keineswegs in dieser Weise beschränkt. Unter werden können. Tatsächlich kann der verfügbare sogenannten Spurenelementen sind beispielsweise Man- Phosphor, der aus Maismehl u.dgl. freigesetzt wird, gan, Eisen, Zink, Cobalt und gegebenenfalls andere ausreichen, um vorteilhafte Ausbeuten an Säure-Elemente zu verstehen, und Spurenmengen dieser 15 phytase zu bewirken. Aus diesem Grund wird Mais-Stoffe sind häufig im Medium von Vorteil. Solche mehl bei der praktischen Durchführung des erfin-Mengen sind oft bereits in anderen zur Herstellung dungsgemäßen Verfahrens als Kohlenhydrat bevordes Fermentationsmediums verwendeten Stoffen ent- zugt.

halten. Die Säurephytaseaktivität kann folgendermaßen Schließlich kann das Medium eine nicht toxische 20 gemessen werden: Wenn die extracelluläre Aktivität Base oder einen Puffer enthalten, damit der pH-Wert der Säurephytase gemessen werden soll, filtriert man im gewünschten Bereich bleibt. Auch dafür kann die gesamte fertige Kultur und vermischt 0,1 ml man zahlreiche bekannte nicht toxische Stoffe ver- des Kulturfiltrats mit 0,9 ml eines 0,1-m-Acetatwenden. Wegen ihrer leichten Zugänglichkeit werden puffers (pH 4,5), der 0,5 mg Calciumphytat enthält, häufig Calcmmcarbonat oder Ammoniak (gasförmig 25 Die Mischung wird bei 37,5°C eine entsprechend oder wäßrig) verwendet, um das pH von Fermen- . lange Zeit, die 24 Stunden oder mehr betragen kann, tationsmedien einzuhalten. Die Gesamtmenge des inkubiert und das freigesetzte Orthophosphat nach Puffers kann zu Beginn der Fermentation zugesetzt der in J. Biol. Chem., Bd. 66, S. 375 (1925), beschrie- oder der Puffer kann periodisch während der Fer- benen Methode bestimmt. Wenn die Säurephytasementation zugefügt werden, um das pH in dem 30 aktivität der Gesamtkultur gemessen werden soll, gewünschten Bereich zu halten. werden 2 ml Kultursuspension mit 8 ml eines 0,1-m-Der pH-Wert des Mediums wird im allgemeinen Acetatpuffers (pH 4,5), der 5 mg Calciumphytat zwischen 1 und 9 und vorzugsweise zwischen etwa enthält, vermischt. Die Mischung wird bei 28⁰C 2 und 7 gehalten. Die Temperatur des Mediums unter Bewegen und Belüften (beispielsweise auf einer wird im allgemeinen zwischen etwa 15 und 40⁰C 35 Rotationsschüttelvorrichtung) 30 Minuten inkubiert und vorzugsweise zwischen etwa 25 und 35° C gehal- und der Orthophosphatgehalt von 1 ml Filtrat nach ten. Wenn man die Fermentation unter submersen der oben angegebenen Methode gemessen.
Bedingungen durchführt, wird das Medium bewegt Die der Erfindung zugrunde liegende Fermentation und belüftet, um optimale Kulturbedingungen für schreitet im allgemeinen so lange fort, bis die Säureden Mikroorganismus zu schaffen. 40 phytaseaktivität ein Maximum erreicht. Dazu können Es leuchtet ein, daß die Wahl einer bestimmten 12 bis 120 Stunden nötig sein. Im allgemeinen neigen Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle und Kombination Hefen dazu, rascher eine maximale Enzymkonzenvon anorganischen Salzen sowie die Wahl der Fer- tration an Säurephytase zu erreichen als Verfahren mentationsbedingungen teilweise von dem bestimmten unter Verwendung von Schimmelpilzen. Der Punkt Mikroorganismus abhängt, der beim Verfahren ver- 45 maximaler Produktion kann selbstverständlich leicht wendet wird. Die Wahl solcher bevorzugten Stoffe mit Hilfe der oben angegebenen Methoden ermittelt und Bedingungen liegt im Rahmen des fachmänni- werden.

sehen Könnens. Für die Gewinnung der Säurephytase nach der

Wie bereits ausgeführt wurde, kann die Fermen- Fermentation steht eine Reihe von Maßnahmen

tation als submerse, aerobe Fermentation oder als 50 zur Verfügung. Wenn das Phytaseenzym intracellulär

Oberflächenkultur durchgeführt werden. Im letzteren vorliegt, kann man die Zellen beispielsweise durch

Fall ist der Gehalt an der Kohlenstoffquelle (bei- Filtration oder Zentrifugieren gewinnen und trock-

spielsweise einem Kohlenhydrat) wesentlich erhöht nen. Wenn das Phytaseenzym hauptsächlich extra-

und liegt in Mischung mit der Stickstoffquelle, dem cellular vorliegt, kann man nach Entfernung der

Puffer, anorganischen Salzen, Hilfsstoffen u. dgl. vor. 55 Zellen das Filtrat einengen, beispielsweise durch

Oberflächenkulturen sind bekannt, und die Zube- Erwärmen auf 55 bis 70⁰C im Vakuum, um ein

reitung solcher Medien liegt im Rahmen des fach- konzentriertes Enzym zu erhalten, das man in flüssiger

männischen Könnens. Form verwenden oder einem festen Träger zusetzen

Da die Gegenwart von überschüssigen Mengen kann. In manchen Fällen kann es zweckmäßig sein,

Orthophosphat erheblich die Erzeugung von Säure- _6o das gesamte Medium, ohne vorhergehendes Trennen

phytase beeinträchtigt, hält man den Orthophosphat- in seine Bestandteile, zu konzentrieren. Man kann

gehalt des Mediums, berechnet als Phosphor, zwischen auch andere Verfahren, beispielsweise Gegenstrom-

0,0001 und 0,005 Gewichtsprozent. Bei der Bestim- verteilung mit Lösungsmitteln oder Sprühtrocknen,

mung des Orthophosphatgehalts des Mediums muß anwenden.

man den Gehalt sämtlicher Komponenten des Me- 65 Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung,

diums an verfügbarem Orthophosphat berücksich- Die Phytaseaktivität wurde in diesen Beispielen nach

tigen. Der Gehalt des Mediums an verfügbarem der oben angegebenen Methode, wobei eine Inku-

Orthophosphat kann nach der Methode von F i s k e bationszeit von 30 Minuten angewandt wurde, ge-

messen. Die Säurephytaseaktivität ist in Enzymeinheiten pro Milliliter Enzympräparat definiert. Eine Enzymeinheit ist andererseits als diejenige Enzymmenge definiert, die pro Stunde unter den dfinierten Bedingungen 1 mg Phosphor freisetzt.

Beispiel 1

Ein Fermentationsmedium mit folgender Zusammensetzung wurde hergestellt:

Medium g/1

Glucose 60

NaNO₃ 8,6

MgSO₄ · 7 H₂O 0,5

KCl 0,5

FeSO₄ 0,001

pH 7,3

Tabelle II

Verfügbares P
im Medium (%)

Aktivität

Maisstärke	4%
0,00044	1,26
0,00104	1,46
0,00204	1,32
0,00304	1,30
0,00404	0,9
0,00504	0,32
0,00604	0,12
0,00804	0,12
	8°/o
	4
	5,8
	6,6
	6,0
	5,2
	4,8
	0,56
Maisstärke
0,00048
0,00108
0,00208
0,00308
0,00408
0,00508
0,01008

Diesem Medium wurde Phosphat als Kaliumorthophosphat in verschiedenen Konzentrationen zugefügt. Das Fermentationsmedium wurde in 50-ml-Anteile aufgeteilt, die in 250-ml-Kolben gebracht wurden. Aspergillus niger NRRL 3135 wurde inoculiert und bei 28° C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung inkubiert. Nach 5 Tagen wurde die Säurephytaseaktivität der Gärmaische und das Myceltrockengewicht bestimmt. Tabelle I zeigt den Einfluß von Phosphat auf Säurephytaseaktivität und Wachstum in einem Glucosemedium.

Tabelle I

Verfügbares P	ΛΚ UVlLaL	Zellentrockengewicht	0
im Medium (%)	0	g/50 ml	0,039
0	0,2	0,069
0,0002	0,28	0,115
0,0005	0,16	0,184
0,001	0,06	0,190
0,003	0,02	0,364
0,005	Spur
0,01

as Tabellen zeigt, daß die optimale Phosphorkonzentration für die Erzeugung von Säurephytase sich etwas in Abhängigkeit von der Kohlenhydratkonzentration ändert.

B e i s ρ i e 1 3

Es wurde die gleiche Arbeitsweise wie im Beispiel 1 angewandt, mit der Ausnahme, daß 10% gelbes Maismehl verwendet wurden und kein Phosphat oder NaNO₃ zugesetzt wurde. Das Medium enthielt etwa 0,005 % Phosphor als verfügbares Orthophosphat. Nach 4tägiger Züchtung wurde eine Säurephytaseaktivität von 12 erhalten. Wenn 0,018% Phosphor als Kaliumorthophosphat zugesetzt und dadurch der verfügbare Phosphor im Medium auf 0,023% erhöht wurde, wurde die Säurephytaseaktivität auf 0,24 vermindert.

45

Beispiel 4

Tabelle I zeigt, daß die Erzeugung von Säurephytase am größten wird, wenn der Phosphorgehalt des Mediums zwischen 0,0002 und 0,005% liegt.

Beispiel 2

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß 4 bzw. 8% Maisstärke als Kohlenhydrat verwendet und die Phosphatkonzentration durch Zugabe von Kaliumorthophosphat verändert wurde.

Es wurde die gleiche Arbeitsweise angewandt wie

im Beispiel 3, mit der Ausnahme, daß Aspergillus niger ATCC 9142 verwendet wurde. Nach 4tägiger Fermentation wurde eine Säurephytaseaktivität von 7,2 erhalten.

Beispiel 5

Es wurde die gleiche Arbeitsweise wie im Beispiel 3

angewandt, mit der Ausnahme, daß Aspergillus awamori ATCC 11 382 verwendet wurde. Nach 4tägiger Fermentation wurde eine Säurephytaseaktivität von 9,2 erhalten.

Beispiel 6

Nach der Arbeitsweise von Beispiel 3, jedoch unter Verwendung von Aspergillus saitoi ATCC 11362, wurde nach 4tägiger Züchtung eine Säurephytaseaktivität von 9,6 erhalten.

Beispiel 7

10 g gelbes Maisschrot und 10 ml Wasser wurden vermischt und in eine Petrischale gebracht. Auf das

Substrat wurde 1 ml einer Sporenkultur von Aspergillus niger NRRL 3135 inoculiert. Diese Oberflächenkultur wurde bei 28 ⁰C unter gelegentlichem Durchmischen mit einer Spatel incubiert. Nach 5 Tagen wurde die Säurephytase mit 50 ml kaltem Wasser extrahiert. Die Säurephytaseaktivität des Extrakts betrug 4,8.

Beispiel 8

Medium g/l *°

Glucose 10

Malzextrakt 3

Hefeextrakt 3

Pepton 5

pH 5,6

Diesem Medium wurde Phosphat als Kaliumorthophosphat in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt, um den nachstehend angegebenen Phosphor- ao gehalt zu schaffen. Das Fermentationsmedium wurde auf 50-ml-Kolben aufgeteilt und mit 1 ml einer Impfkultur von Saccharomyces cerevisiae NRRL-Y-6728 inoculiert. Nach 3tägigem Fermentieren wurde die Säurephytaseaktivität einer Zellensuspension ermit- as telt. Wie in Tabelle III angezeigt ist, führt die Zunahme an Phosphor zur Inhibierung der Säurephytaseaktivität.

Tabelle III

35 MnSO₄, Natriummolybdat und ZnSO₄. Das Medium enthielt auch Spurenmengen folgender Vitamine: Niacin, B₂, Folsäure, Calcium-Pantothensäure, p-Aminobenzoesäure, B₆, B₁, Biotin und Anocitol.

Gleiche Anteile des angegebenen Mediums wurden für eine 4tägige Fermentation bei pH 6,5 unter Verwendung von Hansenula subpelliculosa NRRL-Y-1683 verwendet. Das Wachstum in den fertigen Medien wurde durch die Trübung unter Verwendung eines Filters Nr. 42 und eines Klett-Colorimeters gemessen. Der Phosphorgehalt der Medien wurde, wie in Tabelle IV angegeben, durch Zugabe entsprechender Mengen von K₂HPO₄ abgeändert.

Tabelle IV

P-Gehalt des Mediums (%)	Aktivität
0,003 0,0039 0,0048 0,0120 0,021	0,72 0,58 0,08 Trace Trace

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Beispiel 9
Folgendes Fermentationsmedium wurde hergestellt:

Medium Gewichtsprozent

Glucose 2

(NH^)₂SO₄ 0,5

MgSO 0,05

NaCl 0,01

KCl 0,01

Außerdem enthielt das Medium Spurenmengen der folgenden Stoffe: Borsäure, CuSO₄, KI, FeSO₄,

Phosphor	Aktivität	Trübung
0,00	0,00	13
0,0001	0,02	21
0,00015	0,06	30
0,0002	0,05	41
0,0003	0,08	62
0,0005	0,13	83
0,001	0,15	109
0,002	0,06	135
0,004	0,02	146
0,005	0,02	146
0,01	0	152

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Säurephytase durch aerobe Züchtung von Mikroorganismen in einem eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung der Mikroorganismen in einem Nährmedium erfolgt, das Orthophosphat in einer Menge von 0,0001 bis 0,005 Gewichtsprozent, berechnet als Phosphor, enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Aspergillus niger NRRL 3135, Aspergillus niger ATCC 9142, Aspergillus awamori ATCC 11 382, Aspergillus saitoi ATCC 11362, Saccharomyces cerevisiae NRRL-Y-6728 oder Hansenula subpelliculosa NRRL-Y-1683 verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium als assimilierbare Kohlenstoffquelle Maismehl enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung unter submersen Bedingungen erfolgt.

909532/187