DE1138510B

DE1138510B - Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Rufomycin

Info

Publication number: DE1138510B
Application number: DET19628A
Authority: DE
Inventors: Koiti Nakazawa; Motoo Shibata; Eiji Higashidi; Toshiniko Kanzaki; Hiroishi Yamamoto; Akira Miyake; Jisaburo Ueyanagi; Hidesuke Iwasaki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1960-02-08
Filing date: 1961-02-07
Publication date: 1962-10-25

Description

Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Rufomycin Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Rufomycin, eines neuen Antibiotikums, das durch einen Stamm eines zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus erzeugt wird.
Um ein neues Antibiotikum zu finden, wurde von den Erfindern eine umfassende Nachforschung durchgeführt, die sich auf Stoffwechselprodukte erstreckte, die durch viele Arten von Mikroorganismen erzeugt werden, welche von Bodenproben aus den verschiedensten Bezirken von Japan isoliert wurden. Als Ergebnis wurde gefunden, daß ein gewisser Mikroorganismus ein neues Antibiotikum erzeugt, daß der Mikroorganismus künstlich zur Anreicherung des Antibiotikums in der Nährlösung bebrütet werden kann, daß das Antibiotikum aus der Nährlösung abtrennbar ist und daß der Mikroorganismus zur Gattung Streptomyces gehört. Die Erfinder bezeichneten diesen Stamm als Streptomyces atratus nov. sp. und das Antibiotikum als Rufomycin. Streptomyces atratus erzeugt im allgemeinen gleichzeitig zwei Arten von Antibiotika, die sich in den Eigenschaften voneinander unterscheiden. Beide werden jedoch Rufomycin genannt. Falls sie jedoch unterschieden werden müssen, werden sie Rufomycin A und Rufomycin B genannt.
Ein Stamm von Streptomyces atratus wurde von den Erfindern erstmals von einer Bodenprobe isoliert, die am Ufer des Kinokawa, Präfektur Wakayama, Japan, entnommen wurde. Der Stamm wurde beim Institut für Fermentation, Osaka, Japan, und beim American Type Culture Collection, Washington, D. C., unter der Nummer IFO-3897 und ATCC-14046 hinterlegt. Die Kulturmerkmale des Stamms werden beschrieben. Hierbei liegen den mit »Rdg.« gekennzeichneten Farbbezeichnungen Ridgway's Color Standards and Color Nomenclature zugrunde.
1. Dieser Stamm wird als ein zur Gruppe Streptomyces hygroscopicus gehörender Mikroorganismus angesehen, da sein Luftmycel naß und schwarz wird, wenn er 2 Wochen oder mehr auf Glukose-Asparagin-Agar bebrütet wird.
2. Vegetatives Mycel: Sich ausbreitend, dringt in das Medium ein, farblos bis chamois (Rdg. XXX, 19"-b); Hyphen 0,5 bis 0,6 #L Durchmesser. Kein lösliches Pigment bei den meisten Medien.

3. Luftmycel: Pulverartig, weiß, später dunkel mausgrau (Rdg. LI,15""'-i) bis schieferfarben (Rdg. LIII, Carbon gray-k), wird auf gewissen Medien (z. B. Glukose-Asparagin-Agar) feucht und weist dunkle glänzende Flecken auf. Sporen erzeugen offene Schlingen oder Spiralen. Hyphen ist kurz, verfilzt, verzweigt, 1,5 bis 1,8 #t Durchmesser. Sporen ellipsoidal bis zylindrisch, 1,3 bis 1,4 - 1,6 bis 2,3 @a. 4. Kulturmerkmale verschiedener Medien:

Tabelle 1

Czapek-Agar:

Vegetatives Mycel Dünn, sich ausbreitend, farb-

los, dringt in das Medium ein.

Luftmycel ....... Spärlich, weiß, später maus-

grau (Rdg. LI, 15""').

Rückseite . . . . . . . . Kein Pigment.

Lösliches Pigment Nicht vorhanden.

Czapek-Glukose-Agar

Vegetatives Mycel Reichlich, sich ausbreitend,

farblos, später tief »Colonial

Buff<c (Rdg. XXX, 21"-b).

Luftmycel ....... Spärlich, weiß bis tiefmaus-

grau (Rdg. LI, 15""'-i).

Rückseite . ... .. . . Farblos, später cremefarben

(Rdg. XVI, 19'-f).

Lösliches Pigment Nicht vorhanden.

Glukose-Asparagin-Agar:

Vegetatives Mycel Dünn, sich ausbreitend, farb-

los, dringt in das Medium ein.

Luftmycel ....... Pulverartig, weiß, später tief

mausgrau (Rdg. LI, 15""'-i)

bis schieferfarben (Rdg. LIII,

Carbon gray-k); wird nach

einer Kulturzeit von mehr als

2 Wochen auf diesem Medium

feucht und weist dunkle glän-

zende Flecken auf.

Rückseite . . . . . . . . Farblos, später schwarz.

Lösliches Pigment Nicht vorhanden.

Hefeextrakt-Agar:

Vegetatives Mycel Reichlich, sich ausbreitend,

faltig, farblos.

Luftmycel ....... Sehr spärlich, weiß.

Rückseite . . . . . . . . Kein Pigment.

Lösliches Pigment Nicht vorhanden.

Nähragar:

Vegetatives Mycel Sich ausbreitend, glatt, farblos.

Luftmycel ....... Nicht vorhanden.

Rückseite . . . . . . . . Kein Pigment.

Lösliches Pigment Nicht vorhanden.

Glukose-Nähragar:

Vegetatives Mycel Reichlich, sich ausbreitend,

faltig, farblos.

Luftmycel ....... Reichlich, weiß, später dunkel

mausgrau (Rdg. LI, 15""'-k)

bis schwärzlichmausgrau (Rdg.

LI, 15""'-m).

Rückseite ... . .... Farblos bis schwärzlichmaus-

grau (Rdg. LI, 15""'-m).

Lösliches Pigment Nicht vorhanden.

Glycerin-Nähragar:

Vegetatives Mycel Reichlich, sich ausbreitend,

faltig, farblos bis gelblichgrün

(Rdg. XLI, 25"'-f).

Luftmycel ....... Spärlich, weiß bis mausgrau

(Rdg. LI, 15 ""' ).

Rückseite . . . . . . . . Farblos bis grünlichbraun.

Lösliches Pigment Farblos bis gelblichgrün

(Rdg. XLI, 25"'-f).

Bouillon . .. . . . . .. Transparente Hyphen, kein

Mycel am Oberflächenrand,

Wachstum sinkt zu Boden.

Glukose-Bouillon Transparente Hyphen, kein

Mycel am Oberflächenrand,

Wachstum sinkt zu Boden.

Cellulose ........ Kein Wachstum.

Eimedium

Vegetatives Mycel Sich ausbreitend, faltig, tief

»colonial buff«c (Rdg. XXX,

21 "-b).

Luftmycel ....... Spärlich, weiß.

Bemerkungen .... Keine Veränderung des Me-

diums.

Milch ........... Starke Peptonisierung ohne

Koagulierung innerhalb von

10 Tagen bei 27'C.

Möhrenbrei:

Vegetatives Mycel Farblos, sich ausbreitend.

Luftmycel ....... Weiß, später tiefmausgrau

(Rdg. LI, 15""'-i).

Bemerkungen .... Keine Veränderung des Me-

diums.

Kartoffelbrei:

Vegetatives Mycel Reichlich, gefalten, honiggelb

(Rdg. XXX, 19").

Luftmycel ....... Nicht vorhanden.

Bemerkungen .... Keine Veränderung des Me-

diums.

Gelatine . . . . . . . . . Vollständige Verflüssigung in

einer Woche ohne lösliches

Pigment.

Tyrosinate-Agar:

Vegetatives Mycel Dünn, sich ausbreitend, farb-

los.

Luftmycel ....... Nicht vorhanden.

Rückseite . . . . . . . . Kein Pigment.

Lösliches Pigment Nicht vorhanden.

Calciummalat-Agar:

Vegetatives Mycel Reichlich, sich ausbreitend,

farblos bis »Colonial BuffR

(Rdg. LI, 15""')

Luftmycel ....... Spärlich, weiß, später maus-

grau (Rdg. LI, 15""').

Rückseite . . . . . . . . Kein Pigment.

Lösliches Pigment Nicht vorhanden.

Nitrat . . . . .. . . . . . Reduktion, transparent mit

reichlichem Mycel am Boden.

Stärke-Agar:

Vegetatives Mycel Farblos, sich ausbreitend.

Luftmycel ....... Sehr spärlich, weiß.

Rückseite . . . . . . . . Kein Pigment.

Lösliches Pigment Nicht vorhanden.

Stärke-Agarplatte HydrolysierteZoneproWachs-

tumsdurchmesser von 4 bis 6.

Hydrolysierte Zone/Wachs-

tumsdurchmesser = 33 mm/

5,5 mm.

5. Kohlenstoffausnutzung auf Agar nach der Methode

von Pridhan und Gottlieb:

Glycerin ...... +++ Sorbit . . . . . . . . . . .

Xylose ....... - Saccharose ...... -

Fructose ...... + Raffinose . . . . . . . . +++

Ribose ....... ++ Rhamnose ....... ++

Glukose ...... +++ Cellobiose ....... +++

Sorbose ...... - Erythrit . . . . . . . . . -

Mannose ..... +++ Dextrin . . . . . . . . . +-E--I-

Maltose ...... +++ Stärke . . . . . . . . . . -f-

Galactose ..... +++ Natriumacetat . . . +-I-

Lactose ....... ++ Natriumcitrat . . . . +-I-

Mannit ....... - Natriumsuccinat . . ++

Bemerkungen:

@--f--I- = sehr gutes Wachstum.

-I-+ = gutes Wachstum.

-!- = mittelmäßiges Wachstum.

spärliches Wachstum.

- = kein Wachstum.

6. Antimikrobisches Spektrum der lebenden Kultur: Auf einem Bouillon-Agar oder einem Glycerin-Bouillon-Agar in einer Schale wird Streptomyces atratus in Streifen aufgebracht und 4 Tage bei 28°C bebrütet. Dann wurde die folgende Kultur im rechten Winkel dazu aufgebracht. Die Inhibierungslänge bei den folgenden Mikroorganismen war Null.

Auf beiden Medien untersuchte Mikroorganismen: Escherichia coli.
Proteus vulgaris. Staphylococcus aureus. Bacillus subtilis. Bacillus cereus.
Nur auf Bouillon-Agar untersuchte Mikroorganismen Serratia marcescens. Bacillus brevis.
Nur auf Glycerin-Bouillon-Agar untersuchte Mikroorganismen Mycobacterium sp. 607. Mycobacterium avium.
Mycobacterium avim, streptomycin-resistent. Zu den bekannten Mikroorganismen, die Streptomyces atratus am nächsten kommen, gehören die Gattungen Streptomyces halstedii und Streptomyces hygroscopicus, aber gerade die bei diesen beiden Gattungen beobachteten Eigenschaften unterscheiden sich deutlich von denen des Streptomyces atratus. Die deutlichen Unterschiede zwischen Streptomyces atratus und Streptomyces halstedii bzw. Streptomyces hygroscopicus in den jeweiligen Eigenschaften auf den verschiedensten Kulturmedien sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Die morphologischen Unterschiede bestehen darin, daß die Sporophoren von Streptomyces atratus hauptsächlich schlingenförmig sind und selten Spiralen mit einer bis zwei Windungen bilden, während Streptomyces halstedii viele geschlossene Spiralen und Streptomyces hygroscopicus hauptsächlich Spiralen mit einer bis zwei Windungen aufweist. Mehrere Unterschiede bestehen in der Verwertung des Kohlenstoffs. Diese Unterschiede sind in Tabelle 3 aufgeführt. Der wichtigste Unterschied zwischen Streptomyces atratus und den anderen Mikroorganismen besteht darin, daß Streptomyces halstedii Carbomycin und CarbomycinB erzeugt und Streptomyces hygroscopicus Hygromycin, Hygroscopin, Angustmycin usw. bildet, während Streptomyces atratus keines dieser Antibiotika, sondern Rufomycin erzeugt.

Tabelle 2

Kulturmedium Streptomyces atratus Streptomyces halstedii Streptomyces hygroscopicus

Glukose-Asparagin-Agar Rückseite farblos, später Rückseite farblos, später Rückseite cremefarben

schwarz schwarz

Glukose-Bouillon-Agar Rückseite farblos, später Rückseite farblos, später Rückseite farblos

und Glycerin-Bouillon- schwarz schwarz

Agar

Eimedium Vegetatives Mycel tief Vegetatives Mycel farblos Kein Wachstum

»Colonial Buff«

Hefeextrakt-Agar Rückseite farblos Rückseite farblos, später Rückseite farblos

schwarz

Kartoffelbrei Vegetatives Mycel honig- Vegetatives Medium farb- Vegetatives Mycel farblos

gelb. Keine Veränderung los bis cremefarben. bis cremefarben. Farbe

der Farbe des Mediums Farbe des Mediums blaß- des Mediums braun

braun

Möhrenbrei Vegetatives Mycel reichlich, Kein Wachstum. Farbe des Vegetatives Mycel, kräftig

farblos. Keine Farb- Mediums dunkelgrau olivfarbig

änderung des Mediums

Czapek-Glukose-Agar Vegetatives Mycel sich aus- Vegetatives Mycel Vegetatives Mycel sich aus-

breitend, nicht nach oben beschränkt, aufwärts breitend, aufwärts

stehend, farblos, später stehend, klumpenförmig, stehend, farblos, später

tief »Colonial Buff«, gelb, Rückseite farblos zimthautfarben, Rück-

Rückseite farblos, später seite farblos, später zimt-

cremefarben farben

Milch Starke Peptonisierung ohne Schwache Peptonisierung Ziemlich starke Peptonisi-

Koagulierung mit Koagulierung rung ohne Koagulierung

Nitratreduktion Reduktion Reduktion Keine Reduktion

Calciummalat-Agar Vegetatives Mycel sich aus- Vegetatives Mycel Vegetatives Mycel sich aus-

breitend, farblos bis beschränkt, farblos, breitend, farblos. Rück-

»Colonial Buff«, Rück- Rückseite farblos seite cremefarben

seite farblos

Tyrosinat-Agar Vegetatives Mycel sich aus- Vegetatives Mycel Vegetatives Mycel sich aus-

breitend, farblos. Rück- beschränkt, wein-haut- breitend, wein-haut-far-

seite farblos farben. Rückseite farb- ben bis gelb. Rückseite

los, später wein-haut- farblos, später »Tüleul-

farben Buff«

Anmerkung: Die Farbbezeichnungen basieren auf »Color Standards and Color Nomenclature« von R. Rigdway.

Tabelle 3

St. atratus St. halstedii St. hygro-

scopicus

D-Xylose .... - T""I-T T

L-Rhamnose. . ++ - -

L-Sorbose .... - - -f-

D-Mannit .... - - ++-f-

Sorbit ....... - - ++

Die vorstehenden Kulturmerkmale und Vergleichsdaten zeigen, daß Streptomyces atratus eine neue Art ist, die zu Actinomycetes gehört. Ferner eignen sich natürlich auch alle Mutanten oder Varianten von Streptomyces atratus, die vom Boden isoliert werden, von Streptomyces atratus abgeleitete Stämme oder durch künstliche Mutation und/oder Variation hervorgebrachte Mutanten oder Varianten, solange sie ihre Fähigkeit behalten, Rufomycin zu erzeugen. Künstliche Mutation oder Variation kann beispielsweise durch Bestrahlung, Zusatz von Chemikalien zum Kulturmedium, Isolierung von Monosporen usw. erfolgen.

Im Verfahren gemäß der Erfindung wird ein geeigneter Stamm in einem Kulturmedium gezüchtet. Das Kulturmedium kann fest oder flüssig sein, jedoch wird die flüssige Form zur Durchführung des Verfahrens im großen Maßstab bevorzugt. Es ist gewöhnlich zweckmäßig, wenn das Kulturmedium auch Nährstoffe, wie assimilierbaren Kohlenstoff, digerierbaren Stickstoff, anorganische Substanzen, Vitamine, Spurenelemente, wachstumsfördernde Stoffe usw., enthält. Diese Nährstoffe können aus natürlichen Quellen erhalten oder synthetisiert sein. Als Kohlenstoff quellen eignen sich beispielsweise Glukose, Lactose, Glycerin, Stärke, Dextrin, Maltose usw., als Stickstoffquellen beispielsweise Pepton, Sojabohnenmehl, Reiskleie, Mais-Extraktionsflüssigkeit, Gluten, Kasein usw. und als anorganische Nährstoffe beispielsweise Natriumchlorid, Carbonate, Mineralsalze, Phosphate usw. Zweckmäßig ist die Züchtung des Stamms unter aeroben Bedingungen, wobei Bewegung und/oder Belüftung vorteilhaft ist. Im allgemeinen sind eine Temperatur von 26 bis 30°C, ein pH-Wert des Mediums etwa im neutralen Bereich und eine Bebrütungsdauer von 3 bis 5 Tagen am vorteilhaftesten. Natürlich können diese Bedingungen verändert werden, solange die gewünschten Ergebnisse dadurch nicht beeinträchtigt werden.
Rufomycin wird im Zuchtmedium gebildet und angereichert. Ein Teil des auf diese Weise gebildeten Rufomycins bleibt im Mycel des bebrüteten Mikroorganismus, während der Rest durch die Zellwand in das Medium gelangt und dort angereichert wird. Das erzeugte Rufomycin kann also unmittelbar aus dem gesamten Nährmedium abgetrennt werden. Häufig ist es jedoch vorteilhafter, den flüssigen Teil des Mediums vom festen Teil beispielsweise durch Filtration, Zentrifugieren usw. zu trennen und beide Teile zur Gewinnung des Rufomycins zu extrahieren. Die Gewinnung des Rufomycins aus der fermentierten Nährflüssigkeit kann unter Ausnutzung von Unterschieden in den chemisch-physikalischen Eigenschaften, wie Löslichkeit in einem Lösungsmittel, Adsorbierbarkeit an einem Adsorptionsmittel, Kristallisierbarkeit usw., zwischen Rufomycin und den Verunreinigungen vorgenommen werden. Beispielsweise kann Rufomycin aus der Brühe mit einem Lösungsmittel, wie Alkohol, Essigsäureester, Aceton od. dgl., extrahiert werden. Entsprechend den chemisch-physikalischen Eigenschaften von Rufomycin und der Verunreinigungen läßt sich das erstere in einfacher Weise reinigen, beispielsweise durch Adsorptionschromatographie, wobei ein geeignetes Adsorptionsmittel, wie Aluminiumoxyd, Kieselgel usw., verwendet wird, durch Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie Äthnanol, Methanol, einem wäßrigen Alkohol usw., durch Gegenstromverteilung, fraktionierte Fällung oder nach anderen Methoden, die gewöhnlich zur Gewinnung eines Produkts aus einem Nährmedium angewendet werden.
Als Ergebnis der vorstehend beschriebenen Behandlungen werden aus der Kulturflüssigkeit des Rufomycin erzeugenden Stamms zwei Arten von Antibiotika erhalten, die als Rufomycin A und Rufomycin B bezeichnet werden und ziemlich ähnliche Eigenschaften aufweisen. Infolge des Unterschiedes ihrer Löslichkeit beispielsweise in Äthanol ist es jedoch möglich, sie voneinander zu trennen. Genauer gesagt, wenn eine wäßrige Äthanollösung beider Antibiotika unter vermindertem Druck eingeengt und eine Weile stehengelassen wird, scheidet sich Rufomycin B in Form von Kristallen ab, während Ruf omycin A erhalten wird, indem das Lösungsmittel der Mutterlauge unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft wird.
RufomycinA weist folgende Eigenschaften auf: 1. Es ist eine physilogisch neutrale Substanz und wird gewöhnlich als gelbes Pulver erhalten.
2. Es ist in Wasser unlöslich, in Äthyläther, Petroläther, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff usw. schwerlöslich, jedoch in Methanol, Äthanol, Propanol, Äthylacetat, Chloroform, Pyridin, Dioxan, Eisessig, Aceton, Dimethylformamid, 2-Methoxyätllanol (Methylcellosolv) usw. leicht löslich.
3. Es ist bei der Ninhydrinreaktion, Molish-Reaktion, Fehlingschen Reaktion, Sakaguchi-Reaktion, Ferrichloridreaktion, Maltolreaktion, Natriumnitroprussid-Reaktion usw. negativ.
4. Sein Infrarotabsorptionsspektrum, gemessen in einer Kaliumbromidscheibe, ist in Fig. 1 dargestellt. Die wichtigsten Absorptionsbanden sind folgende: 3,0 (stark), 3,27 (schwach), 3,4 (stark), 6,04 (Knick), 6,1 (sehr stark), 6,53 (stark), 6,64 (mäßig), 6,90 (schwach), 7,1 (Knick), 7,32 (schwach), 7,55 (mäßig), 8,02 (stark), 8,54 (schwach), 8,85 (schwach), 9,37 (schwach), 9,80 (schwach), 10,05 (schwach), 10,37 (schwach), 10,96 (schwach), 11,43 (schwach), 12,20 (mittel), 13,15 (Knick) und 13,55 #t (mittel).
5. Sein Ultraviolettabsorptionsspektrum in Äthanol ist in Fig. 3 als ausgezogene Linie dargestellt. Die Maxima sind folgende: @max 222 m#t (E'1',. = 450). 2max 282 m#L (Ei-,'. =l00). Am", 355 mit. (El l'- = 27).
6. Spezifische Drehung: [a]o' = -64° (c = 1 % in Äthanol).

7. Bei der qualitativen Elementaranalyse wurde weder Halogen noch Schwefel festgestellt. Die Analysenwerte waren folgende: 1. C 62,39 0/0, H 7,69 %, N 10,80 %; 2. C 62,26 0/0, H 7,33 %, N l1,17 %. B. Die Stabilität von Rufomycin A wurde unter verschiedenen Bedingungen geprüft. Die antimikrobische Wirksamkeit nahm durch 1stündiges Kochen bei p119 auf etwa die Hälfte ab. Bei pH-Werten im neutralen oder sauren Bereich ist Rufomycin A ziemlich stabil. Bei der Prüfung wurde die antimikrobische Wirksamkeit nach der Agar-Verdünnungsmethode bestimmt, wobei als Prüforganismus ein streptomycinresistenter Stamm von Mycobacterium avium verwendet wurde.

Wirksamkeit

Lösungsmittel pg-Wert Behandlung (Einheiten je

Kubikzenti-

meter)

Ohne Lösungs-

mittel ........ - 1 Stunde bei 2000

100 ° C im

Vakuum

Methanol ..... neu- 1 Stunde 1500

tral unter dem

Rückfluß-

kühler

erhitzt

Mit H C 1 ange-

säuertes Metha-

nol........... 2,0 desgl. 1500

Mit Na O H alka-

lisch gemachtes

Methanol ... 9,0

desgl. 750

Rufomycin B hat folgende Eigenschaften: 1. Es ist eine neutrale Substanz, die die Form von gelben prismenartigen Kirstallen hat, die bei 165 bis 168'C unter Zersetzung schmelzen.

2. Es ist in Wasser unlöslich, in Äthyläther, Petroläther, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff usw. schwerlöslich und in Äthanol, Butanol usw. wenig löslich, jedoch in Methanol, heißem Äthanol, Äthylacetat, Chloroform, Pyridin, Dioxan, Eisessig usw. leicht löslich.
3. Bei der Titration zeigt es einen pxa#-Wert von 8,4 in Methanol-Wasser.
4. In bezug auf Farbreaktionen weist es die gleichen Merkmale wie Rufomycin A auf.
5. Sein Infrarotabsorptionsspektrum in einer Kaliumbromidscheibe ist in Fig. 2 dargestellt. Die wesentlichen Absorptionsbanden sind folgende: 3,04 (stark), 3,26 (schwach), 3,38 (stark), 5,94 (Knick), 6,05 (Knick), 6,10 (sehr stark), 6,53 (stark), 6,6 (Knick), 6,9 (mittel), 7,1 (Knick), 7,25 (Knick), 7,34 (schwach), 7,62 (mittel), 7,85 (schwach), .8,05 (mittel), 8,32 (schwach), 8,50 (schwach), 8,85 (mittel), 9,26 (mittel), 10,35 (schwach), 10,90 (schwach), 11,45 (schwach), 12,15 (schwach), 13,10 (schwach) und 13,55 #t (mittel).
6. Sein Ultraviolettabsorptionsspektrum in Äthanol ist in Fig. 3 als gestrichelte Linie dargestellt. Die Maxima sind folgende: imax 222 mp. (Elle,'. = 524). Amax 282 m(.t (E" = 113). Amax 355 m#t (EI! = 28).

7. Spezifische Drehung: [a] ö` _ -73 ° (c = 10/, in Methanol). Sowohl Rufomycin A als auch Rufomycin B zeigen spezifische Wirksamkeit gegenüber säurefesten Bakterien, insbesondere Mycobacterium tuberculosis var. hominis, sind jedoch unwirksam gegenüber üblichen grampositiven und gramnegativen Bakterien. Das Ergebnis der biologischen Prüfung von Rufomycin A und Rufomycin B nach der Verdünnungsmethode ergibt sich aus dem folgenden antibakteriellen Spektrum. In diesem Test wurden Mycobacterium tuberculosis auf Kirchners Medium, die anderen säurefesten Bakterien auf Glycerin-Bouillon-Agar und andere übliche Bakterien auf Bouillon-Agar geimpft. Als Lösungsmittel diente Methanol.

Wachstumshemmende Min-

destkonzentration in Mikro-

Testkeim gramm je Kubikzentimeter

RufomycinA ! Rufomycin B

Escherichia coli . . . . . . . . . > 100 >l00

Proteus vulgaris . . . . . . . . . >l00 > 100

Staphylococcus aureus .... >l00 > 100

Bacillus subtilis . . . . . . . . . >l00 I > 100

Pseudomonas aerugmosa. . >l00 >l00

Serratia marcescens ...... > 100 > 100

Bacillus brevis . . . . . . . . . . 100 >l00

Sarcina lutea . . . . . . . . . . . 100 > 100

Mycobacterium

species 607 . . . . . . . . . . . . 2,0 5,0

Mycobacterium avium ... 1,0 5,0

Mycobacterium avium,

streptomycinresistent ... 1,0 5,0

Mycobacterium avium,

neomycinresistent ...... 1,0 5,0

Mycobacterium smegmatis 0,2 0;5

Mycobacterium phlei .... 2,0 5,0

Mycobacterium tuber-

culosis H"Rv.... ..... 0,1 ; 1,0

Die Toxizität von Rufomycin A und Rufomycin B wurden an 4 Wochen alten Mäusen (Stamm dd) durch intraperitoneale Injektion ermittelt: Rufomycin A: LDp = 4000 mg/kg. Rufomycin B : LDo = 2000 mg/kg.

Die letale Mindestdosis von Rufomycin B, intraperitoneal injiziert, betrug 4000 mg/kg.
Die Tatsache, daß die vorstehend aufgeführten Eigenschaften von Rufomycin A und Rufomycin B sich stark von denen aller bekannten Antibiotika unterscheiden, ist eine Bestätigung dafür, daß Rufomycin A und Rufomycin B neue Antibiotika sind.

Die in dem folgenden Beispiel genannten Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, falls nicht anders angegeben. Sämtliche Temperaturen sind unkorrigiert. Beispiel In vier 2-1-Kolben wurden je 500 cm3 eines Kulturmediums folgender Zusammensetzung gegossen: 2,0 °/o Glukose, 0,60/, Fleischextrakt, 0,60/,) Natriumchlorid, 0,60/, Calciumcarbonat, Wasser. Das Medium wurde mit Streptomyces atratus (IFO-3897, ATCC-14046) geimpft und 2 Tage bei 28'C unter Schütteln zur Herstellung eines Vorinkubationsmediums bebrütet. Das auf diese Weise in den vier Kolben erhaltene Medium wurde zu 5001 eines wäßrigen Kulturmediums gegeben, das aus 2,011/0 Glukose, 0,60/0 Fleischextrakt, 0,5 °,/o Pepton, 0,30/, Reiskleie, 0,5 °/o Natriumchlorid, 0,3 °/o Calciumcarbonat und Wasser bestand. Die Mischung wurde nach Einstellung auf pg 7,0 in einem 1-t-Tank bei 28°C unter Rühren und Zuführung von 501 Luft je Minute bebrütet. Vor der Bebrütung wurden 50 g und zur entsprechenden Zeit während der Bebrütung weitere 170 g eines die Schaumbildung verhindernden Öls dem Medium zugesetzt. Das Gesamtgewicht des Antischaumöls von 220 g entspricht etwa 0,22°/a, bezogen auf das Gesamtmedium. Der Fortschritt der Bebrütung während einer Zeit von 89 Stunden ist aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich. Die antibiotische Wirksamkeit wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode unter Verwendung des streptomycinresistenten Stamms von Mycobacterium avium als Testmikroorganismus gemessen und ist in Waksmanschen Verdünnungseinheiten je Kubikzentimeter Brühe angegeben.

Antimikrobische Wirk-

Bebrütungszeit PH-Wert samkeit des Mediums,

Stunden des Mediums Einheiten je Kubikzenti-

meter

0 7,05 <10

17 7,08 <10

30 8,21 < 10

41 7,98 < 10

54 7,98 20

65 7,89 50

78 7,80 100

89 7,30 100

Das fermentierte Medium wurde nach Zugabe einer Filterhilfe filtriert, wobei 4501 Filtrat und 29 kg Mycel erhalten wurden. Das Filtrat wurde auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und zweimal mit einem Drittel seiner Menge an Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschichten wurden vereinigt, und die Lösung wurde mit einer geringen Wassermenge gewaschen und dann unter vermindertem Druck auf etwa 1 1 kondensiert.

Das Mycel wurde in der dreifachen Methanohnenge suspendiert, und die Suspension wurde bei Raumtemperatur bewegt, um das Antibiotikum zu extrahieren. Die Suspension wurde dann filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck auf etwa l01 kondensiert. Zum Kondensat wurden 21 Wasser gegeben. Die wäßrige Mischung wurde auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und zweimal mit einem Viertel seiner Menge an Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden zusammengegeben, und die Lösung wurde unter vermindertem Druck auf etwa 1 1 eingeengt. , Die eingeengten Äthylacetatlösungen, die aus dem Filtrat und dem Mycel erhalten worden waren, wurden getrennt wie folgt behandelt: Zur Äthylacetatlösung wurde etwa ein Fünftel ihrer Menge an Wasser gegeben. Die Mischung wurde geschüttelt, während der pH-Wert der Wasserschicht auf 9 eingestellt wurde. Diese Behandlung wurde wiederholt, worauf die Äthylacetatschicht ausreichend entfärbt war. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft, wobei etwa 30 bis 35 g eines Rückstandes verblieben, der in 300 cm3 Äthanol gelöst wurde. Die Lösung ließ man durch eine mit 1 kg Aluminiumoxyd gefüllte Kolonne rieseln, die mit Äthanol entwickelt und schließlich mit 80°/Qigem wäßrigem Äthanol eluiert wurde, wobei die Komponenten in drei Banden aufgeteilt wurden, nämlich Gelb, Purpur und Orangegelb. Die orangegelbe Bande entspricht dem gewünschten Antibiotikum Rufomycin.
Die der letzten Bande entsprechende ablaufende Flüssigkeit wurde aufgefangen und unter vermindertem Druck auf etwa 100 cm3 eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde über Nacht stehengelassen, wobei sich etwa 4 g Rufomycin B in Form von Kristallen abschieden. Die Mutterlauge wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei etwa 15 g Rufomycin A erhalten wurden, das durch wiederholte Umkristallisation aus Äthanol gereinigt werden kann. Reinigung von Ruf omycin Eine Lösung von 0,2g des nach vorstehendem Beispiel erhaltenen Rufomycins A in 3 cm3 einer Mischung von Aceton, Essigsäure und Benzol im Verhältnis von 10:4:86 ließ man durch eine mit Silikagel gefüllte Kolonne laufen, die dann mit dem Lösungsmittelgemisch der gleichen Zusammensetzung eluiert wurde. Das Eluat wurde durch Feinfraktionierung in Fraktionen von je 3 cm3 getrennt. Die 33. bis 40. Fraktion wurden aufgefangen und zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde aus Äthanol umkristallisiert, wobei Rufomycin B mit folgenden Eigenschaften erhalten wurde: Schmelzpunkt: 165 bis 168°C (Zersetzung) Spezifische Drehung: [x] ö = -73' (c = 1 °/o in Methanol).
Die Fraktionen 41 bis 50 wurden vereinigt und zur Trockene eingeengt. Erhalten wurde ein leicht gelbes Pulver von Rufomycin A, das eine spezifische Drehung [a]0' von -58° (c = 10/0 in Methanol) hatte.

Claims

PATENTANSPRUCH: Die Verwendung von Streptomyces atratus nov. sp. (113O-3897, hinterlegt beim Institut für Fermentation, Osaka, Japan, und ATCC-14046, hinterlegt beim American Type Culture Collection, Washington, D. C., USA.) oder seiner natürlichen oder induzierten Mutanten oder Varianten zur Herstellung des Antibiotikums Rufomycin auf biologischem Wege unter den üblichen Bedingungen, vorzugsweise im submersen Verfahren, Gewinnung des Antibiotikums durch bekannte Verfahren aus der Gärflüssigkeit und gegebenenfalls Zerlegung des Rufomycins in seine Komponenten Rufomycin A und B durch Behandlung mit Äthanol.