DE2108739A1 - Antibiotikumkomplex und Verfahren zur Herstellung desselben - Google Patents

Description

Patentanwalt Dipl.-Phys. Gerhard Lied! 8 München 22 Steinsdorfstr. 21-22 Tel. 29 84

B 5037

CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA No. 5-1, 5-chome, Ukima, Kita-ku, TOKYO, Japan

Antibiotikumkomplex und Verfahren zur Herstellung desselben

Die Erfindung betrifft einen Antibiotikumkomplex (Bezeichnung: S-3466) und ein Verfahren zur Herstellung desselben, sowie ein Verfahren zur Kultivierung einer Art von Streptomyces aureus einschließlich des hierdurch

Dr. F/Ho

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erzeugten biologisch aktiven Komplexes, ferner Verfahren zur Gewinnung und Konzentrierung des Komplexes aus rohen Lösungen desselben, sowie Verfahren zur Trennung des Komplexes in 3 biologisch aktive, kristalline Komponenten, die mit S-3466 A, S-3466 B und S-3466 C bezeichnet werden. Insbesondere betrifft die Erfindung den Antibiotikumkomplex S-3466 und die drei hiervon isolierten biologisch aktiven, kristallinen Substanzen in rohen und gereinigten Formen, sowie Verfahren zur Herstellung, Isolierung und Trennung.dieser Substanzen voneinander.

Der Antibiotikumkomplex und die drei aktiven, hieraus isolierten Komponenten besitzen eine ausgezeichnete Antimikrob-, Insektizid- und Mitizidaktivität und können somit sehr vorteilhaft in der Landwirtschaft gegen verschiedene Mikroorganismen, Insekten und Milben benutzt werden.

Der erfindungsgemäß benutzte Mikroorganismus wurde aus einer Erdprobe aus Tsurugashima-cho, Iruma-gun, Saitama, Japan, isoliert. Dieser Organismus wurde erfindungsgemäß als eine Art von Streptomyces aureus identifiziert, wobei gemäß "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 7th Edition, "The Actinomycete.«"von S. A.Waksman und anderen Veröffentlichungen betreffend die Klassifizierung von Actinomycetes vorgegangen wurde. Eine Kultur der erfindungsgemäßen Art wurde bei dem Fermentation Research Institute, Japan, unter der Nr. FERM-P No. 233 und bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 21428 hinterlegt. Die Kultureigenschaften des Mikroorganismus sind die folgenden:

I. Morphologische Eigenschaften:

1. lange und gerade oder wellenförmige Sporangienträger, die keine Spirale bilden,

2. kugelförmige oder ovale Sporen mit Abmessungen von 0, 7 - 0, 8 χ 0, 9 - 1, 4 u,

Π. Kultureigenschaften in verschiedenen Medien:

(beobachtet nach einer zweiwöchigen Kultivierung bei 25 C. Die Farbbestimmung wurde entsprechend "Iro no Hyöjun", veröffentlicht von Nihon Shikisai Kenkyu-jo, Japan, durchgeführt.)

Saccherose-Nitrat-Agar-Medium Wachstum: gering

es
Luft-Mycel: pulvrig/und geringes Wachstum, cremefarben

lösliches Pigment: keine Erzeugung

Glycerin-Calcium-Malat-Agar-Medium Wachstum: gutes Wachstum, cremefarben Luft-Mycel: pulvrig und gelb-weiß lösliches Pigment: leicht braun

. Glucose-Asparagin-Agar-Medium Wachstum: fahlgelb und gutes Wachstum Luft-Mycel: pulvrig und gelbweiß lösliches Pigment: leicht gelb

Glycerin-Asparagin-Agar-Medium Wachstum: gut-

Luft-Mycel: pulvriges Wachstum, leicht gelb lösliches Pigment: leicht gelbbraun

Ordinal-Nähragarmedium Wachstum: gut
Luft-Mycel: fahlgelb

lösliches Pigment: leicht gelbbraun

Bennet-Medium

Wachstum: gut, faltig und erhöht im Mittelpunkt Luft-Mycel: gelblich-grau lösliches Pigment: dunkelgelbbraun

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Stärke-Agarmedium Wachstum: mäßiges Wachstum, farblos, Luft-Mycel: gelbweiß lösliches !Pigment: leicht gelborange

Kartoffel-Medium Wachstum: gutes Wachstum, gelbbraun, faltig Luft-Mycel: leicht braungrau lösliches Pigment: schwarz

Nitrat-Medium

Wachstum: geschmeidiges, haarähnliches Wachstum Sonstiges: Nitratreduktion; positiv

Gelatine-Agar-Medium Wachstum: Wachsen an der Oberfläche Luft-Mycel: weiß

lösliches Pigment: braun

Sonstiges: langsames Schmelzen und Verflüssigen; wird kraterähnlich

Lackmus-Milch-Medium Wachstum: gutes Wachstum, ringförmig Sonstiges: schwache Koagulation und Peptonisierung

keine Invertaseaktivität

Stärke-Pepton-Agar-Medium Wachstum: gutes Wachstum, faltig Luft-Mycel: leicht gelbbraun lösliches Pigment: dunkelgelbbraun

Cellulose-Aspagarin-Medium kein Wachstum

keine Hydrolyse

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15 Dextrin-Casein-Medium Wachstum: faltig, gelbbraun Luft-Mycel: braunweiß lösliches Pigment: dunkelgelbbraun

Es ist bekannt, daß Mikroorganismen, die zu dem Genus Streptomyces gehören, dazu neigen, sich natürlich oder künstlich bezüglich ihrer morphologischen Eigenschaften und Erscheinungsformen in verschiedenen Medien zu ändern. Ein Mikroorganismus, der mikrobiologische Eigenschaften aufweist, die sich von den vorstehenden unterscheiden, kann deshalb ebenfalls erfindungsgemäß zur Herstellung des Antibiotikumkomplexes S-3466 benutzt werden, solange die Unterschiede nicht die Fähigkeit zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antibiotikums beeinträchtigen.

Der erfindungsgemäße Antibiotikumkomplex S-3466 wird in dem Mycel angesammelt, indem Streptomyces aureus aerobisch in einem chemisch definierten oder natürlichen Kurturmedium kultiviert wird. Das Medium kann ein solches sein, wie es in der Regel bei der Kultivierung von Streptomyces aureus benutzt wird, und es kann assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthalten. Falls erforderlich, kann auch eine kleine Menge an Nährboden, wachstumsfördernden Substanzen, Vorstufen usw. zu dem Kulturmedium hinzugegeben werden.

Bei den zur Kultivierung benutzten Kohlenstoffquellen handelt es sich bei-

Molasse, spielsweise um Glucose, Maltose, Fructose,/Stärke, Dextrin, Glycerin usw. Die Stickstoffquellen können organische Stickstoffverbindungen sein, z.B. Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Maiswasser, Hefe usw., sowie anorganische Verbindungen, wie Nitrate, Ammoniumsalze usw. Die anorganischen Salze weisen Natriumchlorid, Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Calciumkarbonat usw. auf.

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in das aus den vorgenannten Bestandteilen hergestellte Medium, welches einen in etwa neutralen pH-Wert aufweist, wird ein Impfstoff von Streptomyces aureus eingeimpft, woran sich eine aerobische Kultivierung bei einer Temperatur von 25 bis 3O⁰C anschließt. Nach einer Kultivierungszeit von zwei bis sechs Tagen erreicht die Ansammlung und Akkumulierung des Antibiotikumkomplexes S-3466 in dem Mycel den Maximalwert.

Zur Trennung und Gewinnung des Antibiotikumkomplexes S-3466 wird ein bekanntes Verfahren benutzt. Die Fermentationsbrtihe wird gefiltert und der Filterkuchen wird mit einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel, z. B. Methanol, Aceton usw. extrahiert. Dieser Extrakt wird im Vakuum unter Entfernen des Lösungsmittels konzentriert und sodann mit einem nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, z.B. Äthylacetat oder η-Hexan, erneut extrahiert. Der Antibiotikumkomplex wird durch Konzentration des Extrakts im Vakuum erhalten, bei dem ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel eingesetzt wurde. Er fällt als teerige und ölige Substanz an.

Wenn das Mycel durch Filtrieren gesammelt wird, ist es jedoch vorzuziehen, vor dem Filtrieren die Brühe ungefähr eine bis drei Stunden auf 80 C zu erhitzen, wobei der pH-Wert vorzugsweise ungefähr 3 beträgt. Das ist nötig, da das Mycel von Streptomyces aureus so fein und breiig ist, daß die Filtration Schwierigkeiten macht und ein beträchtlicher Verlust an Mycel eintritt. Der pH kann mit Hilfe einer Mineralsäure oder einer organischen Säure, z.B. Salzsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure, eingestellt werden.

Die Extraktion des Antibiotikumkomplexes mit dem wassermischbaren Lösungsmittel kann bei normaler Temperatur ausgeführt werden. Es ist jedoch günstig, die Extraktion bei Rückflußtemperatur durchzuführen, um die Ausbeute an dem gewünschten Komplex zu erhöhen.

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•ν* -

Bei Verwendung von Methanol kann durch die Extraktion bei Rückflußkochen die Reinheit des Komplexes ebenso wie die Ausbeute merklich gesteigert werden. Wenn die Fermentationsbrühe, deren pH-Wert mit Schwefelsäure auf 3 eingestellt worden ist, auf eine Temperatur von 8O⁰C während einer Stunde erhitzt, dann gefiltert, und der Filterkuchen drei Stunden mit Methanol zum Rückfluß erhitzt wird, so ist die Extraktion 5 bis 150 mal wirksamer als in dem Fall, bei dem der Kuchen bei normaler Temperatur ohne pH-Wert-Einstellung, Wärmebehandlung und Rückflußkochen extrahiert wird. Hinzu kommt noch die kürzere Extraktionszeit.

Einige nachfolgende Versuche sind zur Erklärung dieses Effektes angeführt:

Versuch	Behandlung der Brühe	Filtrations zeit	Lösungs mittel	Extraktions bedingungen	Ausbeute+
1	unbehandelt	110 Min.	Aceton 100 ml	Zimmertem peratur über Nacht	63y/ml
2	pH 3; 1 Stunde auf 80 C er hitzt	2, 5 Min.	Aceton 100 ml	3 Stunden Rückfluß	1, 600y/ml
3	pH 3; 1 Stunde auf 80 C er hitzt	3 Min.	Methanol 100 ml	3 Stunden Rückfluß	10, OOOy/ml

+) Die Ausbeute wurde nach dem Verfahren mit der Trübescheibe (pulp disc method) bestimmt.

Der Antibiotikumkomplex S-34 66 wird gewöhnlich in der Form von farblosen oder leicht gelben, prismatischen Kristallen erhalten. In manchen Fällen erhält man jedoch eine ölige Substanz, die eine rotbraune bis fahl-

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gelbe Farbe aufweist. Im letzteren Fall kann eine Kristallisierung durchgeführt werden, indem man die Substanz in einem Gefrierapparat während einer relativ langen Zeit, z.B. während einer Woche, stehen läßt oder indem eine Säulenchromatographie unter Verwendung von Silicagel benutzt wird. Der Antibiotikumkomplex S-3466 ist eine neutrale Substanz, die gegen Licht und Hitze stabil ist. Ihr Schmelzpunkt liegt nach der Umkristallisation aus η-Hexan bei 72 bis 75⁰C. Der Komplex ist in den meisten organischen Lösungsmitteln, wie η-Hexan, Benzol, Chloroform, Diäthyläther, Aceton, Äthylacetat, Petroläther und Alkoholen leicht löslich, in Wasser dagegen unlöslich. Die Elementaranalyse ergab 66, 07% C und 9, 07% H. Halogene, Stickstoff und Schwefel konnten nicht nachgewiesen werden. Die nachfolgenden Reaktionen sind alle negativ: Fehling, Tollens, Carbazol, Elson-Morgan und Ninhydrin.

Der Komplex zeigt in Methanol (Fig. 1) im Bereich von 200 - 400 mu keine UV-Absorptionsmaxima. Wird von der Substanz als flüssiger Film ein Infrarotspektrum aufgenommen, so erscheinen charakteristische Banden bei 2960, 2920, 2860, 1733, 1460, 1381, 1334, 1274, 1195, 1171, 1122, 1092, 1063 und 950 cm" . Diese Banden beweisen das Vorliegen von Methyl-, Methylen-, Carbonyl- und Carbonsäureestergruppen. Fig. 2 gibt das IR-Spektrum wieder.

Im Massenspektrum findet sich der Molekülpeak bei m/e 792 (Fig. 6). Das in CDCIo aufgenommene Kernresonanzspektrum gibt Signale bei 9,12 ^ (Triblett,) 8, 81 tr (Dublett) und 8,73 χ (Dublett) wieder (Fig. 10).

Eine Dünnschichtchromatographie der so erhaltenen rohen Kristalle des Antibiotikumkomplexes S-3466 auf Silicagel zeigt unter Verwendung eines Lösungsmittels, wie n-Hexan, Chloroform, Äthylacetat u. dgl. oder einer Mischung hiervon, drei benachbarte Flecken, die in etwa dieselbe Größe haben. Das Lösungsmittel wird in geeigneter Menge in Anwendung gebracht.

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Dies zeigt, daß der Antibiotikumkomplex S-3466 wenigstens drei eng verwandte Komponenten enthält. Diese Komponenten werden als S-3466 A, S-3466 B und S-3466 C bezeichnet. Die Bezeichnung richtet sich nach der Lage der Substanzen im Chromatographierohr. Die oberste Substanz bekommt die Bezeichnung A, die unterste C. Die Komponenten S-3466 A, S-3466 B und S-3466 C können voneinander durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Silicagel und η-Hexan, Chloroform, Äthylacetat u.dgl. als Eluierungsmittel getrennt werden. Wird z.B. eine Lösung des Antibiotikumkomplexes S-3466 in Chloroform auf den Kopf der Säule, die mit Silicagel gefüllt ist, gegeben, so wird S-3466 zuerst eluiert, wenn ein Gemisch aus Chloroform und Äthylacetat im Verhältnis 2:1 zugegeben wird. Danach wird S-3466 B eluiert, wenn ein Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Äthylacetat im Verhältnis 1:1 verwendet wird. Schließlich wird die Säule noch mit Äthylacetat ausgewaschen. Dabei wird S-3466 C erhalten. Dieses kann durch Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum gewonnen werden. Jede Komponente kann nach den gleichen Kristallisationsverfahren,· wie der S-3468-Komplex.in Form von Prismen zur Kristallisation gebracht werden.

Weitere Einzelheiten und Merkmale der Erfindung sind aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen und anhand der beigefügten Zeichnungen ersichtlich.

Hierin zeigen:

Fig. 1 ein Ultraviolettabsorptionsspektrum des Antibiotikumkomplexes S-3466;

Fig. 2 ein Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikumkomplexes S-3466;

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Fig. 3 ein Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikumkomplexes S-3468 A;

Fig. 4 ein Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums S-3466 B; Fig. 5 ein Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums S-3466 C;

Fig. 6 ein Massenspektrometriediagramm des Antibiotikumkomplexes S-3466, das mit verstärkter Empfindlichkeit des Spektrometer oberhalb m/e 457 aufgenommen wurde. Es wurde ein Hitachi RMU- 6E Massenspektrometer verwendet}

Fig. 7 ein Massenspektrometriediagramm des Antibiotikums S-3466 A, wobei oberhalb m/e 360 mit verstärkter Empfindlichkeit des Spektrometer gearbeitet wurde. Es wurde ein Hitachi RMU-6E /^r Massenspektrometer eingesetzt;

Fig. 8 ein Massenspektrometriediagramm des Antibiotikums S-3466 B, wobei oberhalb m/e 500 mit verstärkter Empfindlichkeit des Spektrometer gearbeitet wurde. Es wurde ein Hitachi RMU-6E Massenspektrometer eingesetzt;

Fig. 9 ein Massenspektrometriäiagramm des Antibiotikums S-3466 C.

, Es wurde ein Hitachi RMU-6E Massenspektrometer verwendet;

Fig. 10 ein NMR-Spektrum des Antibiotikumkomplexes S-3466. Als Kernresonanzspektrometer wurde das Gerät JNM-3H-100 der Japan Electron Optics verwendet. Das Lösungsmittel war CDCIg; als innerer Standard wurde TetramethylsilanTMS verwendet;

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Fig. 11 ein NMR-Spektrum des Antibiotikums S-3466 A. Es wurde unter den gleichen Bedingungen wie bei Fig. 10 erwähnt, aufgenommen;

Fig. 12 ein NMR-Spektrum des Antibiotikums S-3466 B. Aufnahmebedingungen siehe Fig. 10.

Fig. 13 ein NMR-Spektrum des Antibiotikums S-3466 C. Aufnahmebedingungen siehe Fig. 10.

Die Eigenschaften des Antibiotikums S-3466 A, S-3466 B und S-3466 C sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle

Antibiotikum- Antibiotikum Antibiotikum

komplex S-3466 A S-3466 B S-3466 C

Farblose oder leicht Entspricht

gelbliche prismati- S-3466 A Entspricht S-3466 A

j. , sehe Kristalle: Aussehen _{Neutral und} ^_m

^WäVme _Licht

Schmelz- 73 - 74⁰C 79 - 8O⁰C 105 - 106⁰C

punkt: (_{aus n}-Hexan (η-Hexan) (n-Hexan)

umkristallisiert)

Löslich- Löslich in den mei- Dieselben Werte wie bei dem Antibiotikumkeit: sten organischen komplex S-3466 A

Lösungsmitteln, wie Alkoholen, Aceton, Benzol, n-Hexan, Chloroform, Petroläther;Diäthyläther und Äthylacetat

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Elementar- Zusammengesetzt aus analyse Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff als konstituierenden Elementen:
kein Stickstoff, Schwefel oder Halogen;

C 65, 58%
H 8, 85%

Dieselben Werte wie bei dem Antibiotikumkomplex S-3466 A

C 66, 48%
H 8, 97%

Infrarotabsorpti-
onsspektrum

Massenspektro
meter

Fig. 3. Das Spektrum Fig. 4. Nahezu die wird auf einem flüs- gleichen Werte wie sigen Film gemessen bei dem Komplex und zeigt Absorptionen S-3466 A. Starke Abrs

JL

bei sorption bei 1735cm

2920, 2860, 2960, (gemessen mit dem

1733, 1460, 1381, KBr-Tablettenverfah-

1334, 1274, 1195, ren).Starke Absorp-

1171, 1122, 1092, 1063 tion bei 1720 cm

und 950 cm"¹. Starke <f^{messen mlt dem} Absorption bei 1735cm"eHCl₃-Lösungsver-KBr-Preßling. fahren.

In CHCIn starke Absorption bei 1720 cm"¹. Dies zeigt die Gegenwart eines Methylradikals, eines Methylenradikals, von Carbonyl und eines Carbonsäureesters an.

C 65, 41%
H 9,13%

Fig. 5. Nahezu dieselben Werte wie bei dem Komplex S-3466 A. Starke Absorption bei 1735 cm" feemessen mit dem KBr-Tablettenverfahren).

Fig.7.Molekülpeak bei m/e = 764. (Das Spektrum wurde bei erhöhter Empfindlichkeit über ca. 360 m/e des Spektrometer gemessen).
Molgewicht 764 Pig. 8. Bei m/e = 778.
Hieraus ist ein Molekulargewicht von 778
ersichtlich.
(Das Spektrum wird
bei erhöhter Empfindlichkeit des Spektrometers über ca. 500
m/e gemessen).

Molekülpeak Fig. 9./bei m/e = 792. Hieraus ist ein Molekulargewicht von 792 ersichtlich.

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NMR-Spek
trum:

Fig. 11 Gemessen in Fig. 12 Entspricht

in CDCIo. Signale bei 9,12Γ (Triplett), 8,81 (Duplett) und 8,73 (Dublett)

Opti- +6,9 in Chlorosche form
Drehung:

Summen- C-₉H_flfl0₁₉ formet ^{42 68 12}

Fig. 13 Gemessen S-3466A in CDCl.. Signale

bei 9,12Γ (Triplett) und 8,81 (Dublett) Das Signal bei 8,73 verschwand.

+2,0° form

in Chloro- 0,0 in Chloroform

^C43^H70°12

Reak- Fehling, Tollens, Entspricht tionen: Carbazol,Elson S-3466A.

Morgan und

Ninhydrin sind

alle negativ.

^C44^H72°12

Entspricht
S 3466 A.

Der Antibiotikumkomplex-S-3466 und die Antibiotika S-3466/ S-3466 B und S-3466 C mit den vorgenannten Eigenschaften besitzen ausgezeichnete Antimikrob-, Insektizid- und Mitizideigenschaften und sind besonders geeignet zum Abtöten von ausgewachsenen Würmern und Milbeneiern.

Von Vorteil ist die nennenswert niedrige Toxizität und Giftigkeit gegenüber Tieren, Menschen und Pflanzen. So ist z.B. überhaupt keine Toxizität gegenüber Pflanzen, wie Gänseblümchen, Tomaten, Auberginen, französischen Bohnen und Gurken, selbst bei einer Menge von; 1600 ppm, vorhanden. Bei Versuchen an Mäusen zeigte sich, daß dif Antibiotika eine 50% tödliche Dosis von ;3450 mg/kg bei oraler Verabreichung haben. Entzündungen der menschlichen Haut sind nicht zu befürchten.

Zur weiteren Erläuterung dienen die nachstehenden Versuche.

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/Br.

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Versuch 1

Antimikrobaktivität des Antibiotikumkomplexes S-3466.

Die Mindestinhibitorkonzentration (MIC) des vorgenannten Antibiotikums gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wird mittels der Agar-Medium-Verdünnungsverfahren bestimmt. Die hierbei gewonnenen Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.

Positiver Fall MIC(mcg/cm )

Bacillus megaterium IAM 1030 0.2

Bacillus subtilis IAM 1033 0.2

Micro coccus luteus IAM 1490 . 0.8

Corynobacterium miehiganense 0.2

Mvcobacterium tuberculosis H^i^V 0.63

Staphylococcus aureus IAM 1296 0.8

Negativer Fall (bei einem Niveau größer als 50 γ des Antibiotikums)

!herichia coli IAM 1016

Proteus vulgar is-

Asperglllus fumigates

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Versuch 2

Mitizid-Aktivltät gegenüber Tetranychus telarius L.

Blätter von französischen Bohnen (Phaseolus vulgaris) werden mit 90 - 120 ausgewachsenen Milben und 200 - 250 Eiern von Tetranychus telarius L geimpft und in eine Emulsion eingetaucht, die auf die aus Tabelle 2 ersichtlichen Konzentrationen verdünnt ist und aus 40 Gewichtsteilen S-3466-Komplex, S-3466 A, S-3466 B oder S-3466 C, 40 Teilen Xylol, 10 Teilen Cyclohexanol und 10 Teilen Sorpol (Handelsname für ein anionisches, oberflächenaktives Agens, hergestellt von Toho Chemicals) besteht. Die so behandelten Blätter werden in einem thermostatisierten Raum bei einer Temperatur von 25⁰C gebrütet. Der Prozentsatz der getöteten ausgewachsenen Milben wird nach 24 Stunden, der der Eier nach sieben Tagen festgestellt. Diese Ergebnisse werden mit solchen verglichen, die bei derselben Versuchsanordnung unter Verwendung einer Emulsion von Kelthan (Röhm & Haas) erhalten werden. Die Versuchs- und Vergleichswerte sind aus der nachfolgenden Tabelle 2 ersichtlich.

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Tabelle 2

A: Prozentsatz der getöteten ausgewachsenen Milben
B: Prozentsatz der getöteten Eier

Konzentration des aktiven Wirkstoffes	S-3466 Complex Emulsion	B	1	S-3466 A Emulsion	B	S-3466 B Emulsion	B	S-3466 C Emulsion	B	4 5	Kelthane	Emulsion	I )■*
	A	100	2 ,9	A	100	A	100	A	100	.4 .6	A	B	a» I
200 ppm	100	100	,0	100	100	100	100	100	100	.1	100	100
100 ppm	100	100 94.	.5	100	100 96.0	100	80.5 63.3	100	96. 82.	.5	100	100
ITS CM 09839	100 100	91. 88,	100 100	90.3 91.5	98.8 93.2	61.2 48.9	100 98.2	60 50	100 98.8	98.5 90.2
^ 12,5 " cn *** e ο Ii	96.0 85.4	74.	98.0 88.3	70.3	91.2 75.5	36.3	92.4 74.2	42	96.0 83.4	73.0 60.4
3.1 "	76.8	69.	79.1	69.1	64.3	20.1	60.5	30	72,3	21.7
1.6 »	63.5		68.3	50.1	51.4		52.1	11.5

Versuch 3 ^

Insektizidaktivität gegenüber grünen Pfirsichblattläusen.

40 bis 50 grüne Pfirsichblattläuse (Myzus percicae Sulzer) werden wie Parasiten auf topfgepflanzte Auberginen aufgebracht und sorgfältig mit einem netzbaren Pulver des Antibiotikumkomplexes S-3466 besprüht, der die aus der nachstehenden Tabelle 3 ersichtlichen Konzentrationen aufweist. Dieses netzbare Pulver wird hergestellt durch ein inniges Mischen von 40 Teilen Antibiotikumkomplex S-3466, 35 Teilen ' Radiolite Nr. 200 (Handelsname für Diatomenerde) und 20 Teilen "White Carbon". 3,5 Teile Sorpol 5024-O (Handelsname für ein anionisches, oberflächenaktives Agens, hergestellt von Toho Chemicals) und Ligninsulfonat werden der resultierenden Mischung zugegeben, woran sich ein gründliches Mischen der Mischung anschließt. Die Blattläuse und die Pflanze werden in einem thermostatischen Raum bei einer Temperatur von 25⁰C stehen gelassen. Nach 24 Stunden wird der Prozentsatz der getöteten Blattläuse festgestellt. Die gewonnenen Ergebnisse werden mit solchen verglichen, die unter Verwendung eines DDT-Pulvers (netzbar) erhalten werden. Die Versuchswerte und Yergleicheergebnisse sind aus der nachstehenden Tabelle 3 ersichtlich.

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Tabelle 3

Konzentration des	S-3466 Emulsion	Pflanzen.	Benetzbares DDT-Pulver
aktiven Agens	% Sterblichkeit	% Sterblichkeit
200 ppm	100	98.0
100 ppm	90.5	82.2
50 ppm	81.2	50.3
25 ppm	62.4	13.5
Versuch 4
Toxizität gegenüber

Topfgepllanzte Chrysanthemen, Gänseblümchen, Tomaten, Auberginen, französische Bohnen, Gurken und chinesischer Kohl werden sorgfältig mit demselben Agens wie in Beispiel 3 besprüht, das auf die aus der nachstehenden Tabelle 4 ersichtlichen Konzentrationen verdünnt ist. Die so behandelten Pflanzen werden sodann in einem Gewächshaus stehen gelassen. Nach zwei und vier Tagen werden die Pflanzen daraufhin untersucht, welche Schädigung sie genommen haben. Die hierbei gewonnenen Ergebnisse sind aus der nachstehenden Tabelle 4 ersichtlich.

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Tabelle 4

Pflanze

Sprühkonzentration (ppm)

Zeit nach dem

Besprühen in —

Tagen 1600 800 400 200 100 nicht behandelt

Chry- 2 ++.+ +--

santhemen 4 ++++++-

Gänseblümchen

Tomaten

Auberginen

französische Bohnen

Gurken

Chinesischer Kohl

Die in der vorstehenden Tabelle benutzten Symbole haben folgende Bedeutung:

: keine Flecken

+ : Fläche der Flecken weniger als 3 %

+ : Fläche der Flecken 3 bis 10 %

-H- : Fläche der Flecken 10 bis 30 % 10 9 8 3 9/1532

: Fläche der Flecken mehr als 30 %.

Versuch 5 Giftigkeit bei Mäusen

Die 50%-tötliche Dosis (LDen) gegenüber Mäusen beträgt bei dem Antibiotikumkomplex S-3466 bei oraler Verabreichung 3450 mg/kg. /

Beispiel 1

,101 eines aus 1 % Glucose, 2 % Glycerin, 0,2 % Pepton, 0,2 % Nährhefe, 0,2 % Fleischextrakt, 2 % Sojabohnenmehl, 0, 05 % Magnesiumsulfat, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat und 1 % Calciumcartoonät bestehenden Mediums werden in ein Fermentationsgefäß eingegeben und

in herkömmlicher Weise sterilisiert. In das Medium werden sodann

3 +)

200 cm einer Keimflüssigkeit von Streptomyces aureus S-3466 eingeimpft, die während dreier Tage bei 27⁰C in einem Medium der vorstehenden Zusammensetzung einer Schüttelkulturbehandlung unterzogen worden war. Der Mikroorganismus wurde während vier Tagen bei 27°b einer Luftzufuhr von 5 l/Min, ausgesetzt, wobei mit einer Geschwindigkeit von 250 U/Min, gerührt wurde. Das feine, pulpenähnliche Mycel:'-im wird mit einem Zentrifugator zusammen mit einem Separator vom De-Laval-Typ abgetrennt und zweimal mit 2 1 Aceton extrahiert. Das Extrakt wird unter reduziertem Druck zum Ausdestillieren von Aceton konzentriert. Das resultierende Konzentrat wird zweimal mit 1 1 η-Hexan extrahiert. Das letztgenannte Extrakt wird sodann unter reduziertem Druck zum Ausdestillieren von η-Hexan konzentriert, so daß man eine ölige, rotbraune Substanz erhält. Diese ölige Substanz wird sodann durch eine Säule (25 χ 300 mm) geleitet, die mit 100 g Silicagel gepackt ist. η-Hexan wird als Lösungsmittel benutzt, Die Säule ⁺VeRM-P Nr. 233:-ATCC Nr. 21428) .

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wird mit einer Mischung von Lösungsmitteln, die aus n-Hexan-Äthylacetat (9:1) besteht, eluiert. Die hiernach gewonnene Substanz wird unter reduziertem Druck konzentriert, und man erhält einen rohen Antibiotikumkomplex S-3466 als ölige, leichtgelbe Substanz.

ti Die ölige Substanz wird sodann in einem Gefrierapparat

während einer Woche stehengelassen, und man erhält 2 g rohe Kristalle des Antibiotikumkomplexes S-3466.

Beispiel 2

1 1 eines aus 2,0 % Glucose, 0,5 % Maiswasser, 2,0 % Sojabohnenmehl, 0,05 % Magnesiumsulfat, 0,2 % Pepton und 0,2 % Glycerin-

Rest Wasser - bestehenden Mediums werden in Teilen von 100 cm in

3
zehn 500 cm Sakaguchi-Kolben eingegeben. Nachdem die Kolben in der üblichen Weise sterilisiert worden sind, werden sie mit Streptomyces aureus S-3466 (FERM-P Nr. 233; ATCC Nr. 21428) geimpft. Hierauf folgt eine Kultivierung bei 27°C während 72 Stunden, wobei geschüttelt wird. Die Fermentationsbrühe wird in einen 3 1-Erlenmey er-Kolben eingegeben, auf einen pH-Wert von ca. 3,0 durch Zugabe von Schwefelsäure eingestellt und auf 8O⁰C erhitzt. Diese Temperatur wird während ca. 2 Stunden aufrechterhalten. Nachdem man das ganze abkühlen läßt, wird die Fermentationsbrühe gefiltert, um das Mycel zu gewinnen, was sodann mit 11 Aceton unter Erhitzen zum Rückfluß extrahiert wird. Das Acetonextrakt wird sodann unter reduziertem Druck destilliert. Das resultierende Konzentrat wird zweimal mit 500 cm η-Hexan extrahiert. Das Extrakt wird getrocknet und unter reduziertem Druck destilliert. Man erhält eine rotbraune, ölige Substanz. Nachdem man diese Substanz in einem Gefrierapparat stehen läßt, erhält man

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100 mg an rohem Antibiotikumkomplex S-3466 als leicht gelbliche Kristalle. Die verbleibende ölige Substanz wird der Säulenchromatographie mit Silicagel unterzogen. Die Säule wird mit einer Mischung von Lösungsmitteln, bestehend aus n-Hexan-Äthylacetat (9 : 1), entwickelt. Hieran schließt sich die Abtrennung des Produktes an, wobei man weitere 95 mg an rohem, kristallinem Komplex S-3466 erhält.

Beispiel 3

a)l 1 eines aus 2 % Glucose, 2 % Sojabohnenmehl, 0,5 % Maiswasser, 0,025 % Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat und 0,2 % Glycerin (Rest Wasser) bestehenden Mediums werden in Tei-

3 3

len von 100 cm in zehn 500 cm -Sakaguchi-Kolben eingegeben. Nachdem die Kolben in üblicher Weise sterilisiert worden sind, werden sie mit einer Impfprobe von Streptomyces aureus (FERM-P Nr. 233; ATCC Nr. 21428) geimpft, die sodann bei 27°C während 72 Stunden unter Schütteln kultiviert wird. Die Fermentationsbrühe wird in einen 3 I-Erlenmeyer-Kolben eingebracht, auf einen pH-Wert von ca. 3,0 durch Zugabe von Schwefelsäure eingestellt und auf 8O⁰C erwärmt. Diese Temperatur wird während einer Stunde aufrechterhalten. Nach einem Abkühlenlassen wird die Fermentationsbrühe zur Gewinnung des Mycels gefiltert, welches sodann mit 1 1 Methanol extrahiert wird, wobei zum Rückfluß erhitzt wird. Das Extrakt wird sodann unter reduziertem Druck zur Entfernung von Methanol destilliert.

3 Der Rückstand wird zweimal mit 500 cm η-Hexan extrahiert. Die

3 kombinierten Extrakte werden getrocknet, zu 100 cm konzentriert und stehen gelassen, wobei man 4,2 g rohe Kristalle des Antibiotikumkomplexes S-3466 erhält.

b) 2,0 der rohen Kristalle von S-3466, welches gemäß a) erhalten wird, werden in einer kleinen Menge Äthylacetat gelöst; die resultierende Lösung wird sodann der Säulenchromatographie unterzogen, wobei 400 g ^üicagel

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(hergestellt von E.Merck; Teilchendurchmesser weniger als 0,08 mm) und Äthylacetat als Lösungsmittel benutzt werden. Man erhält 1, 51 g an S-3466. Beispiel 4

700 mg des reinen Antibiotikums S-3466, wie es in den Beispielen 1 bis 3 erhalten wurde, wurde in einer kleinen Menge eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Äthylacetat (2 : 1) gelöst. Diese Lösung wurde dann auf den Kopf einer mit Silicagel gefüllten Säule (30 χ 500 mm) gegeben. Die Säule enthält 120 g Kieselgel. (E.Merck Co., der Teilchendurchmesser betrug weniger als 0,08 mm.) Die Säule wurde zuerst mit 1,5 1 Chloroform-Äthylacetat (2 : 1) eluiert. Das Eluat wurde in Proben mit 15 ml fraktioniert.

Das Antibiotikum S-3466 jeder Fraktion wurde mit Bioversuchen unter Verwendung von Bacillus subtilis und mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie, bei der Silicagel eingesetzt wurde, geprüft. Die S-3466 enthaltenden Fraktionen mit der Nummer 70 - 100 wurden zusammengegeben und im Vakuum konzentriert. Es wurden 120 mg S-3466 A erhalten.

Dann wurde die Säule mit 1 1 Chloroform-Äthylacetat (1 : 1) eluiert und in der gleichen Weise wie S-3466 A behandelt. Es wurden 400 mg S-3466 B erhalten. S-3466 B befand sich in den Fraktionen 105 - 150.

Schließlich wurde die Säule mit 1 1 Äthylacetat ausgewaschen und das Eluat im Vakuum konzentriert. Es wurden 110 mg S-3466 C erhalten.

Beispiel 5

a) 20 1 eines Mediums aus 2 % Glucose, 1 % löslicher Stärke, 1,5 % Sojabohnenmehl, 0,5 % Natriumchlorid, 0,025 % K₃HPO₄, 0,05 % MgSO₄.7H₂O, 0,4 % CaCO₃ und 0,02 % Adekanol (Handelsmarke; Entschäumungsmittel der ASAHI ELECTROCHEMICAL CO., LTD., TOKYO·OSAKA)wurden in ein Fermentationsgefäß gegeben und

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in üblicher Weise sterilisiert. In das Medium wurden sodann 200 ml einer Keimflüssigkeit einer Mutante M-3-118 (ATCC Nr. 21658) eingeimpft, die vonStreptomyces aureus S-3466 (FERM-P Nr. 233; ATCC Nr. 21428) erhalten wurde. Die Keim flüssigkeit war durch eine Schüttelkulturbehandlung von drei Tagen bei 27 C in einem Medium der obigen Zusammensetzung erhalten worden. Die Mikroorganismen wurden drei Tage bei 27°C unter Belüftung von 15 1 pro Minute gezüchtet, während die Rührgeschwindigkeit 250 Umdrehungen pro Minute betrug.

Mit Schwefelsäure wurde der pH der Brühe auf drei eingestellt. Die Brühe wurde dann 30 Minuten auf 8O⁰C erhitzt. Danach wurde unter Zugabe von 2% Radiolite-900 (Handelsmarke; Diatomenerde der SHOWA CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD., TOKYO) filtriert.

Der auf diese Weise erhaltene Filterkuchen wurde mit 10 1 Methanol extrahiert während am Rückfluß gekocht wurde. Das Extrakt wurde im Vakuum konzentriert und das resultierende Konzentrat mit 5 1 η-Hexan extrahiert.

Letzteres Extrakt wurde dann im Vakuum unter Verdampfen von η-Hexan konzentriert. Es wurden 130 g einer öligen Substanz erhalten. Diese ölige Substanz wurde über Nacht stehen gelassen, wobei S-3466 als feste Substanz anfiel.

Die Substanz wurde in Stücke gebrochen und mit kaltem Methanol gewaschen. Es wurden 90 g an Rohkristallen des S-3466-Komplexes erhalten.

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b) Zwei g des Rohkomplexes S-3466 wurden in einer kleinen Menge Chloroform gelöst. Diese Lösung wurde dann in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 beschrieben behandelt, wobei eine Säule (40 χ 500 mm) verwendet wurde, die mit 400 g Kieselgel gefüllt war. Die Ausbeute betrug an S-3466 A 150 mg, an S-3466 B 720 mg und an S. 3466 C 912 mg.

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Claims (23)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums S-3466, dadurch gekennzeichnet, daß unter aerobischen Bedingungen Streptomyces aureus in einem chemisch definierten oder natürlichen Nährmedium

und

kultiviert werden, welches assimilierbare Kohlenstoff-/ Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antibiotikumkomplex aus dem My eel gewonnen wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Art von Streptomyces aureus verwendet wird, die bei dem Fermentation Research Institute, Japan, unter der Nr. FERM-P Nr. 233 und bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 21428 hinterlegt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Streptomyces aureus eine Mutante verwendet wird, die sich vom Streptomyces aureus S-3466 ableitet, die bei dem Fermentation Research Institute, Japan unter der Nr. FERM-P Nr. 233 und bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC Nr. 21428 hinterlegt ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mutante Streptomyces aureus ATCC Nr. 21658 verwendet wird.

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6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces aureus bei einer Tempe
zwei bis sechs Tagen kultiviart wird.

Streptomyces aureus bei einer Temperatur von 25 - 30 C während

7. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung eines Antibiotikumkomplexes mit der Bezeichnung S-3466 folgende Verfahrensschritte durchgeführt werden:

a) Streptomyces aureus werden in einem chemisch definierten oder natürlichen Medium unter aerobischen Bedingungen kultiviert, welches assimilierbare Kohlenstoff-/Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält,

b) das Mycel der Fermentationsbrühe wird gesammelt,

c) das Mycel wird mit einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel extrahiert und der mit einem wassermischbaren Lösungsmittel hergestellte Extrakt konzentriert,

d) der Extrakt, der mit einem wasserlöslichen Lösungsmittel erhalten wurde, wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel erneut extrahiert,

e) der letztgenannte Extrakt wird konzentriert.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das mit Wasser mischbare, organische Lösungsmittel aus Methanol und/ oder Aceton und das mit Wasser nicht mischbare, organische Lösungsmittel aus η-Hexan und/oder Äthylacetat besteht.

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9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentationsbrühe auf ca. 8O⁰C während 1 filtrieren zur Mycelgewinnung erwärmt wird.

die Fermentationsbrühe auf ca. 8O⁰C während 1-3 Stunden vor dem

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der Fermentationsbrühe ungefähr 3 beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der Fermentationsbrühe mit Salzsäure eingestellt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der Fermentationsbrühe mit Schwefelsäure eingestellt wird.

13. Verfahren nach Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der Fermentationsbrühe mit Essigsäure eingestellt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel ausgeführt wird, während am Rückfluß gekocht wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel Aceton verwendet wird.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel Methanol verwendet wird.

17. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung eines Antibiotikumkomplexes der Bezeichnung S-3466 folgende Verfahrensschritte durchgeführt werden:

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a) Streptomyces aureus werden unter aerobischen Bedingungen in

einem chemisch definierten oder natürlichen Medium kultiviert,

und '

welches assimilierbare Kohlenstoff-/ Sticks.toffquellen und anorganische Salze enthält;

b) der pH-Wert der Fermentationsbrühe wird mit Schwefelsäure auf ca. 3,0 eingestellt und die Fermentationsbrühe wird auf ca. 80 C während ca. 3 Stunden erwärmt;

c) die Brühe wird zum Sammeln und Gewinnen des Mycels gefiltert;

d) das Mycel wird zur Extrahierung des Antibiotikumkomplexes S-3466 mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel behandelt, welches aus Aceton und/oder Methanol besteht und der Extrakt konzentriert;

e) der aus der Extraktion erhaltene Rückstand wird weiterbehandelt, indem zur Extrahierung des Antibiotikumkomplexes S-3466 ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel wie n-Hexan und/oder Äthylacetat verwendet wird;

f) der letztgenannte Extrakt wird konzentriert.

18. Verfahren zur Trennung des Antibiotikumkomplexes S-3466 in drei Komponenten S-3466 A, S-3466 B und S-3466 C, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex in einer Chromatographiesäule auf Kieselgel absorbiert und der Komplex mit η-Hexan -Chloroform und Äthylacetat eluiert wird.

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19. Verfahren zur Trennung des Antibiotikumkomplexes S-3466 in drei Komponenten S-3466 A, S-3466 B und S-3466 C, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex in einer Chromatographiesäule auf Kieselgel adsorbiert und zuerst S-3466 A mit einein Gemisch aus Chloroform-und Äthylacetat im Verhältnis 2:1, dann S-3466 B mit einem Chloroform-Äthylacetatgemisch im Verhältnis 1 : 1 und schließlich die Säule allein mit Äthylacetat eluiert wird und aus dem entsprechenden Eluat S-3466 A, S-3466 B und S-3466 C gewonnen wird.

20. Antibiotikumkomplex mit der Bezeichnung S-3466, der als antimikrobisches, Insektizides oder mitizides Mittel verwendbar ist, der farblose oder leichtgelbe prismatische Kristalle bildet, der gelegentlich als ölige Substanz erhalten wird, der neutral und gegen Licht und Hitze stabil ist, der bei 72 - 75⁰C schmilzt, wenn er aus η-Hexan umkristallisiert wurde, der in den meisten organischen Lösungsmitteln wie η-Hexan, Benzol, Chloroform, Diäthylather, Aceton, Äthylacetat, Petroläther und Alkoholen löslich, in Wasser jedoch unlöslich ist, der aufgrund der Elementaranalyse folgende Zusammensetzung hat, 66,07 % C, 9,07 % H, wobei Halogene, Stickstoff und Schwefel nicht nachweisbar sind, der bei folgenden Reaktionen keine Reaktion zeigt, Fehling, Tollens, Carbazol, Elson-Morgan und Nxnhydrin, in Methanol gelöst, im UV-Spektrum im Bereich von 200 - 400 m ai keine Absorptionsmaxima zeigt, der im m-Spektrum charakteristische Banden bei 2960, 2920, 2860, 1733, 1460, 1381, 1334, 1274, 1195, 1171, 1122, 1092, 1063 und 950 cm'¹ zeigt, wobei die Messung an einem Flüssigkeitafilm durchgeführt wurde, wobei die angeführten Banden die Anwesenheit von Methyl-,

beweisen, Methylen- Carbonyl-und Carbonsäureestergruppen dor im Massen-

Fspektrum den Molekülpeak bei m/e 792 kit ι-ül dorisen NMR-Spektrum,

■vm i 09819/1532

in CDCl₃ gemessen, Signale bei 9,12 ϊ,(Triplett), 8,81 t(Duplett) und 8,73t(Duplett) aufweist.

21, Antibiotkumkomplex mit der Bezeichnung S-3466 A, der ale antimikrobiscb.es, Insektizides und mitizides Mittel verwendbar ist, der farblose prismatische Kristalle bildet, der neutral und gegen Hitze und Licht stabil ist, der bei 73 - 74° C schmilzt, wenn er aus η-Hexan umkristallisiert wurde, der in den meisten organischen Lösungsmitteln wie η-Hexan, Benzol, Chloroform, Diäthyläther, Aceton, Äthylacetat, Petroläther und Alkoholen löslich, in Wasser jedoch unlöslich ist, der aufgrund der Elementaranalyse für ^C42^H68°12 ^{die Zusammensetzun}g ⁶⁵J 58 % C und 8, 85 % H hat, wobei Halogene, Stickstoff und Schwefel nicht nachweisbar sind, der im IR-Spektrum charakteristische Banden bei 2960, 2920, 2860, 1738, 1460, 1381, 1334, 1274, 1195, 1171, 1122, 1092, 1063 und 050 cm"¹ aufweist, wobei die Messungen an einem Flüssigkeitsfilm erfolgten, der im IR-Spektrum eine starke Bande bei 1735 cm" hat, wenn die Messung an einem KBr-Pressling erfolgte und der im IR-Spektrum eine starke Absorption bei 1720 cm" hat, wenn die Messung in CHCIg-Lösung erfolgte, was die Anwesenheit von Methyl-, Methylen-, Carbonyl- und Carbonsäureestergruppen beweist, der im Massenspektrum einen Molekülpeak bei m/e 778 hat, dessen NMR-Spektrum, in CDCl₃ gemessen, Signale bei 9,12 * (Triplett), 8, 811 (Duplett) und 8,73 X (Duplett) hat, der in Chloroform eine optische Drehung von +2,0 hat und der bei folgenden Reaktionen negativ reagiert, Fehling, Tollens, Carbazol, Elson-Morgan und Ninhydrin.

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22. Antibiotikumkomplex mit der Bezeichnung S-3466 B, der als antimikrobisches, Insektizides und mitizides Mittel verwendbar ist, der farblose, prismatische Kristalle bildet, der neutral und gegen Hitze und Licht stabil ist, der bei 79 - 8O⁰C schmilzt, wenn er aus η-Hexan umkristallisiert wurde, der in den meisten organischen Lösungsmitteln, wie n-Hexan, Benzol, Chloroform, Diäthyläther, Aceton, Äthylacetat, Petroläther und Alkoholen löslich, in Wasser jedoch unlöslich ist, der für C₄₃H₇₀O₁₂ nach der Elementaranalyse 66,48 % C und 8,97 % H hat, wobei Halogene, Stickstoff und Schwefel nicht nachweisbar sind, der im IR-Spektrum Banden bei 2960, 2920, 2860, 1733, 1460, 1381, 1334, 1274, 1195, 1171, 1122, 1092, 1063 und 950 cm" hat, wobei die Messung an einem Flüssigkeitsfilm erfolgte, dessen IR-Spektrum eine starke Bande bei 1735 cm" aufweist, wenn die Messung an einem KBr-Pressling erfolgte, was die Anwesenheit von Methyl-, Methylen-, Carbonyl- und Carbonsäureestergruppen beweist, der im Massenspektrum denMolekülpeak bei m/e 778 hat, dessen NMR-Spektrum,in CDCl, gemessen, Signale bei 9,12 *? (Triplett),

8,81 ^c (Duplett) und 8,73 χ (Duplett) hat,- der in Chloroform eine optische Drehung von + 2,0° hat und der gegen folgende Reaktionen negativ ist: Fehling, Tollens, Carbazol, Elson-Morgan und Ninhydrin.

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23. Antibiotikumkomplex mit der Bezeichnung S-3466 C, der als antimikrobisches, Insektizides und mitizides Mittel verwendbar ist, der farblose, prismatische Kristalle bildet, der neutral und gegen Hitze und Licht stabil ist, der bei 105 - 106⁰C schmilzt, wenn er aus η-Hexan umkristallisiert wurde, der in den meisten organischen Lösungsmitteln wie η-Hexan, Benzol, Chloroform, Diäthyläther, Aceton, Äthylacetat, Petroläther und Alkoholen löslich, in Wasser jedoch unlöslich ist, der für ^C44^H7o°i2 ^{nach der Elem}entaranalyse 65,41 % C und 9,13 % H hat, wobei Halogene, Stickstoff und Schwe- * fei nicht nachweisbar sind, der im ER-Spektrum Banden bei 2960, 2920, 2860, 1733, 1460, 1381, 1334, 1274, 1195, 1171, 1122, 1092,

1063 und 950 cm" hat, wobei die Messung an einem Flüssigkeitsfilm erfolgte, und dessen IR-Spektrum eine starke Bande bei 1735 cm aufweist, wenn die Messung mit einem KBr-Pressling. erfolgte, was die Anwesenheit von Methyl-, Methylen-, Carbonyl- und Carbonsäureestergruppen beweist, der im Massenspektrum den Molekülpeak bei m/3 792 hat, dessen NMR-Spektrum in CDCUgemessen Signale bei 9,12 ^(Triplett) und 8, 81 ^Duplett) hat, der in Chloroform eine optische Drehung von 0,0° hat und der gegen folgende Reaktionen negativ ist: Fehling, Tollens, Carbazol, Elson-Morgan und Ninhydrin.

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