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Verfahren zum Entfernen der Transglucosidase aus Pilzamylase-Zubereitungen
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Entfernen der Transglucosidase
aus Pilzamylase-Zubereitungen für die Verzuckerung von Stärke, stärkehaltigen Stoffen
und Abbauprodukten. Die mit den erfindungsgemäß behandelten Amylasezubereitungen
gewonnenen Stärkehydrolysate enthalten eine außergewöhnlich hohe Konzentration an
Dextrose.
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Amylasezubereitungen, welche aus Organismen der Aspergillus-niger-
und Aspergillus-flavus-oryzae-Gruppen stammen, werden bereits in großem Umfange
von der Industrie, z. B. bei der enzymatischen Verzuckerung von teilhydrolysierter
Stärke zur Bildung von dextrosehaltigen Sirupen, verwendet. Jedoch hat die Erfahrung
gezeigt, daß die Bildung von unfermentierbaren Dextrosepolymeren dazu führt, die
Brauchbarkeit solcher Zubereitungen besonders bei Verfahren zur Gewinnung von reiner
kristalliner Dextrose zu beschränken.
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Amylasezubereitungen von mikrobiologischem Ursprung, insbesondere
solche, welche aus Organismen der .A spergillus-niger- und A spergillus-flavus-oryzae-Gruppen
der Aspergillusart stammen, enthalten drei Hauptarten von Enzymaktivität, welche
sich mit der Hydrolyse von c@-1,4-gebundenen Glucosepolymeren befassen. Diese drei
Gruppen von Aktivität können bezeichnet werden als x-Amylaseal,.tivität, Glucamylase-
(Maltase-) Aktivität und Transglucosidaseaktivität.
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a Amylasewirkung auf Stärkepasten verursacht beträchtliche Verringerung
der Viskosität. Beim Fehlen merklicher ?Mengen von Glucamylase- (Maltase-) Aktivität
werden beträchtliche Mengen von Maltose durch x Amylasewirkung erzeugt.
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Glucamylasewirkung auf Stärke und/oder Maltose führt zur Bildung von
Dextrose. Diese Art von Einwirkung ist auch als Maltase-, Amyloglucosidase-, glucogenische
oder Stärkegluconaseaktivität bezeichnet worden.
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Transglucosidaseaktivität führt dagegen zur Bildung, insbesondere
aus '.L#faltose, von unfermentierbaren Dextrosepolymeren, welche a-1,6-glucosidische
Bindungen enthalten und nicht zu Dextrose hydrolysierbar sind.
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Ein Ziel der Erfindung ist daher, Transglucosidaseaktivität aus Amylasezubereitungen
zu entfernen, um die Wirksamkeit und Brauchbarkeit solcher Zubereitungen insbesondere
für die Hydrolyse von Stärke oder ihren Isonvertierungsprodukten zu dextrosehaltigen
Flüssigkeiten mit ungewöhnlich hoher Dextrosekonzentration zu vergrößern.
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Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Entfernen der Transglucosidase
aus Pilzamylase-Zubereitungen für die Verzuckerung von Stärke, stärkehaltigen Stoffen
und Abbauprodukten und ist dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung in wäßrigem
Medium mit einem Tonmineral behandelt und das Medium von dem Tonmineral abgetrennt
wird. Vorzugsweise wird die Amylasezubereitimg mittels Aspergillusarten, wie Aspergillus
niger oder Aspergillus flavus-oryzae, gewonnen. Die Hauptverwendung der erfindungsgemäß
erhaltenen Zubereitungen besteht im Hydrolysieren von Stärke zu Dextrose.
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Alle geprüften Pilzamylase-Zubereitungen enthielten merkliche Mengen
an Transglucosidaseaktivität, gemesden durch das Ausmaß der Synthese von unfermentierbaren
Zuckern aus Maltose. Es wurde ferner gefunden, daß das Verhältnis von Transglucosidase
zu Glucamylase in der Enzymzubereitung, gemessen, wie noch beschrieben wird, in
erheblicher Weise die Dextrosemenge beeinträchtigt, welche aus teilhydrolysierter
Stärke bei der Hydrolyse mittels der Enzymzubereitung erhalten werden kann.
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Bestimmung der Glucamylaseaktivität Das Substrat ist ein 15 bis 18
D.E. sprühgetrocknetes saures Hydrolysat von Maisstärke. Dieses Material wird in
Wasser gelöst und auf 4,0 g Trockensubstanz pro 100 ccm Lösung verdünnt. Genau 50
ccm der Lösung werden in einem 100-ccm-Kolben pipettiert. Zu dem
Kolben
werden 5,0 ccm eines 1,Omolaren Natriumacetat-Essigsäure-Puffers vom pH 4,3 zugesetzt.
Der Kolben wird dann in ein Wasserbad von 60°C gebracht, und nach 101Iinuten wird
die richtige Menge an Enzymzubereitung zugefügt. Genau 120 Minuten nach Zusatz der
Enzymzubereitung wird die Lösung auf einen Phenolphthaleinendpunkt mit 1 n-Natriumhydroxydlösung
eingestellt. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur gekühlt und auf das Volumen
verdünnt. Ein reduzierender Zuckerwert, berechnet als Dextrose, wird an dem verdünnten
:duster und an einem Kontrollmuster ohne Zusatz einer Enzymzubereitung bestimmt.
Glucamylaseaktivität wird berechnet wie folgt:
worin _-1 = Glucamylaseaktivität in Einheiten pro Kubikzentimeter oder pro Gramm
Enzymzubereitung, S = reduzierende Zucker im enzv urkonvertierten Muster, Gramm
pro 100 ccm, B =reduzierende Zucker beim Kontrollversuch, Gramm pro 100 ccm, E =
Menge an verwendeter Enzymzubereitung, Kubikzentimeter oder Gramm bedeutet. Die
reduzierende Zuckerkonzentration in dem enzymkonvertierten Muster sollte nicht mehr
als 1,0 g pro 100 ccm sein.
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Bestimmung von Tranbglucosidaseaktivität Eine Maltoselösung wird durch
Lösen von 200 g von Pfanstiehl C. P. 3laltose in Wasser und Verdünnen auf 500 ccm
hergestellt. Genau 50 ccm werden in einen 100-ccm-Kolben pipettiert. Zu dem Kolben
werden 5 ccm eines 1,Omolaren Natriumacetat-Essigsäure-Puffers vom pA 4,3 zugesetzt.
Nach dem Vermischen wird eine Menge an Enzymzubereitung, welche 2,8 Einheiten Glucamylaseaktivität
enthält, zugesetzt. Der Kolben wird in ein 60'C-Wasserbad gebracht. Nach 72 Stunden
wird der Kolben in ein siedendes Wasserbad für 15 Minuten gebracht, dann gekühlt
und der Inhalt quantitativ in einen 150-ccm-Becher übergeführt. Die Lösung wird
auf pA 4,8 mit 1 n-\ atriumhydroxy dlösung eingestellt, in einen 500-ccm-Erlenmeyerkolben
übergeführt und auf etwa 200 ccm verdünnt. 10 g Fleischmanns-Aktivtrockenhefe werden
zugesetzt und der Kolben 5 Stunden bei 30-C stetig geschüttelt. Der Inhalt wird
dann in einen 250 ccm-Kolben übergeführt und auf dieses Volumen verdünnt. 200 ccm
werden dann mit 2000 Umdrehungen pro Minute während 15 Minuten zentrifugiert und
die überstehende Flüssigkeit in einen trockenen Kolben dekantiert. 50 ccm dieser
Flüssigkeit werden in ein 70-ccm-Prüfrohr übergeführt, 5 ccm 3,0 n-Salzsäure zugegeben,
das Prüfrohr locker zugestopft, dann in einem siedenden Wasserbad 3 Stunden erwärmt
und schließlich in einem Eisbad gekühlt. Der Inhalt des Rohrs wird in einen 100-ccm-Kolben
übertragen und mit 1 n-Natriumhvdroxyd auf den Phenolphthaleinendpunkt eingestellt.
Ein reduzierender Zucker, berechnet als Dextrose, wird mit einem aliquoten Teil
der schließlichen Lösung bestimmt. Uni eine Korrektur für den durch die Hefe eingeführten
reduzierenden Zucker zu erhalten, wird ein Kontrollmuster eingeschlossen, in welchem
20 g reine Dextrose an Stelle von Maltose ohne Enzymzusatz verwendet werden. Der
reduzierende Zuckerwert de: enzymkonvertierten Musters, korrigiert um den durch
die Hefe zugeführten reduzierenden Zucker, stellt das unfermentierbare durch die
F-nzymzubereitung synthetisierte Material dar. Die Ergebnisse werden als Gramm unfermentierbare
Zucker, svnthetisiert pro 100 g zugesetztes Maltosebydrat, berechnet.
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Weil die zwei Enzyme, Glucamylase und Transglucosidase, ihre Wirkung
auf das gleiche Substrat (Maltose) erstrecken, können die obigen Ergebnisse als
das `Verhältnis von Glucamylaseaktivität zu Transglucosidaseaktivität ausgedrückt
werden. Dieses Verhältnis wird erhalten durch Teilen der Gramm von unfermentierbaren,
pro 100 g Maltosehydrat synthetisierten Zuckern durch 100 minus diesem Wert.
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Es wurde gefunden, daß bei der enzymatischen Umwandlung von stärkehaltigen
Materialien unter praktischen Bedingungen die Menge an schließlich gebildeter Dextrose
durch dieses Verhältnis von Transglucosidaseaktivität zu Glucamvlaseaktivität bestimmt
wird. Es wurde weiter gefunden, daß alle geprüften Pilzenzymzubereitungen Transglucosidase-zu-Glucamy
lase-Verhältnisse zwischen etwa 0,2 und 0,1 entfalten. Diese Pilzenzymzubereitungen,
verwendet unter praktischen Bedingungen der Substratkonzentration,Menge an Enzym
und Konvertierungszeit, führen Teilhydrolysate von Stärke in Hy drolysate über,
welche zwischen 84 bis 900/, Dextrose enthalten, bezogen auf Trockensubstanzgehalt
des Hydrolysats.
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Die Nachteile bekannter Verfahren zur Herstellung von Dextrose unter
enzymatischer Hydrolyse von stärkehaltigen Stoffen sind vielfach. Um einen hohen
Konvertierungsgrad des stärkehaltigen Materials zu Dextrose zu erhalten, wurden
solche verdünnten Konzentrationen des stärkehaltigen Materials angewendet, daß die
Eindampfungskosten solche Verfahren unwirtschaftlich machten. Andere Verfahren verwendeten
hochgereinigte Enzymzubereitungen. In diesem Falle führten der Preis des Reinigens
der Enzymzubereitung und der Verlust an Enzymaktivität während der Reinigung zu
prohibitiven Kosten für die Enzymzubereitung.
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Durch die Erfindung werden diese Nachteile überwunden, weil dadurch
Transglucosidaseaktivität im wesentlichen vollständig aus Pilzamylase-Zubereitungen
entfernt werden kann, wodurch in beträchtlicher Weise das Transglucosidase-Glucamylase-Verhältnis
erniedrigt wird. Infolgedessen werden mit in dieser Weise behandelten Amylasezubereitungen
unerwartet hohe Ausbeuten an Dextrose erzielt, wenn sie zum Hydrolysieren von stärkehaltigem
Material unter praktischen Bedingungen benutzt werden. Enzymzubereitungen, welche
Stärkematerialien zu Hydrolysaten konvertieren, welche nur 85 bis 86 °/, Dextrose
(Trockenbasis) enthalten, werden nach der Behandlung mit einem Tonmaterial stärkehaltige
Materialien zu Hydrolysaten mit bis 93 bis 940J, Dextrose (Trockenbasis) konvertieren.
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Die Praxis des Behandelns von Enzymzubereitungen mit Tonmineralien
oder des Versuchs, Enzyme durch die Verwendung von Tonmineralien zu trennen, ist
nicht neu. Jedoch ist keins der bekannten Verfahren überhaupt auf das vorliegende
Problem, geschweige denn auf das Verfahren, es zu lösen, gerichtet gewesen. Die
bisherige Technik ist bei der Verwendung von Tonmineralien darauf gerichtet, fremdes
Protein zu entfernen, oder besteht in der Verwendung von Tonmineralien in Laborversuchen,
welche auf die Isolierung von reinen einzelnen Enzymen gerichtet sind. Keines der
bekannten Verfahren ist auf die Entfernung von Transglucosidase aus Amylasezubereitung
durch die Verwendung von Tonmineral gerichtet gewesen, noch enthält der Stand der
Technik einen Hinweis, daß Transglucosidase aus Amylasezubereitungen durch Behandlung
mit einem Tonmineral entfernt werden kann. Keins der bisherigen Verfahren ist auf
die Entfernung von Transglucosidase
aus Enzymzubereitungen als ein
Mittel des Vergrößerns der Dextroseausbeuten gerichtet, welche unter Verwendung
der Enzymzubereitung für die Hydrolyse von stärkehaltigem Material erhalten werden.
Jedenfalls ist kein früherer Fall bekannt, wobei Trausglucosidaseaktivität im wesentlichen
quantitativ aus Enzymzubereitungen ohne Verlust der gewünschten Enzymaktivität,
wie der Gluc .Amylase- oder x-Amylaseaktivität, entfernt worden wäre.
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Bei der Durchführung der Erfindung wird die Enzymzubereitung zuerst
durch Zusatz eines Tonminerals zu einer Lösunoder Suspension der Enzymzubereitung
behandelt. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise wird zuerst jeglicher unlösliche
feste, in der Suspension der Enzymzubereitung vorhandene Stoff entfernt. Die Enzymzubereitung
kann aus der ganzen Kulturflüssigkeit, wie sie aus der untergetauchten Kultur eines
Amylase erzeugenden Mikroorganismus erhalten wird, oder aus einer aus der untergetauchten
Kultur erhaltenen geklärten Flüssigkeit oder aus einer Suspension von einer getrockneten
oder teilgetrockneten Zubereitung, welche Kleie, Stärke oder verschiedene andere
beim Standardisieren der Amylasezubereitung verwendete Zusätze enthalten kann, oder
aus einer Lösung einer völlig löslichen Enzymzubereitung bestehen. Nach dem Zusatz
des Tonmaterials zu der Lösung oder Suspension der Enzymzubereitung wird die Mischung
gerührt und dann die feste und die flüssige Phase getrennt. Die Transglucosidaseaktivität
wird in der festen Phase zurückgehalten, während die gewünschten Carbohydrasen einschließlich
beispielsweise Gluc Amylase und .x-Amylase in der flüssigen Phase verbleiben.
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Die erhaltene flüssige Enzymzubereitung, in welcher die ursprüngliche
Aktivität der erwünschten Gluc-Amylase und x-Amylase verblieben ist, kann dann unmittelbar
für die Hydrolyse von stärkehaltigen Stoffen verwendet oder in bekannter Weise behandelt
werden, um eine feste Enzymzubereitung zu erhalten.
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Im allgemeinen kann jedes Tonmaterial für die Entfernung der Trans
glucosidaseaktivität verwendet «-erden. Die Tonmineralien als Gruppe werden als
»Tonerdesilikate« bezeichnet. Die Haupttonmineralien werden als Montmorillonit,
Attapulgit, Kaolinit, Illit, klassifiziert. Die Tonmineralien sind im wesentlichen
wasserhaltige Aluminiumsilikate, wobei Magnesium oder Eisen ganz oder teilweise
das Aluminium in einigen Mineralien vertreten und Alkalien oder Erdalkalien als
wesentliche Bestandteile in manchen anwesend sind. Einige werden ferner als Fullererde,
Floridin, Subbentonite, Feuerton, Porzellanerde und Kugelton bezeichnet. Sie können
in ihrer Zusammensetzung zwischen fast reinem Magnesiumsilikat bis fast reinem Aluminiumsilikat
liegen. Einzelheiten sind ersichtlich aus Blatt 204 American Colloid Company (1945);
Industrial Minerals and Rocks, Amer. Inst. Mining and Met. Eng. (1949 ed), und Clay
Mineralogy (R. E. Grim, McGra-,v-Hill (1953), S. 18, 19.
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Die Menge an bei der Behandlung des Enzyms verwendeten Tonminerals
hängt in gewissem Grad von der Art des verwendeten Minerals, der Menge an vorhandener
Transglucosidase und der Menge an vorhandenen Fremdstoffen ab. Für die meisten Enzymzubereitungen
sollte die Menge mindestens 0,5 g pro 100 ccm Enzymzubereitung betragen. Es besteht
keine obere Grenze, aber Verwendung von mehr als 5 g auf 100 ccm Enzymzubereitung
ist nicht vorteilhaft.
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Im allgemeinen sollte die Behandlung der Enzymzubereitung gemäß der
Erfindung bei einem pH-Wert ausgeführt werden, bei welchem das gewünschte Enzym
bL-ständig ist. Da einige der Tonmineralien den pH-Wert ändern können, kann eine
Einstellung des pH-Wertes notwendig werden. Bei Aspergillus-nigar-Kulturfiltraten,
wie sie noch in den Beispielen 1 bis 6 erwähnt werden, wird die Tonmineralbehandlung
vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 3,5 und 4,5 ausgeführt.
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Die Zeit der Behandlung mit dem Tonmineral ist nicht wesentlich, solange
der Ton in der Enzymzubereitung gut dispergiert ist.
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Bei der Ausführung der Stärkehydrolyse mit der erhaltenen Enzymzubereitung
wird gewöhnlich vorzugsweise zuerst die Stärke in bekannter Weise verdünnt, beispielsweise
durch saure Teilhydrolyse oder durch Verwendung eines flüssig machenden Enzyms,
wie z. B. einer Bakterien-.x-amylase. Die Konvertierung der verdünnten Stärke durch
die behandelte Enzymzubereitung sollte unter Bedingungen des p11-Werts und der Temperatur
ausgeführt werden, welche zur Bildung der gewünschten Produkte führen. Bei der Konvertierung
der verdünnten Stärke zu Dextrose sind pH-Werte zwischen 3,5 und 5,5 zufriedenstellend.
Wenn die Konvertierung vollständig ist, kann die Dextroseflüssigkeit in üblicher
Weise raffiniert, konzentriert und kristallisiert werden.
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Die Behandlung des Enzyms ist insbesondere vorteilhaft, wenn sie auf
ganze Kulturflüssikeiten oder Kulturflüssigkeitsfiltrate angewendet wird,' welche
au' untergetauchten aerobischen Kulturen mit Mikroorganismen der Asperbillusart
stammen. Diese Kulturflüssigkeiten sind eine sehr wirtschaftliche Quelle der gewünschten
Enzyme und können nach der Tonmineralbehandlunz unmittelbar benutzt werden, um stärkehaltige
Stoffe mit hohen Ausbeuten an Dextrose zu konvertieren, ohne daß umständliche oder
kostspielige Enzyrnreinigungsverfahren oder dünne Stärkekonzentrationen angewendet
werden müssen. Insbesondere ist es vorteilhaft, daß die Auswahl des Organismusstammes,
der Bestandteile des Mediums und der Wachstumsbedingungen auf der Basis von größter
Gluc-Amylaseerzeugung getroffen werden kann, unabhängig davon, wieviel Transglucosidaseaktivität
erzeugt wird.
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Aus der vorhergehenden Beschreibung und den nachfolgenden Beispielen
ergibt sich, daß eine erhebliche Verbesserung der Technik durch ein einfaches, wohlfeiles
und doch sehr wirksames Mittel gemacht wurde. Die Dextroseausbeute wird wesentlich
ohne zusätzliche Kosten und ohne komplizierte Arbeitsweisen erhöht.
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Die Erfindung soll noch durch die Beispiele weiter erläutert werden.
Beispiel 1 Eine Kultur von Aspergillus niger der Corn Products Refining Company,
Research and Development Department, Kultur-Nr. M-370, isoliert aus einem Bodenmuster
von Louisiana, wurde in einem Fermentor unter untergetauchten aerobischen Bedingungen
auf einem Medium gezüchtet, welches aus 14 °/o gemahlenem Mais und 10/,
Trockensubstanz
aus Maiseinweichwasser bestand. Nach Vollendung der Fermentation wurde die Flüssigkeit
zur Entfernung des Myzels und anderer suspendierter Stoffe filtriert. Das Filtrat
wurde in mehrere Teile eingeteilt.
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Zu 100 ccm Teilen des Kulturfiltrats wurden unter Rühren 5 g feinverteiltes
Tonmineral zugesetzt. Nach 30 Minuten Rühren wurde das Tonmineral abfiltriert. Die
erhaltenen Filtrate wurden auf Gluc .Amylase-, x-Amylase- und Transglucosidaseaktivität
geprüft. Es war keine Abnahme an Gluc-Amylaseaktivität vorhanden.
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Dieses Beispiel zeigt, daß Tonmineralien als eine Gruppe zur selektiven
Entfernung von Transglucosidaseaktivität ohne Entfernung merklicher Mengen an Gluc-Amylaseaktivität
wirksam sind. Obwohl die tonbehandelte Zubereitung einen geringeren Betra; an Transglucosidaseaktivität
je nach dem angewendeten Verfahren
zeigt, kann dieser Betrag oder
ein Teil davon eher auf unfermentierbaren Verunreinigungen in der Maltose als auf
wirklicher Transglucosidaseaktivität beruhen.
| Tabelle I |
| Enzymaktivität im Filtrat |
| Tonmineralien, am Tage der Hauptmineral- Behandlung Gluc-Amylase
Transglucosidase- |
| Anmeldung unter folgenden bestandteil Type von Ton Ehefiten
pro Gluc-Amylase- |
| \amen bekannt Kubikzentimeter Verhältnis |
| vor 1 nach vor ; nach |
| der Behandlung der Behandlung |
| 1. Volclay Bentonite Montmorillonit Quellbentonit keine 2,08
2,04 0,16 0,05 |
| 2. Panther Creek Montmorillonit nichtquellender keine 2,08
2,01 0,16 j 0,05 |
| Bentonit |
| 3. Adsorbol A-565 Montmorillonit - calciniert 2,08 2,04 0,16
0,05 |
| 4. Adsorbol A-46 Montmorillonit - imprägniert 2,08 i 1,89 0,16
I 0,03 |
| 5. Filtrol 105 Montmorillonit Subbentonit säureaktiviert 2,08
2,04 0,16 0,06 |
| 6. Pik-es Peak 9S77 Montmorillonit Fuller-Erde keine 2,08
1,91 0,16 0,05 |
| 7. Pikes Peak 9T77 Montmorillonit Fuller-Erde calciniert 2,08
1,93 0,16 i 0,07 |
| B. Florex XXF Floridin - keine 2,08 1,96 0,16 0,05 |
| 9. Calcined Floren XYF Floridin - calciniert 2,08 j 1,89 0,16
0,05 |
| 10. Attapulgus Clay Attapulgit Fuller-Erde keine 2,08 1,91
0,16 0,05 |
| 11. Bandy Tan Kaolinit Kugelton - 2,08 1,97 0,16 0,05 |
| 12. Illinois Fire Clay Kaolinit - - 2,08 1,98 0,16 0,13 |
| 13. Grundfite Illit - - 2,08 , 1,92 0,16 0,07 |
Beispiel 2 Die behandelten Filtrate von Beispiel 1 wurden benutzt, um ein Teilhy
drolysat von Stärke wie folgt zu konvertieren: Eine 35gewichtsprozentige Suspension
von Maisstärke wurde sauer auf ein Dextroseäquivalent (D. E.) von 16 hydrolysiert
(Dextroseäquivalent bezieht sich auf den reduzierenden Zuckergehalt des Hydrolysats,
berechnet als Dextrose und ausgedrückt als Gewichtsprozent vorhandener Trockensubstanz).
Die verdünnte Stärke wurde auf pH 4,5 eingestellt, auf 60°C gebracht und eine so
berechnete Menge an Enzymzubereitung zugesetzt, daß sie 14 Einheiten von Gluc-AmyIaseaktivität
pro 100 g verdünnter Stärke, Trockensiibstanz, enthielt. lach 72 Stunden Brutzeit
bei 60°C wurden die Flüssigkeiten auf D. E. und Dextrosegehalt analysiert mit dem
nachstehenden Ergebnis.
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Dieses Deispiel erläutert die Verbesserung, welche in Grad der Konvertierung
verdünnter Stärke zu Dextrose mit Aspergillus-niger-Kulturfiltraten nach Entfernur.-
dr Transglucosidaseaktivität durch Behandlung des Kulturfiltrats mit einem Tonmineral
erhalten werden.
| Tabelle II |
| Zusammensetzung der |
| mit Enzym |
| Tonmineralien konvertierten Flüssigkeit |
| ' Dextrose, |
| D.E. ° ja Trocken- |
| 1 Substanz |
| 4 |
| Nicht verwendet .......... 92,0 i 86,4 |
| Volcla-- Bentonite ......... 95,5 93,0 |
| Panther Creek ............ 95,7 93,3 |
| Adsorbol A-565 ........... 95,5 i 93,0 |
| Adsorbol A-46 ............ 96,2 94,2 |
| Filtrol 105................ 95,0 ! 92,1 |
| Pik-es Peak 9S77 . . . . . . . . . . 95,6 93,1 |
| Piken Peak 9T77 ......... 94,8 91,8 |
| Florex XXF .............. 95,5 93,0 |
| Calcined Florex XXF ...... 95,7 93,3 |
| Attapulgus Clay ........... 95,7 93,3 |
| Bands- Tau ............... 95,6 I 93,1 |
| Illinois Fire Clay .......... 92,9 88,7 |
| Grundfite ................. 94,9 92,0 |
Beispiel 3 Eine Kultur von Aspergillus niger M-370 wurde in einem Fermentor, wie
im Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Nach Vollendung der Fermentation wurde die
gesamte Kulturflüssigkeit aus dem Fermentor entfernt und in vier 100-ccm-Teile aufgeteilt.
Der erste Teil wurde in keiner Weise behandelt. Der zweite T eil wurde gerührt und
2,0 g Tonmineral »Volclay Bentonite« zugesetzt. Die das Pilzmyzel und Tonmineral
enthaltende Mischung wurde filtriert und der Filterkuchen verworfen. Der dritte
Teil wurde filtriert ohne Tonmineralbehandlung. Der vierte Teil wurde filtriert,
das Filtrat gerührt und 2,0g Tonmineral Wolclay Bentonite« zugesetzt. Die Suspension
wurde dann filtriert. Konvertierung einer 16-D.E.-verdünnten Stärke wurde, wie im
Beispie12 beschrieben, mit den vier Zubereitungen durchgeführt. Dieses Beispiel
erläutert die Anwendung der Erfindung auf unfiltrierte Kulturflüssigkeit.
| Tabelle III |
| Gluc- Zusammensetzung |
| Ton- Amylase- der enzym- |
| mineral- aktivität konvertierten |
| Filtration der behand- Einheiten Flüssigkeit |
| Kulturflüssigkeit Jung pro 'Dextrose, |
| Kubik- |
| D.E. '° |
| zentimeter ! Trocken- |
| basis |
| Unfiltriert ...... 0 2,30 91,1 84,7 |
| 2 2,24 95,3 92,3 |
| Filtriert ...... l 0 2,30 92,1 86,1 |
| 2 2,33 95,5 92,8 |
Beispiel 4 Dieses Beispiel erläutert die Wirkung der Verwendung verschiedener Mengen
von Tonmineral. Die verwendete Enzymzubereitung war ein Kulturfiltrat von einer
untergetauchten Kultur von Aspergillus niger 111-370. Die Tonmineralbehandlung des
Filtrats wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, ausgeführt.
| Tabelle IV |
| Menge des verwendeten Tonminerals, |
| Gramm pro 100 ccm Enzymzubereitung |
| Tonmineralien 5,0 1 2,0 J 1,0 1 0,5 1 0,2 1 0,0 |
| Dextrosegehalt der enzymkonvertierten |
| Flüssigkeit, °/a Trockenbasis |
| Volclay Bentonite 94,0 93,3 93,1 93,0 88,5 86,5 |
| Attapulgus Clay 93,3 92,0 92,1 - - - |
| Florex XXF ... 93,0 93,6 91,6 - - - |
| Panther Creek .. 93,3 93,6 89,1. 86,9. - - |
Beispiel 5 Dieses Beispiel zeigt die Wirkung des pH auf die Behandlung von Enzymen
mit Tonmineralien. Getrennte Teile eines Kulturfiltrats aus einer untergetauchten
Kultur von Aspergillus niger wurden mit Salzsäure oder mit Natriumhydroxyd auf die
unten angegebenen PH-Werte eingestellt. Zu jedem 100-ccm-Teil wurden 2,0 g Wolclay
Bentonite« zugesetzt. Die Gemische wurden 30 Minuten gerührt und filtriert. Die
Ergebnisse von mit den behandelten Enzymzubereitungen durchgeführten Konvertierungen
folgen:
| Tabelle V |
| pH-Wert vor dem Tonzusatz . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 5,0 4,5 i 4,0 3,0 ` 2,4 2,0 |
| pH-Wert des Filtrats nach der Behandlung . . . . . . . . .
. . 5,2 4,6 4,0 3,1 2,5 2,2 |
| Gluc-Amylaseaktivität des Filtrats, Einheit pro Kubik- |
| zentimeter ... . ..................................
2,17 2,24 2,33 1,76 1,03 0,62 |
| Zusammensetzung der enzymkonvertierten Flüssigkeit |
| D.E. ........................................... 92,5 95,0
95,5 95,6 95,3 94,8 |
| Dextrose,O/o Trockenbasis . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 87,9 92,1 93,0 93,2 , 92,7 91,9 |
Die Zusammensetzung von verdünnter Stärke nach der Hydrolyse mit der unbehandelten
Enzymzubereitung war 91,4 D.E., 85,9 °/o Dextrose, Trockenbasis.
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Beispiel 6 Dieses Beispiel zeigt die Anwendung der Erfindung auf andere
Stämme von Aspergillus niger und auf andere Vertreter der Aspergillus-niger-Gruppe.
Die verwendeten Enzymzubereitungen waren Kulturfiltrate, hergestellt durch untergetauchte
Fermentation, wie im Beispiel 1 beschrieben. Ein Teil jeder Kulturfiltratflüssigkeit
wurde mit 2,00/, »Volclay Bentonite«, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt.
Konvertierung der verdünnten Stärke wurde, wie im Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt.
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Die als NRRL 330 und NRRL 337 beschriebenen Kulturen waren erschöpfend
für die Gewinnung von Amylase untersucht worden (Tsuchiya u. a., Cereal Chem., 27,
S. 322 [1959]).
| Tabelle VI |
| Dextrosegehalt der |
| Gluc-Amylaseaktivität enzymkonvertierten |
| Einheiten pro Flüssigkeit, |
| Kultur Kubikzentimeter °/o Trockenbaiss |
| mit unbe- mit be- |
| vor nach handeltem I handeltem |
| Tonbehandlung Enzym |
| Aspergillus niger M-370 . . . . . . . . . . . . . . . 2,30
2,33 86,1 92,8 |
| Aspergillus niger NRRL 330 . . . . . . . . . . 1,85 2,20 86,3
92,7 |
| Aspergillus niger NRRL 337 . . . . . . . . . . 2,04 2,27 87,3
92,0 |
| Aspergillus phoenicis M-381 . . . . . . . . . . . 1,70 I 2,03
88,8 I 91,5 |
Beispiel 7 Technische Schimmelpilzenzymzubereitungen zur Verwendung bei der Verzuckerung
von Stärke werden üblicherweise erhalten durch Züchten eines Vertreters der Aspergillus-flavus-oryzae-Gruppe
der Aspergillusart auf feuchter Kleie. Die Kultur wird dann mit Wasser oder einer
wäßrigen Salzlösung ausgezogen. Das enzymaktive Material wird aus dem Extrakt durch
Zusatz eines wassermischbaren Lösungsmittels aus gefällt, der Niederschlag getrocknet
und dann mit einem inerten Bestandteil vermischt, um eine Standardaktivitätszubereitung
zu erhalten. Die Zubereitung wird in dieser Form vertrieben oder verwendet. Solche
Enzymzubereitungen wurden getrennt in Wasser suspendiert, auf pg 4,0 eingestellt
und filtriert. Zu 100 ccm jedes Filtrats wurden 5 g von Wolclay Bentonite« zugesetzt,
und nach 30 Minuten Rühren wurden die Suspensionen filtriert. Konvertierung verdünnter
Stärke wurde bei 50°C, p$ 4,6 bis 4,8, während 72 Stunden durchgeführt. Getrennte
Konvertierungen wurden mit behandelten und unbehandelten Enzymzubereitungen durchgeführt
unter Verwendung einer Menge an Enzymzubereitung äquivalent 14 -Gluc-Amylaseeinheiten
pro 100 g verdünnte Stärke, Trockensubstanz. Tabelle VII zeigt die Ergebnisse derAnwendung
der Erfindung auf verschiedene gereinigte feste Enzymzubereitungen. Die ursprünglichen
Zubereitungen wurden in Wasser vor der Verwendung wieder suspendiert.
| Tabelle VII |
| Gluc-Amylaseaktivität bei 50° C Dextrosegehalt der |
| Einheiten pro Gramm enzymkonvertierten |
| Enzymzubereitung Quelle der Enzymzubereitung Flüssigkeit, /o
Trockenbasis |
| mit mit |
| ursprüngliche nach der ursprünglicher tonbehandelter |
| Tonbehandlung Zubereitung |
| . Zubereitung |
| AW Enzyme Ba) ..... - 4,54 3,34 80,1 86,9 |
| Shozyme Sb) . .. . . . . . . Aspergillus flavus-oryzae 11,8
11,8 86,6 92,1 |
| Dextrinasea) . . . . . . . . . Aspergillus flavus-oryzae 15,0
14,7 87,7 91,3 |
| Diastase 32b) ......... - 53,3 51,4 90,8 91,9 |
| Mylase°) . . . . . . . . . . . . . Aspergillus flavus-oryzae
13,5 13,2 91,5 92,8 |
| a) Warenzeichen eines von der Firma Takamine Laboratories am
Tage der Anmeldung hergestellten Produkts. |
| b) Warenzeichen eines von der Firma Röhm & Haas Company
am Tage der Anmeldung hergestellten Produkts. |
| e) Warenzeichen eines von der Firma Wallerstein Company am
Tage der Anmeldung hergestellten Produkts. |