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Verfahren zum Reinigen einer Amyloglukosidaseenzym enthaltenden Zubereitung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Reinigen einer Amyloglukosndaseenzym
enthaltenden Zubereitung für das Verzuckern von stärkehaltigen Stoffen und ihren
Abbauprodukten.
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Es ist bekannt, Enzyme durch Adsorption zu reinigen, indem man die
schwach angesäuerte Lösung des Enzyms mit einer Suspension des Adsorbens [Al(OH)3,
Calciumphosphatgel, Bentonit, Silikagel u. a.] versetzt und das Gemisch nach kurzer
Zeit zentrifugiert; die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das Enzym dann
in schwach alkalischem Medium mit einem geeigneten Solvent eluiert. Dabei sind aber
Adsorption und Elution zwei sehr verlustreiche Verfahrensschritte.
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Außerdem ist es bekannt, daß Amylase durch Stoffe wie Bentonit absorbiert
wird.
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Überraschend wurde nun gefunden, daß wasserhaltiges, unlösliches synthetisches
Magnesiumsilikat in sehr wirksamer Weise durch Adsorption aus rohen Pilzkulturflüssigkeiten
Enzyme, insbesondere Transglukosidase, und andere Verunreinigungen entfernt, welche
'die enzymatische Erzeugung von Dextrose aus Stärke beeinträchtigen, aber nicht
das gewünschte Dextrose erzeugende Enzym, Amyloglukosidase, beseitigt.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bleibt das gewünschte Enzym in
Lösung und wird nicht wie bei den bekannten Verfahren adsorbiert.
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Demgemäß unterscheidet sich das Verfahren nach der Erfindung von den
bekannten Reinigungsverfahren vor allem vorteilhaft dadurch, daß eine wäßrige Lösung
einer Amyloglukosidaseenzym enthaltenden Zubereitung mit etwa 2 bis etwa 5%. eines
wasserunlöslichen, wasserhaltigen synthetischen Magnesiumsilikats bei einem pE[
von etwa 3,8 bis etwa 4,5 behandelt, die Mischung geschleudert und die flüssige,
die Amyloglukosidase enthaltende Phase gewonnen wird.
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Mit dem erfindungsgemäß gereinigten Produkt erhält man durch enzymatische
Hydrolyse von Stärke oder Stärkeprodukten Stärkehydrolysate, welche wesentlich weniger
unerwünschte Bestandteile oder Verunreinigungen enthalten, welche das Raffinieren
erschweren, als in durch bekannte enzymatische Verfahren erhaltenen Stärkehydrolysaten
vorhanden sind, und ferner in weiter fortgeschrittenen Hydrolysen größere mögliche
Dextroseausbeuten in der Hydrolysaten und größere wirkliche Dextroseausbeuten, wenn
die Hydrolysate raffiniert, konzentriert und kristallisiert werden und die kristallisierte
Dextrose von den Mutterlaugen abgetrennt wird, als sie aus nach bekannten Verfahren
erhaltenen Hydrolys-aten gewonnen werden. Demgemäß ist ein besonderes Ziel der Erfindung,
ein technisches Verfahren zur Herstellung kristalliner Dextrose durch enzymatische
Hydrolyse zu schaffen, welches eine höhere Ausbeute an dem Zucker ergibt als bei
den bekannten Verfahren erhalten wird. Andere Ziele werden sich aus dem Folgenden
ergeben: , Die Existenz eines Enzyms, welches Stärkemoleküle oder sauer konvertierte
Stärkemoleküle unmittelbar zu dem Monomer, Dextrose, hydrolysieren würde, ist schon
seit mindestens 15 fahren erkannt worden.
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Schon 1941 betonten K e r r und S c h i n k (Ind. Chem.33, S.1418
[1941], und später 34, S.1232 [1942]) die Anwesenheit einer a-Glukosidase in gewissen
Pilzextrakten, welche Dextroseeinheiten unmittelbar aus den langen Polysaccharidmolekülen
in mit Säure vörhydrolysierter Säure abzuspalten schien, und daß keine Grenze der
Wirkung nahezu bis zur völligen Hydrolyse zu Dextrose zu bestehen schien. Obgleich
ihren Ergebnissen nicht allgemein zugestimmt wurde, ist diese Ansicht jetzt angenommen.
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In der Zwischenzeit hat dieses hypothetische Enzym verschiedene Namen
durch verschiedene Forscher erhalten. Es wurde a-Glukosidase, Amyloglukosidase,
Glukamylase, Stärkeglukogenase und Maltase genannt. Der letztere Name wurde durch
einige sehr frühe Forscher unter der Annahme, welche sich jetzt als irrtümlich erwiesen
hat, verwendet, daß das Enzym,
welches Glukose unmittelbar aus Stärkeerzeugt;
nicht von einem früher bekannten, Maltase genannten Enzym verschieden wäre, welches
Dextrose aus Malfose erzeugt, aber ein spezifisches Substrat für das Disaccharid
ist. Im folgenden wird dieses stärkehydrolysierende Enzym als Amyloglukosidase bezeichnet.
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Dieses Enzym kommt in wäßrigen Extrakten oder Kulturfiltraten von
Mikroorganismen, insbesondere Pilzen, vor. Gewisse Stämme von Aspergillus niger
beispielsweise sind eine sehr gute Quelle. Naturgemäß treten auch andere Enzyme
aus den lebenden Zellen in diesen Extrakten auf, und Trennung der Amyloglukosidase
sogar von anderen Carbohydrasen, beispielsweise a-Amylasen, Transglukosidasen und
Grenzdextrinen, hat bisher ein unüberwindbares Problem :dargestellt. Tatsächlich
ist Amyloglukosidase eine von sehr wenigen verbleibenden Carbohydrasen, welche bis
jetzt noch nicht in einer genügend reinen Form abgetrennt wurde, um kristallisiert
zu werden.
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Trotz der optimistischen Voraussagen von einigen früheren Forschern
auf diesem Gebiet, daß keine Grenze der Hydrolyse von Stärke bis zur fast völligen
Hydrolyse zu Dextrose sein würde und daß ein enzymatisches Dextroseverfahren erheblich
der üblichen sauren Hydrolyse in bezug auf Dextrosezuckerausbeute und hinsichtlich
des Raffinierens überlegen wäre, beweisen die Zahlen aus den bisherigen Verfahren
zur enzymatischen Dextrosegewinnung, daß diese Hoffnungen sich noch nicht erfüllt
hatten. Es schienen Probleme bei dem enzymatischen Verfahren analog der sauren Hydrolyse
vorzuliegen.
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Probleme bei dem üblichen Säureverfahren sind von K e r r (Chemistry
and Industry of Starch, 2. Auflage, Chapter XIV) dargestellt worden. So besteht
bei der sauren Hydrolyse das Problem unvollständiger Hydrolyse infolge der größeren
Widerstandsfähigkeit der anomalen 1,6-a-Glukosidbindungen in der Stärke gegenüber
der Hydrolyse. Weiterhin tritt die synthetische Reaktion oder Umkehr auf, veranlaßt
durch Säure, wodurch Dextrose oder niedere Zucker sich zu säurebeständigeren Dimeren
oder Polymeren wieder verbinden. Diese zwei Umstände setzen nicht nur erheblich
die mögliche Dextroseausbeute in dem Hydrolysat herab, sondern verringern auch stark
bei der Kristallisation und Abtrennung von Dextrose aus diesen Hydrolysaten die
tatsächliche Ausbeute des erhaltenen Zuckers (Chem. and Ind. öf Starch, S. 385).
Wenn Stärke durch Pilzextrakte hydrolysiert wird, zeigt eine Untersuchung der Hydrolysate
die Anwesenheit von erheblichen Mengen von Dimeren und Polymeren von Dextrose mit
anomalen Bindungen, was entweder unvollständige Hydrolyse oder synthetische Wirkung
oder beides anzeigt.
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Bei der sauren Hydrolyse gibt es auch zersetzende Reaktionen, in welchen
Protein oder stickstoffhaltige Verunreinigungen eineRolle spielen. DieseReaktiörien
und die Anwesenheit von Salzen vermehren die Schwierigkeit des Raffinierens des
Hydrolysats und tragen zu verringerten Ausbeuten an fertigem Zucker bei. Selbstverständlich,
wenn fremdes Protein und Salze absichtlich zu Stärkeflüssigkeiten in Form von Pilzextrakten
oder Kulturfiltraten zugefügt werden, ist es nicht überraschend, daß die erwähnten
Probleme hinsichtlich des Raffinierens bei den bekannten enzymatischen Verfahren
erschwert und weiter verringerte Dextroseausbeuten erhalten werden.
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Verschiedene USA.-Patente sind in der letzten Zeit auf verbesserte
Verfahren der Hydrolyse von Stärke mit Enzymen erteilt worden: 2 305 168, 2 53199ß,
2 583 451, 2 717 852. Wenn die bisher bekannten enzymatischenDextroseverfahren zur
Hydrolyse von Stärke oder Stärkeprodukten angewendet werden, werden Hydrolysate
erhalten, welche nicht mehr als etwa 850/a Dextrose (Trockenbasis), selbst unter
besten Arbeitsbedingungen, enthalten. Ferner zeigt dieAmylase dieser Hydrolysate
auf Gesamtzucker oder reduzierende Stoffe nach der bekannten von L a n e und E y
n o n modifizierten Fehlings-Prüfung und Berechnung der Ergebnisse als Dextroseäquivalent
(D. E.), daß zusätzliche 5 0/0 oder mehr von Nichtdextrosezuckern anwesend sind
und ein Rest an höheren Polysacchariden und Nichtkohlehydratverunreinigungen auf
gesamt 100% vorhanden ist.
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Wenn dieseHydrolysate durchLeitenüberKnochenkohle, Filtration und
Konzentration raffiniert und durch die üblichen Verfahren der Technik kristallisiert
werden, werden keine höheren Ausbeuten an kristalliner Dextrose als etwa 60% (Trockenbasis)
erhalten. Dies ist im wesentlichen die gleiche Ausbeute, wie sie bei der alten Säurekonvertierung
von Stärke unter Anwendung vergleichbarer Raffinierungs- und Kristallisierungsverfahren
erhalten wird. In beiden Fällen haben die in den Hydrolysaten vorhandenen, nicht
aus Dextrose bestehenden festen Stoffe die Kristallisation von etwa 25 bis 30%Dextrose,
berechnet auf Trockenbasis, verhindert, welche bekanntlich in dem Hydrolysat noch
anwesend sind.
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Wenn die Mutterlaugen aus den enzymatischen Verfahren wieder konzentriert
und wieder kristallisiert werden, kann eine Ausbeute an zweitgradigem Zucker bis
zu etwa 200/0 (Trockenbasis) aus den ursprünglichen in den Hydrolysaten vorhandenen
festen Stoffen erzielt werden. Somit wird eine Gesamtausbeute an Zucker von etwa
800% erhalten. Wenn die Mutterlaugen aus dem sauren Konvertierungsverfahren raffiniert,
wieder durch Säure hydrolysiert, konzentriert und kristallisiert werden, kann auch
eine zusätzliche Ausbeute an zweitgradigem Zucker bis zu 200% erhalten werden, was
auch eine Gesamtausbeute von 80% an erst- und zweitgradigem Zucker ergeben würde.
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Selbstverständlich können die Rekonvertierungen, weiteres Raffinieren
und Rekristallisieren viele Male wiederholt werden, um die Ausbeute über 80% bei
sowohl dem sauren wie dem enzymatischen Verfahren zu erhöhen, aber die anteiligen
Kosten wachsen mit jeder Wiederholung.
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Aus einer kritischen Prüfung -des Standes der Technik ist augenscheinlich,
daß die Bearbeiter glaubten, daß die enttäuschend niedrige Dextroseausbeute, wie
sie bei Stärkehydrolysaten aus der enzymatischen Konvertierung gefunden wurde, und
daß die nicht höheren tatsächlichen Ausbeuten an kristallinem Pro-Bukt als bei vergleichbaren
saurenHydrolyseverfahren entweder auf einem oder auf einer Kombination von zwei
oder mehreren der folgenden Umstände beruhen würden 1. daß das Dextrose erzeugende
Enzym an sich unfähig wäre, die Konvertierung bis auf einen beliebig höheren Grad
durchzuführen, das ist, daß eine Grenzkonvertierung analog der mit dem Maltose erzeugenden
Enzym, ,B-Amylase, vorhanden wäre, 2. daß die Grenzkonvertierung mit der Glukosidasequelle
schwanken würde und daß höhere Dextroseausbeuten möglicherweise durch Auffindung
eines Pilzextraktes mit einer höheren Konvertierungsgrenze erhalten würden,
3.
daß das Dextrose erzeugende Enzym ein Maltasesubstrat, spezifisch für Maltose oder
niedere Polysaccharide wäre und demgemäß die Dextroseausbeute aus Stärke völlig
von der Anwesenheit anderer Enzyme in dem Pilzextrakt abhängig wäre, von welchen
bekannt war, daß sie Maltose erzeugen, z. B. a-Amylasen, 4. .daß wegen notwendigerweise
in der Praxis aus wirtschaftlichen Gründen angewendeter Bedingunden oder aus dem
einen oder anderen Grund in einer oder mehreren Stufen des Herstellungsverfahrens
von Dextrose keine höheren Dextroseausbeuten erhalten werden könnten als die tatsächlich
gefundenen; dabei erwogene Bedingungen waren beispielsweise Konzentration der Stärke
oder des Stärkeprodukts, welche für die Hydrolyse durch das Enzym verwendet wurden,
der Grad oder die Weise, in welcher die Stärke vor der Enzymhydrolyse vorbehandelt
wurde, wie z. B. mit Säure, ,der pH-Wert, Temperatur und andere Variablen der Enzymhydrolyse
und die Weise, in welcher die Fermentation zur Gewinnung des Pilzextraktes durchgeführt
wurde, 5. daß, obwohl eine Funktion des Amyloglukosidasemoleküle sei, Stärke zu
Dextrose zu hydrolysieren, diese Wirkung wie eine Transferase wäre und demgemäß
von diesem gleichen Enzymmolekül Entfaltung von Transglukosidaseaktivität als eine
Nebenfunktion erwartet werden könnte, von welcher Verringerung der Dextroseausbeute
angenommen werden.
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Jede beliebige und alle diese und ähnliche Theorien stehen im auffallenden
Gegensatz zu der vorliegenden Erfindung.
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Es wurde gefunden, daß das Amyloglukosidasemolekül nicht nur eine
Funktion besitzt, nämlich die Bindungen von Stärkemolekülen so zu hydrolysieren,
um Dextrose zu erzeugen, und daß alle anderen in Pilzextrakten vorhandenen Enzyme
(oder alle andere enzymatische Aktivität) von diesem Amyloglukosidasemolekül abgetrennt
werden können. Es wurde weiter gefunden, daß Amyloglukosidase die nicht rudzierenden
Enden von Stärkemolekülen angreift, Dextrose unmittelbar von diesen Enden abspaltet
und so längs des Stärkemoleküls fortfährt, bis es im wesentlichen vollständig zu
Dextrose hydrolysiert ist. Niedrige Ausbeuten in durch Verwendung von rohen Amyloglukosidase
enthaltenden Pilzextrakten erhaltenen Stärkehydrolysaten sind demgemäß auf andere
störende Enzyme einschließlich Transglukosidasen, welche andere Endprodukte als
Dextrose ergeben, zurückzuführen. Wenn Stärke oder Stärkeprodukte mit gereinigten
Extrakten hydrolysiert werden, welche nur Amyloglukosidaseaktivität enthalten und
Ausbeuten bis zu etwa 100% erhalten werden und so gewonnene Hydrolysate immer noch
gewisse Raffinierprobleme darbieten, so beruht dies vor allem auf fremdem Protein
und Salzen, welche mit dem gereinigten Extrakt zugeführt werden und gegebenenfalls
einen Teil des Hydrolysats bilden.
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Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Reinigen von Amyloglukosidase
enthaltender Zubereitung, wonach eine wäßrige Lösung dieser Zubereitung mit etwa
2 bis etwa 5% eines wasserunlöslichen, wasserhaltigen synthetischen Magnesiumsilikats
bei einem pH-Wert von etwa 3,8 bis etwa 4,5 behandelt, die Mischung zentrifugiert
und die flüssige, die Amyloglukosidase enthaltende Phase gewonnen wird. Die Erfindung
schafft ferner ein Verfahren zur Herstelliuig von Dextrose aus Stärke, wobei die
Stärke in wäßrigem System mit einer Amyloglukosidase enthaltenden Enzymzubereitung
zu einem maximalen D. E. und wahren Dextrosegehalt hydrolysiert, das Hydrolysat
geklärt, durch Verdampfen konzentriert und kristallisieren gelassen und die kristallisierte
Dextrose von der- Mutterlauge abgetrennt wird, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet
ist, daß die Stärke mit einer Amyloglukosidase enthaltenden Enzymzubereitung hydrolysiert
wird, welche durch das eben erwähnten Verfahren gereinigt wurde. Diese Hydrolyse
führt zu einem schließlichen Hydrolysat, welche maximale D. E.-Werte von etwa 95
bis 96% und maximale wahre Dextrosegehalte von etwa 93 bis 94% Trockenbasis besitzt.
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Im besonderen schafft die Erfindung ein verbessertes, praktisches
enzymatisches Verfahren zur Gewinnung von Dextrose in außergewöhnlich hoher Ausbeute
aus Stärke und Stärkeprodukten, wobei eine Amyloglukosidase enthaltende Zubereitung
verwendet wird, welche vorbehandelt wurde zu ihrer Reinigung von störenden Enzymen
einschließlich beispielsweise Transglukosidase, welche zur Erzeugung anderer Zucker
als Dextrose wirkt. Vorzugsweise sollte auch die Amyloglukosidase von fremdem Protein
und Salzen gereinigt werden, welche, wenn sie ein Teil der Hydrolysatflüssigkeit
werden, die Schwierigkeit des Raffinierens dieser Flüssigkeiten zwecks schließlicher
Erzeugung reinen kristallinen Zuckers (Dextrose) vergrößern.
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Es ist bevorzugt, obwohl nicht notwendig, zuerst jegliche unlöslichen,
festen, in der Suspension der Enzymzubereitung vorhandenen Stoffe zu entfernen.
Die Enzymzubereitung kann aus der ganzen Kulturflüssigkeit aus untergetauchtem Wachstum
eines Amylase erzeugenden Mikroorganismus oder aus der aus der untergetauchten Kultur
erhaltenen geklärten Flüssigkeit oder aus einer Suspension einer ganz oder teilweise
getrockneten Zubereitung, welche Kleie, Stärke oder verschiedene andere zum Standardisieren
der Amylasezubereitung benutzten Zusätze enthält, oder aus einer Lösung von völlig
löslicher Enzymzubereitung bestehen. Im allgemeinen sollte die Behandlung der Enzymzubereitung
bei einem p$ ausgeführt werden, bei welchem das gewünschte Enzym beständig ist,
das -ist bei einem sauren pH. Weil das synthetische Magnesiumsilikat das p$ nach
der alkalischen Seite verändert, ist erwünscht, das p$ nach der sauren Seite einzustellen
und dann die Behandlung unter sauren Bedingungen durchzuführen. Im Anschluß an den
Zusatz des Absorbierungsmittels zu und Einstellung des pH-Wertes der Lösung oder
Suspension der Enzymzubereitung wird die Mischung gerührt, und dann werden die feste
und flüssige Phase voneinander getrennt. Die Transglukosidaseaktivität der Kulturflüssigkeit,
fremdes Protein, färbende Stoffe und andere Verunreinigungen werden in der festen
Phase zurückgehalten, während die gewünschte Carbohydrase, insbesondere Amyloglukosidase,
in der flüssigen Phase verbleibt.
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Im allgemeinen wurde gefunden, daß die meisten rohen Pilzextrakte
in sehr wirksamer Weise in bezug auf die Amyloglukosidase gereinigt werden, wenn
von etwa 2 bis etwa 5 Gewichtsprozent pro Volumen an dem Absorbierungsmittel zu
den rohen Flüssigkeiten zugesetzt und diese Flüssigkeiten auf einem pH-Wert von
etwa 3,8 bis etwa 4,5 während der Behandlung gehalten werden. Geringere Anteile
an dem Magnesiumsilikat-Absorbierungsmittel entfernen üblicherweise
nicht
alleEnzyme, welche dieDextroseausbeuten während der enzymatischen Hydrolyse von
Stärke herabsetzen, und größere Anteile können durch einfache mechanische Absorption
merkliche Mengen des gewünschten Enzyms Amyloglukosidase beseitigen. Bevorzugte
Behandlungstemperaturen sind von etwa 5 bis etwa 30° C und bevorzugte Behandlungszeiten
von etwa 30 bis etwa 60 Minuten.
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Amyloglukosidase-Aktivitätseinheiten werden wie folgt bestimmt: Das
Substrat ist ein 15 bis 18 D. E. saures Hydrolysat von Maisstärke, gelöst in Wasser
und auf 4,0 g Trockensubstanz pro 100 ccm Lösung verdünnt. Genau 50 ccm Lösung werden
in eine 100 ccm volumetrische Flasche pipettiert. Zu der Flasche werden 5 ccm von
1,Omolarem Natriumacetat-Essigsäurepuffer, p$ 4,3, zugesetzt. Die Flasche wird in
ein Wasserbad bei 60° C gebracht, und nach 10 Minuten wird die genaue Menge an Enzymzubereitung
zugesetzt. Genau 120 Minuten nach dem Zusatz der Enzymzubereitung wird die Lösung
auf einen Phenolphthalein-Endpunkt mit 1 n-Natriumhydroxyd eingestellt. Die Lösung
wird dann auf Raumtemperatur gekühlt und auf das Volumen verdünnt. Ein reduzierender
Zuckerwert, berechnet als Dextrose, wird an dem verdünnten Muster und an einem Kontrollmuster
mit keiner zugesetzten Enzymzubereitung bestimmt.
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Amyloglukosidase-Aktivität wird dann wie folgt berechnet
worin A = Amyloglukosidase-Aktivitätseinheiten pro ccm oder pro g Enzymzubereitung,
S = reduzierende Zucker im durch Enzym konvertiertem Muster, g%100 ccm, B = reduzierende
Zucker in dem Kontrollmuster g/100 cmm, E = Menge an angewandter Enzymzubereitung
ccm oder g bedeutet. Die reduzierende Zuckerkonzentration in dem enzymkonvertierten
Muster sollte nicht mehr als 1,0 g/ 100 ccm sein.
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Alle Variationen von Stärke oder Stärkeprodukten und stärkehaltigen
Stoffen können bei dem neuen Amyloglukosi-dase-Hydrolyse verwendenden Verfahren
benutzt werden. Vorzugsweise jedoch sollte für Dextrosezuckergewinnung eine reine
Stärke verwendet werden, vorzugsweise aus wirtschaftlichen Gründen eine reine Stärke,
welche schon durch ein Mittel teilweise hydrolysiert oder konvertiert ist, um so
die sehr hohe Viskosität nativer Stärke zu verringern, wenn sie in Wasser suspendiert
oder gelöst ist. Verringerung der Viskosität erleichtert die Verwendung von Stärkesubstanz
mit höheren Gehalten an festen Stoffen bei der Amyloglukosidase-Hydrolyse. Vorbehandlung
der Stärke kann in beliebiger Weise nach bekannten Verfahren erfolgen, z. B. durch
vorhergehende Stärkehydrolysen, Vorbehandlung mit einer gereinigten a-Amylase; welche
sehr stark mindestens in den Anfangsphasen der Hydrolyse in gleicher Weise wie Säure
auf Stärke einwirkt, oder Vorbehandlung durch physikalische Mittel, wie das Schicken
der Paste durch einen Votator oder Homogenisator. Die Vorbehandlung kann eine Kombination
von zwei oder mehr Verfahren sein, beispielsweise Behandlung mit Säure unter Druck
oder mit einer a-Amylase, kombiniert mit dem Durchgang durch einen Votator. In jedem
Fall sollte die Vorbehandlung geeignet sein., um die Viskosität des Substrats bis
zu einem Grad zu verringern, daß bearbeitbare Flüssigkeiten mit einer Konzentration
an festen Stoffen von 25 bis 5o- Gewichtsprozent erhalten werden und vorzugsweise
mit etwa 350/0 festen Stoffen, wenn die Temperatur der Flüssigkeit zwischen 45 und
60° C ist. jedoch sollte diese Vorbehandlung nicht über den erwähnten Grad hinaus
erstreckt werden, .denn sonst können einige unerwünschte Merkmale der bei der Vorbehandlung
angewendeten Hydrolyse oder Konvertierung die Ergebnisse überlagern, welche bei
der nachfolgenden Amyloglukosidase-Hydrolyse erhalten werden.
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Somit wird beispielsweise bei einer bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung Stärke mit sehr verdünnter Säure unter Druck in der üblichen Weise konvertiert,
wobei ein Stärkesirup hergestellt und der Sirup bei etwa 33% Konzentration an festen
Stoffen zu Dextrose mit gereinigter Amyloglukosidase hydrolysiert wird. Wenn die
Stärke so in vergleichsweise dünnen Dispersionen bis zu einem Grad von etwa 10 bis
20 D. E. konvertiert ist, kann das Produkt der Amyloglukosidase-Hydrolyse bei der
bevorzugten Konzentration unterworfen werden und Hydrolyse mit einem Dextrosegehalt
in dem außergewöhnlich hohen Bereich von 90 bis 98% Trockenbasis erhalten werden.
Wenn jedoch die Säurebehandlung wesentlich ausgedehnter ist, dann wird, obwohl sogar
konzentriertereLösungen angewendet werden können, nichtsdestoweniger die Amyloglukosi,dase-Hydrolyse
nicht so vollständig verlaufen erscheinen, weil die Säure eine gewisse Menge von
enzymwiderstandsfähigen Reversionsprodukten in den fortgeschritteneren Phasen der
Säurebehandlung erzeugt hat.
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jedenfalls sollte das Säuresubstrat in Wasser dispergiert und die
Lösung auf einen Säuregrad eingestellt und die Temperatur so ausgewählt werden,
daß die Amyloglukosidase die Hydrolyse in kürzester Zeit und mit bester Wirtschaftlichkeit
in bezug auf die Menge an angewendetem Enzym vollenden kann. Säuregrad und Temperatur
sind voneinander abhängige Variablen. Calcinierte Soda, Natriumhydroxyd u. dgl.
sind geeignete alkalische Stoffe, und Salzsäure ist eine geeignete Säure, um diese
Einstellungen des pH-Wertes der Flüssigkeiten für die Amyloglukosi-dase-Hydrolysen
herbeizuführen.
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Die beste Temperatur für die Hydrolyse bei einer Amy loglukosidase
liegt zwischen 35 und 60° C, obwohl die beste Temperatur von einem pH-Wert abhängig
ist, wie es mit vielen anderen Enzymen der Fall ist. Dementsprechend ist der beste
PH-Wert-Bereich, welcher im allgemeinen zwischen 4 und 6,5 liegt, von der Temperatur
abhängig. Im allgemeinen werden beste Hydrolysegeschwindigkeiten für reine Amyloglukosidase
im unteren p],-Wert-Bereich von 4 bis 5 erreicht, wenn die angewendete Temperatur
im unteren Bereich von 35 bis 45° C liegt, und wenn die Temperatur erhöht wird,
werden beste Geschwindigkeiten durch Erhöhen des pH Wertes in entsprechender Weise
erzielt.
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Bei der Hydrolyse von, Stärke oder Stärkeprodukten mit Amyloglukosi.dase
zur Gewinnung von Dextrose wird eine weitere Beschränkung in. bezug auf den PH-Wert
und und die Temperatur auferlegt wegen der nachlassenden Beständigkeit des Produkts
Dextrose bei höheren px Werten und höheren Temperaturen. Demgemäß sind bei Ausführung
der Lehre dieser Erfindung die bevorzugten Arbeitsbereiche zur Hydrolyse mit Amyloglukosidase
ein pH-Wert von 4,0 bis 4,8 und eine Temperatur von 45 bis 60° C.
Die
Länge der Zeit für die Stärkehydrolyse hängt von verschiedenen Betriebsvariablen
ab. Am wichtigsten von diesen sind Verhältnis von Amyloglukosidase zu Substrat,
Vorbehandlung der Stärke, Zusatz von unterstützenden Enzymen, angewendete Temperaturen
und pH-Werte und .die Substratkonzentration. Jedoch und in jedem Fall kann die Hydrolyse
in der Praxis durch bekannte analytische Bestimmungen verfolgt werden, wie z. B.
das Sichert-Bleyer-Verfahren für die Bestimmung von Dextrose, und die Hydrolyse
wird fortgesetzt, bis es durch Analyse augenscheinlich ist, daß die Wirkung ':der
Amyloglukosidase im wesentlichen unter den gewählten Arbeitsbedingungen vollendet
ist, d. h. bis die Konzentration von Dextrose in dem Hydrolysat ein Optimum erreicht
hat. Im allgemeinen wird ein praktisches Optimum vorhanden sein, wenn die löslichen
festen Stoffe in dem Hydrolysat durch Analyse zu 90 bis 98% Dextrose auf Trockenbasis
gefunden werden. Die erforderliche Länge der Zeit, um zu diesem Optimum zu gelangen,
wird zwischen etwa 10 und 90 Stunden, in Abhängigkeit von den Betriebsbedingungen,
wie sie im vorstehenden erörtert wurden, schwanken. Ein zweckmäßiger Arbeitsbereich
für den Zusatz an gereinigter Amyloglukosidase ist etwa 10 bis 20 Amyloglukosi@dase-Aktivitätseinheiten
auf 100 g Stärkesubstrat oder etwa 90 bis 180 Einheiten pro kg Stärke.
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Im Anschluß an die Hydrolysestufe des Verfahrens wird das Hydrolysat
raffiniert, konzentriert, kristallisiert und zentrifugiert, um die kristalline Dextrose
in reiner Form zu gewinnen unter Verwendung von in der Glukose-Raffimerungsindustrie
bekannten Anlagen und allgemeinen Verfahren, wobei zu bedenken ist, daß die gemäß
der Erfindung erzeugten Hydrolysate niedrigere Konzentrationen an färbenden Stoffen,
Elektrolyten und anderen Verunzeinigungen und dementsprechend höhere Konzentrationen
an Dextrose aufweisen und gereinigte Hydrolysatflüssigkeiten darstellen, welche
leichter und vollständiger als die bisher bekannten Hydrolysate kristallisieren.
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Die Erfindungsoll an den folgenden Beispielen erläutert werden, welche
typisch und unterrichtend, aber nicht beschränkend sind.
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Beispiel 1 Eine Probe von roher A.-niger-Kulturflüssigkeit wurde zu
einer wäßrigen Lösung von sauer konvertierter Maisstärke mit einem D. E. von 17%,
Trockenbasis, einem pH von 4,0 und einem Gehalt an festen Stoffen von 35 Gewichtsprozent
zugesetzt. Der Anteil der rohen Kulturflüssigkeit zu den festen Stoffen im Hydrolysat
war 10 ccm/100 g. Jedes ccm enthielt 1,5 Amyloglukosidase-Aktivitätseinheiten. Die
enzymatische Hydrolyse wurde- während 72 Stunden bei 60' C vonanschreiten
gelassen. Die Flüssigkeit wurde dann filtriert und analysiert. Die Ergebnisse folgen
in der Tabelle.
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Eine andere Probe der erwähnten rohen A.-niger-Kulturflüssigkeit wurde
durch Zusatz eines synthetischen, wasserunlöslichen Magnes-iumsilikats, verkauft
durch die Westvaco Chlor-Alkali Division der Food. and Machinery Chemical Corporation,
behandelt: Das Adsorbierungsmittel wurde in einem Anteil von 4 g auf 100 ccm mit
ausreichender Salzsäure zugesetzt, um ein pg von 4,0 bis 4,5 während der Behandlung
aufrechtzuerhalten. Die Mischung wurde dann bei Raumtemperatur etwa 1 Stunde gerührt
und filtriert.
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Das Filtrat wurde zu einer Probe des erwähnten Stärkehydrolysats in
einer Menge von 10 ccm Filtrat zu 100g festen Stoffen des Hydrolysats zugegeben.
Jedes ccm enthielt 1,5 Amyloglukoisidase-Aktivitätseinheften. Die Hydrolyse wurde
72 Stunden bei
60' C voranschreiten gelassen. Die Flüssigkeit wurde dann
filtriert und analysiert. Die Ergebnisse folgen auch in der Tabelle.
| Konzentration Tatsächliche***) |
| . |
| der festen Stoffe D. E. ** |
| OptisdieDidite*) ) Dextrose |
| Hydrolysat aus im Hydrolysat % Trocken- o |
| rocken- |
| in Gewichts- bei Ä=39 me. bass /o T basis |
| prozent |
| roher A.-niger-Flüssigkeit ...................... 35,56 0,208
90,2 84,0 |
| roher A.-niger-Flüssigkeit, mit dem Adsorptions- |
| mittel behandelt .............................. 35,50 0,126
95,2 92,7 |
| *) Verwendung eines Coleman-Modells 14-Spektrophotometer, |
| **) nach der modifizierten Fehlingschen Prüfung, |
| ***) nach der Smogyi-Hefe-Fermentationsmethode. |
Es ist zu beachten, daß eine Zunahme von 8,7% mehr Dextrose in den festen Stoffen
des Hydrolysats war, wenn die rohe Kulturflüssigkeit gemäß der Erfindung zur Entfernung
schädlicher Stoffe für die Dextroseausbeute und zur Entfernung von Enzymen, welche
anderen Zucker als Dextrose erzeugen, behandelt worden war. Daß weit mehr Nichtdextrosezucker
durch die rohe Pilzflüssigkeit erzeugt werden, ist augenscheinlichdurch Vergleich
der Werte für unter D. E. gefundenen Gesamtzucker mit den Werten für die wirklichen
Dextrosegehalte. Im Fall des mit der rohenFlüssigkeit erzeugtenHydrolysats wurden
6,201o Nichtdextrosezucker erzeugt, während imFall des mit der behandelten Pilzflüssigkeit
erzeugten Hydrolysats nur 2,5 % Nichtdextrosezucker erzeugt wurden. Somit wären
fast 4% mehr Nichtdextrosezucker, welche in dem Hydrolysat von .der rohen Pilzflüssigkeit
erzeugt wurden. Der zusätzliche Gewinn an Dextroseausbeute über diese 40% Nichtdextrosezucker
bis zu 8,7% mehr Dextrosekonvertierung mit der gereinigten Amyloglukosidase kann
durch die Beseitigung fremden Proteins und anderer Stoffe, welche die Carbohydrase
während. der Hydrolyse stören, infolge der Behandlung erklärt wenden. Optische Dichtewerte
in der Tabelle zeigen, daß die Färbung des Stärkehydrolysats um 40 % durch Verwendung
des gereinigten Enzyms verringert wurde.
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Beispiel 2 Chromatographische Analysen von Hydrolysaten Hydrolysatmuster
aus Beispiel 1, genommen zu verschiedenen Zeiten während .der enzymatischen
Konvertierung, wurden durch Papierchromatographie untersucht.
In
jedem - Fall wurden 0,025 ccm Teile von Muster, eingestellt auf 12% Konzentration
an festen Stoffen, auf das Papier gebracht, das Papier getrocknet und das Chromatogramm
entwickelt mit einem Lösungsmittelgemisch aus 3 Volumteilen Butanol, 5 Volumteilen
Propanol und 2 Volumteilen Wasser. Nach einer Zeit, während welcher die Dextrosefraktion
sich etwa 400 mm von ihrem Ursprung bewegte, wurden die Papiere getrocknet und dann
mit einer Acetonlösung von Anilindiphenylamin und Phosphorsäure besprüht. Der ursprüngliche
saure hydrolysierte Stärkesirup allein und dieser zugesetzte Isomaltose und Panose
enthaltende Sirup wurden auch chromatographiert als Kontrollen und um Beziehungspunkte
für bekannte Saccharide zu geben. Während der gegebenen Zeit bewegten sich Maltose
etwa 190 mm, Isomaltose 150 mm, Trisaccharide etwa 80 bis 90 mm, Tetrasaccharide
40 mm und Pentasaccharide 15 mm. Alle diese Flecken waren leicht in den Kontrollchromatogrammen
als unterschieden unä wohlgetrennt voneinander ersichtlich.
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Wenn Hydrolysatmuster von Beispiel 1 untersucht wurden, worin nur
das rohe A.-niger-Kulturfiltratzum Hydrolysieren des säurehydroly sierten Stärkesirups
benutzt worden war, bestand das Hydrolysat dem Augenschein nach zum großen Teil
aus Dextrose. Jedoch waren ein ausgesprochener Fleck für die synthetische Trisaccharidpantose,
schwächere Flecken für Maltose und Isomaltose und noch schwächere Flecken für -Tetra-
und Pentasaccharide alle nach 24 Stunden Hydrolysierzeit bei 60° C vorhanden. Alle
diese Flecken außer für Dextrose und Isomaltose wurden schwächer nach 72 Stunden
Hydrolysierzeit, obwohl der Fleck für das synthetische Trisaccharid Pantose immer
noch verhältnismäßig stark war.
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Isomaltose ist bekanntlich ein normales Produkt der Hydrolyse von
Stärke, selbst wenn die Stärke durch Säure hydrolysiert wird und die Säurehydrolyse
sogar unter wenig günstigen Bedingungen für die Bildung von Isomaltose durch Wiedervereinigung
von zwei Dextrosemolekülen durchgeführt wird (W o 1 f -r o m u. a., J. Am. Chem.
Soc., 73, 4927 [1951]).
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In Stärkehydrolysaten anwesende Panose entsteht in großem Umfange
synthetisch durch Vereinigung von Maltose mit Dextrose über eine 1,6-a-Glukosidbindung
mittels des Enzyms Transglukosidase (Pan u. a., Science, 112, 115 [1950]).
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Wenn Hydrolysate geprüft wurden, welche mit durch Behandlung von A.-niger-Kulturflüssigkeit
mit wasserhaltigem, unlöslichem synthetischem Magnesiumsilikat gereinigter Amyloglukosidase
hergestellt waren, dann waren nach 24 Stunden Enzymkonvertierung etwa die gleichen
Mengen an Trisaccha.riden und Maltose wie in dem nicht durch Enzym hydrolysierten
Kontrollmuster und mehr Isomaltose und sehr viel mehr Dextrose vorhanden. Nach 72stündiger
Enzymkonvertierung war das Hydrolysat fast nur Dextrose mit einer Spur von Isomaltose
und nur den schwächsten Spuren von Maltose und Panose. Es waren nicht ausreichende
Mengen von höheren Sacchariden anwesend, um dies auf dem Chromatogramm anzuzeigen.
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Diese Ergebnisse beweisen, daß die Magnesiumsilikatbehandlung des
A.-niger-Extrakts in wirksamer Weise Transglukosidase entfernte, so daß sie nicht
die Dextroseausbeute durch Synthetisierung von Zuckern, wie Panose, verringerte.
Die Ergebnisse zeigen ferner, daß nach Behandlung der A.-niger-Kulturflüssigkeit
mit Magnesol die sich ergebende gereinigte Enzymzubereitung im wesentlichen nur
eine solche die Stärke hydrolysierende Aktivität entfaltete, welche dem gereinigten
Enzym Amyloglukosidase zugeschrieben wird. Dies ist der endgültige Angriff auf jedes
Stärkemolekül (oder sauer hydrolysiertes Stärkemolekül) und das Abspalten nur von
Dextroseeinheiten von Molekülenden, bis die Hydrolyse praktisch vollendet ist.
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Beispiel 3 Mit Wasser gewaschene Stärke wird auf 10° Be mit Wasser
aufgeschlämmt, auf etwa 0,02normale Säure mit Salzsäure eingestellt und dann in
einem Autoklav bei 1,40 kg/cm2 Dampfdruck konvertiert, bis die Konvertierungsflüssigkeit
etwa 17 D. E. aufwies, d. h., der reduzierende Wert der gelösten festen Stoffe in
der Flüssigkeit, gemessen durch eine-modifizierte Fehlingsche Prüfung (Fetzer, W.
J., Analytical Chem., 24, 1129 bis 1137 [1952], Bezugsnummer 37 bis 41) und der
als Dextrose berechnete Wert ist 17% Trockenbasis. Die Stärkesirupflüssigkeiten
werden dann mit 0,5% Trockenbasis Bentonit behandelt und auf einem vorher mit Dicalite-Filterhilfe
überzogenen Filter filtriert. Die Flüssigkeiten werden auf pg 5 durch Zusatz von
calcinierter Soda eingestellt und durch Eindampfen unter verringertem Druck auf
etwa 35% feste Stoffe konzentriert. Die Flüssigkeiten werden jetzt auf pg 4,0 bis
4,2 bei 60° C eingestellt und für jedes kg an vorhandener Trockensubstanz etwa 180
Aktivitätseinhenten einer gereinigten Amyloglukosi.dasezubereitung zugesetzt. Die
Amyloglukosidase war durch Behandeln eines A.-niger-Kulturextrakts mit wasserhaltigem,
unlöslichem synthetischem Magnesiumsilikat Adsorbierungsmittel in der im Beispiel
1, Abs. 2, geschilderten Weise gereinigt worden. Enzymatische Hydrolyse wird bei
60° C 72 Stunden voranschreiten gelassen, wonach höchste Werte von etwa 95 bis 96
für D. E. und etwa 93 0/0 Trockenbasis für wahre Dextrose durch die Smogyi-Hefe-Fermentationsmethode
erhalten werden.
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Die konvertierten Flüssigkeiten werden mit etwa 1% Kohle behandelt,
filtriert und auf etwa 70 bis 75% Trockensubstanzgehalt eingedampft, bevor sie in
den Kristallisator gehen. Wegen der höheren Reinheit dieser Flüssigkeiten im Vergleich
zu Kristallisatorflüssigkeiten aus bisher bekannten Verfahren neigt die Dextrose
viel schneller zum Kristallisieren, welche Eigenschaft die Verwendung einer weniger
konzentrierten Flüssigkeit ermöglicht, als gewöhnlich bei den üblichen Dextrosekristallisierverfanren
erforderlich ist. Eine anfängliche Temperatur von 42° C wird im Kristallisator-
gebraucht. mit dem üblichen Zusatz von Dextrosesaatkristallen, und die Flüssigkeiten
werden unter Rühren während 2 Tagen auf etwa 16 bis 18° C gekühlt. Die Flüssigkeiten
werden dann zentrifugiert, um die Dextrosekristalle zu gewinnen, und die Flüssigkeiten
werden nochmals nach Eindampfen auf etwa 75 bis 80% Trockensubstanzgehalt und Rühren
während des Kühlens über einen Temperaturbereich von etwa 42 bis 18° C innerhalb
4 Tagen zum Kristallisieren gebracht.
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Ausbeuten von sehr hoher Reinheit, erstgradiger kristalliner Dextrose
von etwa 85% ergeben sich bei diesem Verfahren, wobei ein Abzug für die bei der
Kristallisation des konzentrierten Hydrolysats zugesetzten Saatkristalldextrosen
gemacht ist. Diese Ausbeute ist etwa 20% mehr Dextrose, als aus Stärke nach bekannten
Säurekonvertierungsverfahren unter Verwendung einer einstufigenSäurekonvertierung
und vergleichbaren Raffinierverfahren erhalten wird, und 5 bis 10% oder mehr Ausbeute
an Dextrose als bei bisherigen Enzymkonvertierungsverfahren unter Verwendung
einer
einstufigen Enzymkonvertierung von sauerhy.drolysierter Stärke unter vergleichbaren
Raffinierverfahren und vergleichbarer doppelstufiger Kristallisation.