DE1030835B

DE1030835B - Verfahren zur Herstellung eines neuen polypeptidartigen Oxytocicums

Info

Publication number: DE1030835B
Application number: DES50742A
Authority: DE
Inventors: Dr Roger Boissonnas; Dr Stephan Guttmann; Dr Pierre-Alain Jaquenoud; Dr Jean-Pierre Waller
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1955-10-12
Filing date: 1956-10-02
Publication date: 1958-05-29

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

kl. 12 q 6/01

INTERNAT. KL. C 07 d

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT 1030 835

S 50742 IVb/12 q

ANMELDETAG: 2. OKTOBER 1956

BEKANNTMACHUNG
DER ANMELDUNG
UND AUSGABE DER
AUSLEGESCHRIFT: 29.MAI1958

Es wurde gefunden, daß man zu einem neuen polypeptidartigen Oxytocicum der Formel I gelangt,

C₆H₄OH

NH₂ CH₂ CH(CH₃),

SCH₂-CH-CO-NH-CH-Co-NH-CH-CO
SCH₂-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-Nh
CO CH₂ (CH₂)₂

CONH₂ CONH₂

CH₂ CH-CO-NH-CH-CO-Nh-CH₂-CONH₂ 10

-CHo

CH₉

CH(CH₃),

indem man L-Leucyl-glycinamid mit N-Carbobenzoxy-L-prolin acyliert und das so erhaltene N-Carbobenzoxy-L-propyl-L-leucyl-glycinamid durch Abspaltung der Carbobenzoxygruppe in das Tripeptid der Formel II überführt,

NH
/\
CH₂ CH-CO-NH-CH-CO-NH-Ch₂-CONH₂

30

Verfahren zur Herstellung

eines neuen polypeptidartigen

Oxytocicums

Anmelder:
Sandoz A. G., Basel (Schweiz)

Vertreter: Dr. W. Schalk, Dipl.-Ing. P. Wirth,

Dipl.-Ing, G. E. M. Dannenberg

und Dr. V. Schmied-Kowarzik, Patentanwälte,

Frankfurt/M., Große Eschenheimer Str. 39

Beanspruchte Priorität:
Schweiz vom 12. Oktober 19S5

Dr. Roger Boissonnas, Genf,
Dr. Stephan Guttmann, Dr. Pierre-Alain Jaquenoud,

Basel,

und Dr. Jean-Pierre Waller, Genf (Schweiz),
sind als Erfinder genannt worden

CH₂-CH₂ CH₂

CH(CH₃)₂

II

daß man ferner L-Asparaginyl-S-R-L-cystein-methylester, wo R eine zum Schutz der Sulfhydrylgruppe eingeführte Gruppe, z. B. eine Phenyl-, Benzyl-, p-Brom-

benzyl, Tolyl- oder p-Xylylgruppe bedeutet, mit N-Car-

bobenzoxy-L-glutamin acyliert und den so erhaltenen

N - Carbobenzoxy -L- glutaminyl - L - asparaginyl- S -R-L-

cystein-methylester nach an sich bekannten Methoden in

das N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-R-L-

cysteinazid der Formel III überführt,

RSCH₂-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-NH-COOCH₉C_nH,

CON,

CH₂	(CH₂)₂ j
CONH₂	CONH₂
III

daß man dieses mit dem Tripeptid II zum N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-R-L-cysteinyl··

809 525/436

L-prolyl-L-leucylglycinamid kondensiert und dieses durch Abspalten der Carbobenzoxygruppe in das Hexapeptid IV überführt,

RSCH₂-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-Nh₂

CO

CH₂

/^N\

(CH₂J₂ CONH₂ CONH₂

CH₂ CH-CO-NH-CH-CO-Nh-CH₂-CONH₂ CH₂-CH₂ CH₂

CH(CH₃)₂
IV

daß man ferner Ν-R'-S-R''-L-Cysteinyl-L-tyrosin, wobei 20 gruppe eingeführte Gruppe, z. B. ein Phenyl-, Benzyl-, R' eine zur Stabilisierung der Aminogruppe eingeführte p-Brombenzyl-, Tolyl- oder p-Xylylgruppe, bedeutet, Gruppe, z. B. eine Benzolsulfonyl-, Toluolsulfonyl-, mit L-Valin-methylester zum N-R'-S-R"-L-Cysteinyl-Carbophenoxy-, Carbobenzoxy- oder Carbo-p-brombenz- L-tyrosyl-L-vaHn-methylester V kondensiert, oxygruppe, und R" eine zum Schutz der Sulfhydryl-

C₆H₄OH

NHR'

CH₂

CH(CH₃)₂

R⁷⁷SCH₉-CH-CO-NH-CH-CQ-NH-CH-COOCh,

diesen Ester in ein reaktionsfähiges Derivat der freien Säure selbst überführt, mit dem man das Hexapeptid IV zum Nonapeptidderivat VI kondensiert

C₆H₄OH

NHR' CH₂ CH(CH₃)₂

R⁷⁷SCH₂-CH-CO-NH-CH-CO-Nh-CH-CO RSCH₂-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-Nh

CO

CH,

(CH₂),,

CONH₂ CONH₂

CH₂ CH-CO-NH-CH-CO-Nh-CH₂-CONH₂

Ii I "

CH₂—CH₂ CH₂

CH(CH₃)₂ VI

und in diesem durch Reduktion mit einem Alkali- 65 Lösung bei einem p_H von 6 bis 8 bei Zimmertemperatur metall, vorzugsweise Natrium oder Kalium, in flüssigem das Endprodukt I liefert.

Ammoniak die Gruppen R, R''und R" abspaltet, so daß Es wurde gefunden, daß die Verbindung I ein in vivo

das Nonapeptid L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-glutami- stärker wirkendes Oxytocicum ist als die ebenfalls nyl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycin- synthetisierte Verbindung VII, die die gleiche Konstiamid entsteht, das durch Oxydation mit Luft in wäßriger 70 tution hat,

C₁₅H₁OH

NH₂ CH₂ CH(CH₃)(C₂H₅)

ί ■ . !

SCH₂-CH-CO-NH-CH-CO-NH-Ch-CO

SCH₂-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-Nh
CO CH₂ (CH₂)₂

i !

CONH₂ CONH₂

CH₂ CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH₂-CONh₂
.-CH₂

CH(CH₃),
VII

die H. Tuppy in Biochem. Biophys. Acta, 11, 449 (1953), den beiden Sulfhydrylgruppen eine Cystingruppierung sowie V. du Vigneaud und Mitarbeiter in J. Am. Chem. bildet. Auf diese Weise entsteht als Endprodukt des Soc, 75, 4879 (1953), für das natürliche Oxytocin auf- 25 Verfahrens das zyklische Oktapeptidderivat der Formel I. gestellt haben. Dieser Befund war nicht vorauszusehen Die Erfindung umfaßt auch folgende Abänderungen

und überraschte um so mehr, als diese auf den Uterus in des Verfahrens: Zum Schutz der Aminogruppe im endsitu sehr stark wirkende Substanz eine bedeutend ständigen Cysteinylrest von VI können an Stelle der schwächere oxytocische Wirkung als Oxytocin zeigt, Carbobenzoxygruppe auch andere Gruppen, z. B. die wenn sie nur mit den klassischen für die Testung von 30 Carbophenoxy-, die Carbo-p-brombenzoxy-, die Toluol-Oxytocica üblichen Bestimmungsmethoden (Kontraktion sulfonyl- oder Benzolsulfonylgruppe, eingeführt werden. des isolierten Uterus, Blutdrucksenkung beim Hahn) Ferner beschränkt sich das Verfahren nicht nur auf die untersucht wird. Anwendung solcher L-Cysteinderivate, deren Sulfhydryl-

Die neue Verbindung soll therapeutisch in Geburtshilfe gruppe durch Einführung eines Benzylrestes stabilisiert und Gynäkologie angewendet werden. 35 ist, sondern nach der gleichen Methodik und mit dem

.. Das . Verfahren wird, beispielsweise folgendermaßen gleichen Erfolg können statt S-Benzyl-L-cysteinderivaten ausgeführt: Man behandelt Glycinamid in Gegenwart auch die entsprechenden S-p-Brombenzyl-, S-Phenyl-, eines Chlorameisensäureesters und einer tertiären Base S-Tolyl-oder S-p-Xylylderivate verwendet werden. Schließmit N-Carbobenzoxy-L-leucin und kondensiert das nach lieh kann das Verfahren erfmdungsgemäß auch so ab-Abs/paltung der N-Carbobenzoxygruppe erhaltene Di- 4° geändert werden, daß zum Aufbau des Nonapeptids VI peptid auf die gleiche Weise mit N-Carbobenzoxy-L- nicht das N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyroprolin zu einem Tripeptid, das nach der Abspaltung der syl-L-valin-azid verwendet wird, sondern daß der Carbobenzoxygruppe die Formel II besitzt. Ferner Methylester V zur freien Säure verseift wird, die in kondensiert man S-Benzyl-L-cystein-methylester mit Gegenwart von Tetraäthylpyrophosphit oder von Di-N-Carbobenzoxy-L-asparagin in Gegenwart von Diäthyl- 45 cyclohexylcarbodiimid mit dem Hexapeptid IV zuchlorophosphit und einer tertiären Base, behandelt den sammen ebenfalls das Nonapeptid VI liefert,
nach Abspaltung der N-Carbobenzoxygruppe erhaltenen . -I₁

L-Asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-methylester mit Beispiel 1

N-Carbobenzoxy-L-glutamin in Gegenwart eines Chlor- a) L-Prolyl-L-leucyl-glycinamid: Man versetzt die

ameisensäureesters und einer tertiären organischen Base 50 Lösung von 159 g N-Carbobenzoxy-L-leucin in 1200 ecm und führt den gebildeten Tripeptidester, in welchem die Tetrahydrofuran bei Zimmertemperatur mit 88 ecm freie Aminogruppe und die Sulfhydrylgruppe geschützt Triäthylamin und bei — 5⁰C mit 63 ecm Chlorameisensind, nach an sich bekannten Methoden in das Azid III säureäthylester in 50 ecm Tetrahydrofuran und gibt über. Mit diesem Azid wird das Tripeptid II aeyliert, nach 15 Minuten unter sehr starkem Rühren rasch wobei ein Hexapeptid entsteht, das nach Abspaltung der 55 eine frisch bereitete Lösung von 66,4 g Glycinamid-N-Carbobenzoxygruppe die Formel IV besitzt. Nun baut hydrochlorid in 330 ecm 2n-Natronlauge zu. Nach man durch Kondensation von N-Carbobenzoxy-S-benzyl- 3 Stunden wird die organische Schicht im Vakuum ein-L-cysteinyl-L-tyrosin mit L-Valin-methylester den gedampft, die Lösung des Rückstandes in 2 1 Essigester N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-valin- zunächst mit der wäßrigen Phase geschüttelt, dann mit methylester V auf, führt diesen nach bekannten Methoden 60 verdünnter ' Salzsäure und zuletzt mit verdünntem in das Azid über und kondensiert dieses mit dem Hexa- Ammoniak gewaschen. Man trocknet über Natriumpeptid IV, wobei das Nonapeptid VI entsteht, in welchem sulfat, dampft im Vakuum ein und nimmt den Rückdie beiden Sulfhydrylgruppen durch einen Benzylrest stand mit 1,5 1 Äther auf. Filtration der ausgeschiedenen und die Aminogruppe des endständigen Cysteinylrestes Kristalle, zu denen nach dem Eindampfen der Mutterdurch die Carbobenzoxygruppe substituiert sind. Diese 65 lauge noch eine weitere Menge hinzukommt, liefert inszum Schutz der genannten funktionellen Gruppen ein- gesamt 130 g N-Carbobenzoxy-L-leucyl-glycinamid, geführten Reste werden beim Behandeln des Nonapeptids Schmp. 8O⁰C, [a]J? = —10,5⁰C (c = 1,8; Chloroform), mit einem Alkalimetall, vorzugsweise Natrium oder die in 500 ecm einer 2,5n-Lösung von Bromwasserstoff Kalium, in flüssigem Ammoniak abgespalten, worauf in Eisessig gelöst 1 Stunde lang bei 20° C stehengelassen sich durch Oxydation mit Luft in wäßriger Lösung aus 70 werden. Man dampft im Vakuum ein, stellt die mit

7 8

Äther gewaschene und mit festem Natriumcarbonat 4 Stunden unter Rühren bei Zimmertemperatur, wobei neutralisierte Lösung des Rückstandes in 350 ecm Wasser der p_H-Wert auf 5,5 gehalten wird. Nach Zugabe von mit 4n-Natronlauge auf einen p_H-Wert von 9,5 bis 10,0 141 Eiswasser wird die ausgeschiedene Kristallmasse ein und gibt diese Lösung zu einem frisch bereiteten abfiltriert, mit Wasser gewaschen und durch rasches Gemisch, erhalten durch Versetzen einer Lösung von 5 Auflösen in 2200 ecm siedendem Pyridin, Versetzen der 103 g N-Carbobenzoxy-L-prolin in 1200 ecm Tetrahydro- Lösung mit 221 siedendem Wasser und Abkühlen umfuran zunächst mit 58 ecm Triäthylamin und dann bei kristallisiert, wobei 119 g N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-—10°C mit 41 ecm Chlorameisensäureäthylester. Die L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-methylester erhalten entstandene Emulsion zeigt nach 2stündigem Stehen bei werden. Schmp. 239° C, [a] J? = —38,6° C (c = 2,4; 20° C unter Rühren einen p_H-Wert von nahezu 7. Sie io Eisessig). Diese werden in einem Gemisch aus 1800 ecm wird im Vakuum von Tetrahydrofuran befreit und mit Methanol und 300 ecm Hydrazinhydrat suspendiert und 21 Methylenchlorid extrahiert. Man wäscht den Extrakt während 3 Stunden unter starkem Rühren unter Rückzuerst mit kalter verdünnter Natronlauge, dann mit fluß erhitzt. Man versetzt mit 1400 ecm Wasser, nitriert verdünnter Salzsäure und dampft ihn nach dem Trocknen das abgeschiedene Hydrazid ab und wäscht mit Wasser über Natriumsulfat im Vakuum ein. Aufnehmen des 15 nach. Ausbeute 108 g, Schmp. 258° C. Man löst das Rückstandes in 200 ecm warmem Essigester und Ab- Hydrazid bei — 5° C in 1350 ecm Eisessig und 180 ecm kühlen der Lösung liefert 112 g N-Carbobenzoxy-L-prolyl- 3n-Salzsäure und versetzt mit 180 ecm lmolarer wäßriger L-leucyl-glycinamid; Schmp. 163°C, [a]|° = —71,9⁰C Natriumnitritlösung. Nach 5 Minuten gibt man 61 (c = 2,5, Äthanol). Eiswasser zu, nitriert den ausgeschiedenen Niederschlag

Zur Abspaltung des Carbobenzoxyrestes löst man die 20 ab, wäscht ihn sorgfältig mit Wasser nach und trocknet Verbindung in 350 ecm einer 2,5n-Lösung von Brom- bei 0° C im Vakuum über Phosphorpentoxyd und wasserstoff in Eisessig und dampft die Lösung nach Kaliumhydroxyd. Ausbeute 106 g Azid, Schmp. 225° C, lstündigem Stehen bei 20° C im Vakuum ein. Die die sofort weiterverarbeitet werden. Lösung des Rückstandes in 150 ecm Wasser wird mit c) L-Glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-

Äther ausgeschüttelt, mit 21 Wasser verdünnt, zur 25 L-prolyl-L-leucyl-glycinamid: Man löst 106 g N-Carbo-Entfernung des Bromwasserstoffs mit der genügenden benzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-Menge eines frisch hergestellten Anionenaustauschers in azid in der Lösung von 50 g L-Prolyl-L-leucyl-glycinamid seiner basischen Form behandelt und im Vakuum ein- in 700 ecm Dimethylformamid, filtriert den nach 3 tägigem gedampft. Der Rückstand liefert beim Verreiben mit Stehen unter Rühren bei 40° C und langsamem Ein-Essigester 68 g L-Prolyl-L-leucyl-glycinamid vom Schmp. 30 dampfen im Vakuum auf das halbe Volumen aus-120° C. geschiedenen Niederschlag ab und wäscht ihn mit Essig-

b) N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S- ester nach. Die Mutterlauge liefert beim Versetzen mit benzyl-L-cystein-azid: Man versetzt bei —10° C Essigester noch eine weitere kleine Menge von Kristallen, 800 ecm Methanol zunächst mit 200 g Thionylchlorid Zur Abspaltung der Carbobenzoxygruppe löst man die und dann mit 250 g S-Benzyl-L-cystein, läßt das Gemisch 35 so erhaltenen 76 g N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-6 Stunden bei 45° C stehen und dampft es im Vakuum asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinein. Die Lösung des Rückstandes in 300 ecm Methanol amid (Schmp. 208° C) in 540 ecm einer 2,5n-Lösung von wird mit 11 Äther verdünnt und liefert nach ltägigem Bromwasserstoff in Eisessig und dampft die Lösung nach Stehen bei 0° C 224 g S-Benzyl-L-cystein-methylester- lstündigem Stehen bei Zimmertemperatur im Vakuum hydrochlorid vom Schmp. 150° C, [α]" = —13,9° C 4" ein. Der Rückstand wird so lange mit Essigester und (c = 2,9; Wasser), die zu einer Lösung von 240 ecm Aceton verrieben, bis er pulverförmig geworden ist. Triäthylamin in 3,41 Toluol gegeben werden. Man Dieses Pulver wird in 101 Methanol gelöst und zur erwärmt das Gemisch rasch auf 55° C, läßt unter Rühren Entfernung des Bromwasserstoffs mit einem frisch 2 Stunden lang bei 20° C stehen, versetzt das Gemisch bereiteten und sorgfältig mit Methanol gewaschenen bei 0° C mit 128 ecm Diäthylchlorophosphit und er- 45 Anionenaustauscher in seiner basischen Form behandelt, wärmt 1 Stunde lang auf 80° C. Nach dem Abkühlen Man dampft die Lösung zur Trockne ein und verreibt auf 0° C wird vom abgeschiedenen Triäthylamin-hydro- den Rückstand so lange mit Essigester, bis 52 g kristalüchlorid abfiltriert und das Filtrat zu einer Lösung von siertes L-Glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cyste-190 g N-Carbobenzoxy-L-asparagin in 580 ecm Diäthyl- inyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamiderhalten werden. Schmp. phosphit gegeben. Man erhitzt das Gemisch 2 Stunden 50 145° C, [a]¹j = —67,3° C (c = 2,3; Eisessig), lang auf 105° C, kühlt auf 0° C ab und filtriert den d) N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-

Niederschlag ab. Dieser wird rasch in 1250 ecm sieden- L-valin-methylester: Zu einer Lösung von 73 g N-Carbodem Pyridin gelöst, mit 20 1 siedendem Wasser versetzt benzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosin in 350 ecm Tetra- und abgekühlt. Es kristallisiert N-Carbobenzoxy-L- hydrofuran werden bei Zimmertemperatur 34 ecm Triasparaginyl-S-benzyl-L-cystein-methylester aus in einer 55 n-butylamin und dann bei — 5° C 14,3 ecm Chlorameisen-Ausbeute von 130 g nach Waschen mit Wasser. Schmp. säureäthylester gegeben. Nach 10 Minuten setzt man 196° C, [a%⁹ = — 31,9° C (c = 2,4; Pyridin). 19,5 g frisch destillierten L-Valin-methylester zu und

Zur Abspaltung des Carbobenzoxyrestes löst man die hält die Mischung I¹Z₂ Stunden lang unter Rühren bei Verbindung in 800 ecm einer 2,5n-Lösung von Brom- 0° C und dann während 5 Minuten bei 50° C. Das wasserstoff in Eisessig und dampft die Lösung nach 60 Reaktionsgemisch wird im Vakuum zur Trockne ein-1 ^₂ständigem Stehen bei 20° C im Vakuum ein. Die gedampft und die Lösung des Rückstandes in Essigester Lösung des Rückstandes in 300 ecm Wasser wird mit sorgfältig mit verdünnter Salzsäure und anschließend Äther ausgeschüttelt und dann durch Versetzen mit mit verdünntem Ammoniak gewaschen. Nach Trocknen festem Natriumcarbonat auf einen p_H-Wert von 6,0 bis 6,5 der organischen Schicht über Natriumsulfat wird Petroleingestellt. Diese Lösung gießt man in eine Mischung, 65 äther zugesetzt, wobei der N-Carbobenzoxy-S-benzyldie durch Versetzen einer Lösung von 107 g N-Carbo- L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-valin-methylester kristallin ausbenzoxy-L-glutamin in 1500 ecm Tetrahydrofuran und fällt. Nach dem Umkristallisieren aus Essigester/Petrol- ; 1500 ecm Dioxan bei 0° C mit 54 ecm Triäthylamin und äther erhält man 59 g der kristallisierten Verbindung, 36,6 ecm Chlorameisensäureäthylester frisch bereitet Schmp. 132° C, [a]J? = — 36,4° C (c = 2,9; Metha- ,§«. worden ist, und hält das Reaktionsgemisch während 70 nol). ^:|i

9 10

e) N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl- Äther aus, reinigt es durch Umfallen aus seiner Lösung L-valyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cyste- in Dimethylformamid mit Essigester und wäscht es, wie inyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid: Man löst 59 g im Beispiel 1, am Ende des Abschnitts e), angegeben. N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-valin- Die Weiterverarbeitung geschieht wie im Beispiel 1, methylester in 250 ecm warmem Methanol und gibt 5 Abschnitt f).

50 ecm Hydrazinhydrat zu. Nach 3 stündigem Stehen

bei 65° C wird die Masse in Wasser gegossen, die ab- Beispiel 3
geschiedene Substanz mit viel Wasser gewaschen, bis

sie kein Hydrazin mehr enthält, und im Hochvakuum Man verfährt, wie im 1. Absatz von Beispiel 2 angegetrocknet. Die so erhaltenen 54 g N-Carbobenzoxy- i° geben, und kondensiert das N-Carbobenzoxy-S-benzyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-valin-hydrazid vom L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-valin mit L-Glutaminyl-L-aspa-Schmp. 242° C werden bei 60° C rasch in einer Mischung raginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinvon 260 ecm ln-Salzsäure und 1700 ecm Eisessig gelöst. amid durch Stehenlassen einer Lösung äquimolekularer Man kühlt die Lösung sofort auf — 5° C ab, versetzt sie Mengen beider Substanzen sowie von Dicyclohexylcarbodiunter Rühren mit 93 ecm lmolarer Natriumnitritlösung, *5 imid in Dimethylformamid während 24 Stunden bei fügt nach 10 Minuten 3,51 Eiswasser hinzu und nitriert 20° C und reinigt das so erhaltene Nonapeptid, wie im den ausgefallenen Niederschlag ab. Dieser wird mit Beispiel 2 bzw. 1 angegeben. Das Nonapeptid wird, wie Wasser und Natriumhydrocarbonatlösung sorgfältig nach- im Beispiel 1, Abschnitt f), angegeben, weiterverarbeitet, gewaschen und im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd

und Kaliumhydroxyd getrocknet. Ausbeute 50g N-Carbo- 20 Beispiel 4
benzoxy - S - benzyl - L - cysteinyl - L - tyrosyl - L - valin - azid,

Schmp. 125° C. Dieses wird sofort in 450 ecm Dimethyl- Man verfährt wie im Beispiel 1, Abschnitt a), b) und c),

formamid gelöst und mit 40 g L-Glutaminyl-L-aspara- angegeben. Alsdann läßt man die Lösung äquimoleku-

ginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid, larer Mengen N - Benzolsulf onyl - S - benzyl - L - cystein,

hergestellt nach Beispiel 1, c), versetzt. Man versetzt 25 L-Tyrosin-methylester und Dicyclohexylcarbodiimid in

die Mischung nach 90 stündigem Rühren bei 20° C und Tetrahydrofuran während 6 Stunden bei 20° C stehen,

Einengen im Vakuum auf das halbe Volumen mit 41 dampft zur Trockne ein und nimmt den Rückstand in

Essigester. Der ausgeschiedene flockige Niederschlag Essigester auf. Aus der mit verdünnter Salzsäure und

wird abfiltriert und mit Essigester, dann mit Methanol mit verdünntem Ammoniak gewaschenen und über

sorgfältig ausgewaschen, wonach 50-g N-Carbobenzoxy- 3° Natriumsulfat getrockneten Lösung fällt durch Zusatz

S - benzyl - L - cysteinyl- L - tyrosyl - L - valyl - L- glutaminyl- von Petroläther N-Benzolsulf onyl-S-benzyl-L-cysteinyl-

L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl- L-tyrosin-methylester aus, der nach dem Umkristalli-

glycinamid vom Schmp. 232° C erhalten werden. sieren aus Äthanol/Wasser durch 1 stündiges Stehen bei

f) Polypeptidverbindung I: Man versetzt die Lösung 20° C in einer ln-Lösung von Natriumhydroxyd in vonlOgN-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl- 35 75prozentigem Methanol zur freien Säure verseift wird. L-valyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cyste- Ansäuern dieser Lösung liefert das N-Benzolsulfonylinyl-L-proryl-L-leucyl-glycinamid in 1250 ecm trocke- S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosin in einer Ausbeute von nem flüssigem Ammoniak unter Rühren bei der Siede- 60%. Dieses wird, wie im Beispiel 1, Abschnitt d), betemperatur der Lösung mit so viel Natrium- oder Kalium- schrieben, mit L-Valin-methylester zum N-Benzolsulfonylmetall, bis eine beständige blaue Färbung eingetreten ist. 4° S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-valin-methylester kon-Nach Zusatz von 1,9 g Ammoniumchlorid wird die densiert, der, wie im Beispiel 1, Abschnitt e) und f), Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft, der oder im Beispiel 2 für das N-Carbobenzoxyderivat beRückstand, enthaltend L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L-valyl- schrieben, zu einem Präparat der Polypeptidverbindung I L-glutaminyl-L-asparaginyl-L-cysteinj'l-L-prolyl-L-leucyl- weiterverarbeitet wird.

glycinamid, wird in 201 0,002 η-Essigsäure gelöst und bei 45

einem p_H-Wert von 6,5 bis 7,0 durch Einleiten von Luft Beispiel 5

während 2 Stunden oxydiert. Man bringt die Lösung, Man verfährt, wie im Beispiel 4 angegeben, aber unter

die 2 bis 3 g der Substanz I enthält, auf einen p_H-Wert Verwendung von N-Carbophenoxy-S-benzyl-L-cystein an von 4,0 bis 5,0, filtriert und dampft nach Zusatz von Stelle von N-Benzolsulfonyl-S-benzyl-L-cystein und er-100 g Natriumchlorid zur Trockne ein, wobei ein trockenes 50 hält das gleiche Präparat von Polypeptidverbindung I Pulver erhalten wird, das gut haltbar ist. Es kann auf- wie in den vorhergehenden Beispielen.

bewahrt und bei Gebrauch klar gelöst werden. Man

kann jedoch auch die Lösung direkt verwenden, eventuell Beispiel 6

nach Verdünnen mit Wasser oder einer Salzlösung.

55 Man verfährt, wie im Beispiel 4 angegeben, aber unter

Beispiel 2 Verwendung von N-Carbo-p-brombenzoxy-S-benzyl-

L-cystein an Stelle von N-Benzolsulf onyl-S-benzyl-

Man verfährt wie im Beispiel 1, Abschnitt a), b), c) L-cystein und erhält das gleiche Präparat der PoIy- und d), löst den N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl- peptidverbindung I wie in den vorhergehenden Bei-L-tyrosyl-L-valin-methylester in 180 ecm Dioxan, ver- 60 spielen.

setzt die Lösung mit 60 ecm 4n-Natronlauge und läßt „ . . . ₇

IV₂ Stunden bei 2O⁰C stehen. Nach dem Ansäuern Beispiel /

kristallisiert das verseifte Tripeptid aus, das abfiltriert Man verfährt, wie im Beispiel 1, Abschnitt a),b) und c),

und aus Äthanol/Wasser umkristallisiert wird. Man angegeben. Alsdann behandelt man S-p-Brombenzylerhitzt 1 Teil des so gewonnenen N-Carbobenzoxy- 65 L-cystein in Gegenwart von 2n-Natronlauge mit Carbo-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-valins und 1 Teil L-Glut- benzoxychlorid nach der von M. Bergmann und aminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl- L. Zervas, Ber. 65 (1932), 1192, für die Synthese von L-leucyl-glycinamid zusammen mit 1 Teil Tetraäthylpyro- N-Carbobenzoxyderivaten der Aminosäuren angegebenen phosphit und 3 Teilen Diäthylphosphit während einer Methode, löst 1 Äquivalent des entstandenen N-Carbo-Stunde auf 100° C, fällt das entstandene Nonapeptid mit 70 benzoxy-S-p-brombenzyl-L-cysteins in Diäthylphosphit,

versetzt die Lösung mit 2 Äquivalenten Tetraäthylpyrophosphit und 1 Äquivalent L-Tyrosinmethylester und erwärmt das Gemisch 1 Stunde lang auf 80° C. Durch Zusatz von Äther fällt der N-Carbobenzoxy-S-p-brombenzyl-L-cysteinyl-L-tyrosin-methylester aus, der abfiltriert wird und dessen Lösung in Essigester mit verdünnter Salzsäure und mit verdünntem Ammoniak gewaschen und dann getrocknet wird. Beim Versetzen der Lösung mit Petroläther fällt der Ester in kristalliner Form aus. Er wird mit ln-Natronlauge in 75prozentigem Dioxan zum N-Carbobenzoxy-S-p-brombenzyl-L-cysteinyl-L-tyrosin verseift, das, wie im Beispiel 1, Abschnitt d), beschrieben, mit L-Valin-methylester zum N - Carbobenzoxy-S-p-brombenzyl-L-cysteinyl-L- tyrosyl-L-valin-methylester kondensiert wird. Dieser wird, wie im Beispiel 1, Abschnitt e) und f), oder im Beispiel 2 für das entsprechende S-Benzylderivat beschrieben, zu einem Präparat der Polypeptidverbindung I weiter verarbeitet.

Beispiel 8

Man verfährt, wie im Beispiel 7 angegeben, aber unter Verwendung von S-Phenyl-L-cystein an Stelle von S-p-Brombenzyl-L-cystein, und erhält das gleiche Präparat der Polypeptidverbindung I wie in den vorhergehenden Beispielen.

Beispiel 9

Man verfährt, wie im Beispiel 7 angegeben, aber unter Verwendung von S-Tolyl-L-cystein an Stelle von S-p-Brombenzyl-L-cystein, und erhält das gleiche Präparat der Polypeptidverbindung I wie in den vorhergehenden Beispielen.

Beispiel 10

Man stellt nach dem im Beispiel 1, Abschnitt f), beschriebenen Verfahren unter Verwendung von S-p-Brombenzyl-L-cystein an Stelle des entsprechenden S-Benzyldeiivates das N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-p-brombenzyl-L-cystein-azid dar, kondensiert dieses nach Beispiel 1, Abschnitt c), mit L-Prolyl-L-leucylglycinamid — Herstellung nach Beispiel 1, a) — zum L-Glutaminyl-L-asparaginyl-S-p-brombenzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid. Dieses Hexapeptidderivat wird, wie in einem der vorangehenden Beispiele angegeben, zu einem Präparat der Polypeptidverbindung I weiterverarbeitet, das die gleichen Eigenschaften hat wie die nach den obigen Beispielen gewonnene Substanz.

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung eines neuen polypeptidartigen Oxytocicums der Formel I,

C₆H₄OH

NH₂ CH₂ CH(CHg)₂

SCH₂-CH-CO-NH-CH-CO-Nh-CH-CO

I i

SCHo-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-NH

CO

CH₂ CONH₂ (CH₂)₂
CONH,

CH₉ CH-CO-NH-CH-CO-NH-CHo-CONH,

CxIo

CH₂

CH(CH₃), I

dadurch gekennzeichnet, daß man L-Leucyl-glycinamid mit N-Carbobenzoxy-L-prolin acyliert und das so erhaltene N-Carbobenzoxy-L-prolyl-L-leucyl-

NH glycinamid durch Abspaltung der Carbobenzoxygruppe in das Tripeptid der Formel II

CH₂ CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH₂-CONh₂

CHo—CHo

CHo

CH(CH₃), II

überführt, daß man ferner L-Asparaginyl-S-R-L-cystein-methylester, wo R eine zum Schutz der SuIfhydrylgruppe eingeführte Gruppe, z. B. eine Phenyl-, Benzyl-, p-Brombenzyl-, Toluyl- oder p-Xylylgruppe, bedeutet, mit N-Carbobenzoxy-L-glutamin acyliert und den so erhaltenen N-Carbobenzoxy-L-glutarninyl-L-asparaginyl-S-R-L-cystein-methyiester nach an sich bekannten Methoden in das N-Carbobenzoxy-L-

13 14

glutaminyl-L-asparaginyl-S-R-L-cystein-azid der Formel III überführt,

RSCH₂-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-NH-COOCH₂CeH₈

ι ι ■■ ι

CON,

CH₂ (CH₂)₂ CONH₂ CONH III

daß man dieses mit dem Tripeptid II zum N-Carbo- ίο benzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-R-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid kondensiert und dieses durch Abspalten der Carbobenzoxygruppe in das Hexapeptid IV überführt,

RSCH₂-CH-NH-CO-CH-NH-CO-Ch-NH₂

CO

CH₂ (CH₂)₂

CONH₂ CONH₂

CH₂ CH-CO-NH-CH-Co-NH-CH₂-CONH₂

j ι

CH₂

CH(CH₃), IV

daß man ferner N-R'-S-R"-L-Cysteinyl-L-tyrosin, wobei R' eine zur Stabilisierung der Aminogruppe eingeführte Gruppe, z. B. eine Carbophenoxy-, Carbobenzoxy-, Carbo-p-brom-benzoxy-, Benzolsulfonyl- oder Toluolsulfonylgruppe und R" eine zum Schutz der Sulfhydrylgruppe eingeführte Gruppe, z. B. eine Phenyl-, Benzyl-, p-Brombenzyl-, Tolyl- oder p-Xylylgruppe bedeutet, mit L-Valin-methylester zum Ν-R'-S-R''-L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L-valin-methylester V kondensiert,

NHR'

C₆H₄OH

CH, CH(CH₃)₂

R"SCH₂-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOCH₃

diesen Ester in ein reaktionsfähiges Derivat der freien Säure selbst überführt, mit dem man das Hexapeptid IV zum Nonapeptidderivat VI kondensiert

C₆H₄OH

NHR' CH₂ CH(CHg)₂

I I I

11"SCH₂-CH-CO-Nh-CH-CO-NH-CH-CO RSCH₂-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-Nh CO CH₂ (CH₂)₂

CONH₂ CONH₂

CH₂ CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH₂-CONh₂

CH2— CH.2

CH₂

CH(CH₃), VI

und in diesem durch Reduktion mit einem Alkalimetall, vorzugsweise Natrium oder Kalium, in flüssigem Ammoniak die Gruppen R, R' und R" abspaltet, so daß das Nonapeptid L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L - valyl - L - glutaminyl - L - asparaginyl - L - cysteinyl-L-propyl-L-leucyl-glycinamid entsteht, das durch Oxydation mit Luft in wäßriger Lösung bei einem

© 809'528/436 5.58 p_H-Wert von 6 bis 8 bei Zimmertemperatur das Endprodukt der Formel I liefert.
2. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man an Stelle eines reaktionsfähigen Derivates des Ν-R'-S-R''-L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L-valins dieses Tripeptidderivat selbst verwendet.