DE1125942B - Verfahren zur Herstellung neuer hypertensinwirksamer Oktapeptide - Google Patents

Description

DEUTSCHES

PATENTAMT

C 15418 IVb/12 q

ANMELDKTAG: 2. SEPTEMBER 1957

BEKANNTMACHUNG
DER ANMELDUNG
UNDAUSGABEDER
AUSLEGESCHRIFT: 22. MÄRZ 1962

Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von Oktapeptiden mit Hypertensinwirkung. Beim Hypertensin handelt es sich bekanntlich um ein Hormon mit blutdrucksteigernder Wirkung, das zuerst aus Rinderblut gewonnen wurde (vgl. zum Beispiel E. Braun-Menendez et al., Rev. Soc. Argentina Biol., Bd. 15 [1939], S. 420; I. H. Page et al., J. Exp. Med., Bd. 71 [1940], S. 29). Die Konstitutionsaufklärung ergab, daß Hypertensin ein lineares Dekapeptid ist mit der Aminosäuresequenz L-Asparaginsäure, L-Arginin, L-Valin, L-Tyrosin, L-Valin, L-Histidin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Leucin. In der Folge wurden noch zwei weitere Hypertensine aufgefunden: Hypertensin I, das im Pferdeblut vorkommt und statt des fünften Aminosäurerestes (Valin) den Rest des Tsoleucins enthält, und Hypertensin II, ein Oktapeptid, das im Aufbau dem Hypertensin I entspricht, jedoch die beiden letzten Aminosäurereste nicht enthält (vgl. zum Beispiel Skeggs et al., J. Exp. Med., Bd. 100 [1954], S. 363; a.a.O., Bd. 103 [1956], S. 301; W. S. Peart, Bioch. J., Bd. 62 [1956], S. 520).

Es wurde nun gefunden, daß Oktapeptide mit der Aminosäuresequenz L-Asparagin, L-«-(Aminoniederalkyl)-amino-essigsäure, L-*-Amino-niederalkylessigsäure, L-Tyrosin, L-Ä-Amino-niederalkyl-essigsäure, L-Histidin, L-Prolin, L-Phenylalanin und ihre Salze ebenfalls eine sehr gute hypertensive Wirkung aufweisen. Reste der Λ-Amino-niederalkyl-essigsäure sind vor allem Valyl, Leucyl, iso-Leucyl, ferner Norvalyl, Norleucyl sowie Alanyl. Als «-(Amino-niederalkyl)-amino-essigsäuren kommen in Betracht Arginin, Lysin, Ornithin, «,y-Diaminobuttersäure oder Citrullin. Es hat sich gezeigt, daß Oktapeptide, in denen die in den natürlichen Hypertensinen vorkommenden Aminosäuren Arginin, Valin und Isoleucin durch andere Aminosäuren, beispielsweise Lysin oder Leucin, ersetzt sind, auch eine Hypertensinwirkung aufweisen. Dies ist von technischer Bedeutung, weil die genannten Oktapeptide im Vergleich zu den bereits bekannten Peptiden leichter und somit billiger zugänglich sind. Ebenso bedeutet die Verwendung eines Oktapeptids, das statt des Asparaginsäurerestes den Asparaginrest enthält, schon verfahrenstechnisch einen Fortschritt. Die genannten Oktapeptide können auch als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer wirksamer Verbindungen verwendet werden. So kann beispielsweise der Amidrest des Asparagine in die Carboxylgruppe übergeführt werden; geht man vom L-Asparagiuyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-propyl-L-phenylalanin aus, so erhält man Hypertensin II, womit erstmals die Synthese dieses Hormons beschrieben ist.

Verfahren zur Herstellung neuer hypertensinwirksamer Oktapeptide

Anmelder: CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beanspruchte Priorität: Schweiz vom 6. September 1956, 8. Februar, 6. März

und 31. Juli 1957 (Nr. 37 189, Nr. 42 508, Nr. 43 519 und Nr. 49 007)

Dr. Robert Schwyzer, Dr. Beat Iselin, Riehen, Dr. Heini Kappeier, Dr. Werner Rittel, Basel,

und Dr. Bernhard Riniker, Birsfelden (Schweiz), sind als Erfinder genannt worden

Die Überführung der den Asparaginrest aufweisenden Peptide in entsprechende Peptide mit dem Asparaginsäurerest erfolgt durch Behandlung mit wäßrigen oder alkoholischen Alkalien, z. B. Natronlauge in Methanol, oder auch mit wäßrigen oder alkoholischen Mineralsäuren.

Es besteht eine große Anzahl von Möglichkeiten, die neuen Oktapeptide zu synthetisieren. Vorteilhaft geht man aus von einem L-Asparagin, dessen Aminogruppe mittels eines durch Reduktion oder Hydrolyse abspaltbaren Restes geschützt ist, und von einem L-Oi- (Amino - niederalkyl) - amino - essigsäureester, dessen Aminogruppe des Amino-niederalkylrestes durch einen mittels Hydrolyse oder Reduktion abspaltbaren Rest, vorteilhaft durch eine Nitrogruppe, geschützt ist, und kondensiert diese Verbindungen zum Dipeptidester, der dann hydrolysiert und kondensiert wird mit einer L-«-Amino-niederalkyl-essigsäure, einem L-Tyrosin mit freier oder substituierter Oxygruppe, einer L-ac-Amino-niederalkyl-essigsäure, L-Histidin, L-Prolin und einem L-Phenylalaninester amidartig unter Bildung eines Oktapeptids mit der erwähnten Reihenfolge der genannten Aminocarbonsäurereste miteinander, setzt in dem so erhaltenen Oktapeptid die veresterte Carboxylgruppe und die geschützten Aminogruppen und gegebenenfalls eine substituierte Oxygruppe des Tyrosinrestes in Freiheit und führt, wenn erwünscht, die Carbonylamidgruppe des Asparaginrestes in eine freie Carboxylgruppe über.

20Ϊ 520/429

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Wenn das zu synthetisierende Oktapeptid als zweite Aminosäure Arginin enthält, geht man zweckmäßig so vor, daß man Nitro-L-arginin mit einem eine geschützte Aminogruppe aufweisenden L-Asparagin acyliert. Das so erhaltene L-Asparaginylnitro-L-arginin läßt sich dann mit einem L-oc-Aminoniederalkylacetyl -L-tyrosyl -L-κ- amino -niederalkylacetyl -L- histidyl -L- prolyl - l - phenylalaninester zum gewünschten Oktapeptid kondensieren, beispielsweise nach dem Schema von Fig. 1 oder 2. Man kann aber auch ein L - Asparaginyl - nitro - l - arginin mit l - <x - Aminoniederalkyl - acetyl - l - tyrosin zu einem Asparaginyl- -nitro - L - arginyl - l-x - amino -niederalkyl - acetyl - l-

IO

NH₂ NO₂

Z- Asp Arg

OH Z- VaI

OH H-

Tyr tyrosin kondensieren und dieses mit einem l - x-Amino - niederalkyl - acetyl -L- histidyl - L-propyl-L - phenylalaninester zum Oktapeptid umsetzen, beispielsweise nach dem Schema von Fig. 3. Ferner ist es möglich, L-oi-Amino-niederalkyl-acetyl-L - tyro syl - L - α - amino - niederalkyl - acetyl- histidin mit einem L - Asparaginyl - nitro - l - arginin zu acylieren und das erhaltene L-Asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-aamino-niederalkyl-acetyl-L-tyrosyl-L-oc-amino-niederalkyl-acetyl-histidin mit L-Prolyl-L-phenylalanin zum Oktapeptid umzusetzen, beispielsweise nach dem Schema von Fig. 4. Falls Lysin die zweite Aminosäure des Oktapeptids ist, läßt sich die Synthese z. B. nach dem Schema von Fig. 5 durchführen.

OCH, H

lieu His Pro Phe

-OCH₃

Z- VaI

Tyr -OCH₃

H VaI

Tyr -OCH₃

NH₂ NO₂

Asp Arg

VaI

Tyr

-OCH₃

NH₂

H- Asp

NH₉

OH

Fig.

NH₂ NO₂

Z- Asp Arg

OH Z-

VaI Tyr VaI His -OH H- Pro

Z- VaI Tyr VaI His Pro

H- VaI Tyr VaI His Pro

NO₂

Z- Asp Arg

VaI Tyr VaI His Pro

Arg

VaI Tyr VaI His Pro

H - Asp Arg

VaI Tyr VaI His Pro

Ν H2

Η

Asp

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Asp

Η

Asp

NO2 I

VaI

Tyr

Heu

His

Pro

Phe

Z-

Asp

Ν H2

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Tyr

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Tyr

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His

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Arg

VaI

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Heu

His

Pro

Phe

Arg

OH

Phe OCH,

Phe -OCH,

Phe -OCH,

Phe OCH,

Phe -OCH,

Phe -OH

H— Asp Arg

VaI Tyr VaI His Fig.

Pro

Phe -OH

NH,

Asp

OH H

Lys

NH₂

Asp	Lys
NH2	Z
Asp	Lys

OCH,

OCH_a

OH

H-

VaI Tyr Leu His Pro Phe

- 0CH_a

Z-	Asp	Lys	VaI	Tyr	Leu	His	Pro	Phe
	NH2 I
H-	Asp	Lys	VaI	Tyr	Leu	His	Pro	Phe
H-	Asp	Lys	VaI	Tyr	Leu	His	Pro	Phe

-OCH,

Bei den obigen Acylierungen können die bekannten Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden Anwendung finden. Dabei müssen an der Reaktion nicht beteiligte freie Aminogruppen vorübergehend geschützt werden, insbesondere mittels durch Hydrolyse abspaltbare Reste, wie z. B. durch den Carbobenzyloxyrest. Die zu acylierenden Aminosäuren werden vorteilhaft in Form ihrer Ester verwendet. Als Acylierungsmethoden seien erwähnt die Umsetzung einer Säure mit dem entsprechenden Phosphitamid, wie z. B. mit dem entsprechenden Diäthylphosphitamid, die Reaktion einer Säure mit dem Amin in Gegenwart eines Carbodiimids, wie in Anwesenheit des 1-Cyclohexyl -3 -(2-morpholinyl- (4) -äthyl) -carbodiimids, und insbesondere die Umsetzung eines Amins mit einem aktivierten Ester, in dem als aktivierender Substituent in der Alkoholkomponente vorteilhaft die Cyan- oder Nitrogruppe vorhanden ist.

Die Umwandlung einer geschützten Aminogruppe in eine freie Aminogruppe sowie die Überführung einer funktionellen abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der verschiedenen Polypeptide und insbesondere in den verfahrensgemäß erhaltenen Oktapeptiden erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.

Die Verfahrensprodukte lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden.

Die verfahrensgemäß erhaltenen Polypeptide und ihre Salze können als Zwischenprodukte zur Herstellung von Arzneimitteln oder auch als Heilmittel in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale, parenteral oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial.

In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben. Beispiel 1 bezieht sich auf die Herstellung des L-Asparaginyl-(und L - Asparagyl) - L - arginyl -L- valyl -L- tyrosyl -L- leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine (vgl. Fig. 1), Beispiel 2 auf L-Asparaginyl-(und Asparagyl) - l - arginyl - l Fig. 5

leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl - l -histidyl-L-prolyl-L-phenyl alanin (vgl. Fig. 2), Beispiel 3 auf L-Asparaginyl-(und L-Asparagyl)-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin (vgl. Fig. 3), Beispiel 4 auf L-Asparaginyl-(und L-Asparagyl)-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl - l - histidyl - l - prolyl-L - phenylalanin (vgl. Fig. 4) und Beispiel 5 auf L - Asparaginyl -L- lysyl - l - valyl - l - tyrosyl - l -leucyl-L - histidyl -L- prolyl - l - phenylalanin (vgl. Fig. 5).

Folgende Abkürzungen werden verwendet:

H-VaI-OH =
H-Leu-OH =
H-Ileu-OH =
H-Asp-OH =
H-ASp-NH₂=
H-Arg-OH =
H-Lys-OH =
H-Pro-OH =
H-Tyr-OH =
H-Phe-OH =
H-His-OH =
Z =

L-Valin

L-Leucin

L-Isoleucin
■■ L-Asparaginsäure
■■ L-Asparagm
: L-Arginin

L-Lysin

L-Prolin

L-Tyrosin

L-Phenylalanin

L-Histidin

Carbobenzoxy

Beispiel 1 (vgl. Fig. 1)

a) Z-.

10,0 g Nitro-L-arginin-methylester-hydrochlorid (0,0371 Mol) werden fein pulverisiert, einige Stunden bei 60° im Hochvakuum getrocknet und in 100 ml absolutem Dioxan suspendiert. Nach Zusatz von 9,0 g (0,089 Mol) Triäthylamin wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, auf +10° abgekühlt und 7,1 g (0,0408MoI) Diäthylchlorphosphit (etwa 98%ig), gelöst in 20 ml Dioxan, zugetropft. Nach 1 Stunde Rühren bei Raumtemperatur wird das gebildete Triäthylammoniumchlorid abfiltriert, mit wenig Dioxan nachgewaschen und das Filtrat bei 80° im Vakuum eingedampft. Der gebliche, zähe Rückstand wird mit 40 ml Diäthylphosphit und 9,85 g (0,0371 Mol) gut getrocknetem N-Carbobenzyloxy-L-asparagin 2 Stunden bei 80° gehalten (homogene Lösung). Zuletzt wird das Lösungsmittel bei etwa +50° im Hochvakuum abgedampft, der ölige Rückstand, der immer noch

209 520/429

11 12

etwa 5 g Diäthylphosphit enthält, in 60 ml 2 η-Salz- stehengelassen. Das ausgeschiedene Gemisch von säure aufgenommen und dreimal mit je 600 ml Essig- Dicyclohexylharnstoff und dem Reaktionsprodukt ester extrahiert. Die Essigesterextrakte werden nach- wird abfiltriert und das Dipeptidderivat aus diesem einander noch zweimal mit 2 η-Salzsäure, zweimal mit Gemisch mit Essigester extrahiert. Die ursprüngliche gesättigtem Natriumbicarbonat und zweimal mit 5 Reaktionslösung wird im Vakuum eingedampft, der Wasser gewaschen (Volumen der wäßrigen Lösungen Rückstand in Essigester gelöst, diese Lösung mit je 60 ml, immer mit Natriumsulfat gesättigt). Nach 2 n-Salzsäure, 2n-Natriumhydrogencarbonatlösung Trocknen mit festem Natriumsulfat und Eindampfen und Wasser gewaschen, getrocknet und mit der obigen im Vakuum erhält man 9,9 g einer größtenteils Essigesterlösung des ursprünglich ausgeschiedenen kristallinen Masse. Sie wird mit 100 ml heißem Wasser io Reaktionsproduktes vereinigt. Der beim Eindampfen zerrieben, erkalten gelassen und filtriert. Der Rück- im Vakuum erhaltene Rückstand kristallisiert bei stand Z-ASp(NHa)-ATg-(NOg)-OCH₃ wiegt nach Zugabe von Äther und liefert 74,5 g (84%) Z-VaI-Trocknen im Hochvakuum bei 80° 5,95 g (= 33% Tyr-OC₂H₅ vom F. 142 bis 145°. Durch Umkristallider Theorie) und weist einen F. von 150 bis 165° auf. sieren aus Aceton—Äther werden 68,6 g reines Modifikation: Die Kondensation kann auch in 15 Produkt vom F. 148 bis 149° erhalten; [«]§* = +33±1° Dioxan, ohne Gegenwart von Diäthylphosphit, aus- (c = 3,96 in Chloroform), geführt werden. Das bei der Bildung des Diäthyl-

phosphitamides von Nitro-L-argininmethylester ent- ' Z-Val-Tyr-ÜH

standene Triäthylammoniumchlorid wird abfiltriert 70,7 g (0,16MoI) Z-VaI-Tyr-O C₂H₅ werden in

und das Filtrat direkt mit N-Carbobenzyloxy-L-aspa- 20 300 ml Methanol gelöst und unter Rühren innerhalb ragin kondensiert: das Gemisch wird 2 Stunden unter 15 Minuten bei etwa 10° mit 400 ml 1 n-Natronlauge Rückfluß erhitzt, wobei ein Teil der Substanz als ölige versetzt. Die klare Reaktionslösung wird 2 Stunden Bodenschicht ungelöst bleibt. bei Raumtemperatur stehengelassen, dann im Vakuum

Die Ausbeute beträgt bei gleichen Ausgangsmengen von Methanol befreit und wenig festes Material ab-6,10 g Dipeptid vom F. etwa 145 bis 160° (34% der 25 filtriert. Beim Ansäuern des Filtrats mit verdünnter Theorie). Salzsäure scheidet sich das Z-Val-Tyr-OH in

u\ ry * z-KTtr \ α /χ_ΤΛ% _Λυ kristalliner Form aus und wird abfiltriert, mit Wasser

b) Z-ASP(NHj)-ATg(NO₁J-OH gewaschen und im Vakuum bei 50° getrocknet; F. 161

4,74g(0,0099Mol)Z-Asp(NH₂)-Arg(NO₂)-OCH₃ bis 163°. [«]? = +.26±1° (c = 4,02 in Pyridin). Die vom Schmelzpunkt 165 bis 170° wird mit 11,0 ml 30 Ausbeute beträgt 64,01 g (97 %). 1 η-Natronlauge versetzt und bei 22° 1 Stunde ge- \ 7 τ rr -nrvf

schüttelt. Nach etwa 15 Minuten ist die Hauptmenge ^ej ^ ^^{eu ais 3}

gelöst. Nach weiteren 15 bis 20 Minuten beginnt Ab- Zu einer Lösung von 16,9 g (0,1MoI) H-HiS-OCH₃

scheidung eines voluminösen Niederschlages (Natrium- und 21,6 g (0,105MoI) Dicyclohexylcarbodiimid in salz des Z-Asp(NH2)-Arg(NO₂)-OH). Der Nieder- 35 100 ml abs.Essigester und 20ml Acetonitril werden schlag wird durch Zugabe von 20 ml Wasser gelöst, 26,5 g (0,1 Mol) Z-Leu-OH, gelöst in 200 ml von einer Spur ungelöstem Material abfiltriert und abs. Essigester, auf einmal zugegeben und das bald zu dann Kohlendioxyd eingeleitet, bis das pH der Lösung einer Gallerte erstarrende Gemisch während 30Minuten 8,5 ist. bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Stehenlassen

Die wäßrige Phase wird sodann zweimal mit je 40 über Nacht wird aus der krümeligen Masse das 80 ml Essigester gewaschen, und die Essigesterlösungen Lösungsmittel so gut wie möglich abgesaugt (unter werden einmal mit wenig Natriumbicarbonatlösung mehrmaligem Zerreiben des Filterrückstandes mit ein gewaschen. wenig frischem Essigester) und im Vakuum bei 90°

Die wäßrige Phase und die Wasch-bicarbonatlösung getrocknet. Man erhält 47,8 g eines Gemisches von werden vereinigt, mit 2 η-Salzsäure auf ph = 1 45 Dicyclohexylharnstoff und Dipeptid, aus welchem gebracht, wobei sich amorphes Material abscheidet. letzteres mit drei Portionen von je 50 ml kaltem Letzteres wird durch viermaliges Ausziehen mit je Methanol herausgelöst wird. Die vereinigten Extrakte 250 ml Essigester in Lösung gebracht; die Essigester- enthalten noch geringe Mengen von Dicyclohexyllösungen werden zweimal mit wenig Natriumsulfat- harnstoff und werden durch Lösen in Methanol und lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und 5° erneutes Ausfällen mit Essigester—Petroläther gegeben beim Eindampfen 4,46 g teilweise kristallinen reinigt. Man erhält 29,3 gZ-Leu-His-0 CH₃ (70,5% Rückstand. Durch Kristallisation aus Acetonitril der Theorie) vom F. 131 bis 132°. werdeninsgesamt3,26gZ-Asp(NH2)-Arg(NO₂)-OH Aus dem Filtrat des Reaktionsgemisches werden

in Nadeldrusen vom F. 94 bis 98° erhalten (71% durch Extraktion mit 2n-Salzsäure noch 4,0 g Dider Theorie). Nach zweimaligem Umkristallisieren aus 55 peptid (9,5% der Theorie) vom F. etwa 120 bis 125° Acetonitril schmelzen sie bei 98 bis 101°; [x]_D = +10 gewonnen, das durch Umfallen aus Methanol—Essig- -£4° (c= 1,4 in Methanol). ester—Petroläther weitergereinigt werden kann.

Die Kristalle sind löslich in Methanol, Dimethyl- _v. .„ „„

formamid, heißem Acetonitril und heißem Wasser, *■> ^-LeU-HiS-JNM-JNW₂

schwer löslich in kaltem Wasser und Acetonitril, 60 10 g (0,024MoI) Z-LeU-HiS-OCH₃, in 40 ml Essigester, Tetrahydrofuran, Aceton; leicht löslich abs.Äthanol gelöst, versetzt man mit 3 ml Hydrazinin gesättigter Natriumbicarbonatlösung. hydrat und läßt während 2 Tagen bei Zimmertempe-

, . _ „ ratur reagieren. Das Lösungsmittel wird bei 40° im

cj /,-val-lyr-UC₂M_s Vakuum abgedampft und der Rückstand mit 100ml

Eine Lösung von 50,2 g (0,2 Mol) Z-VaI-OH und 65 Wasser verrieben. Nach 3stündigem Stehen bei 0° 41,8 g (0,2 Mol) H-Tyr-0C₂H₅ in 400 ml Acetonitril filtriert man vom kristallinen Niederschlag ab, wäscht wird mit 45,3 g (0,22 Mol) !,S-Dicyclohexylcarbodi- portionenweise mit 20 ml Wasser nach und trocknet imid versetzt und 5 Stunden bei Zimmertemperatur das rohe Hydrazid über Schwefelsäure und P₂O₅.

Die Kristallisation aus 100 ml siedendem Wasser gibt 6,8 g (68%) reines Z-Leu-His-NH-NH,, F. 168 bis 169°. [λ]? = -27±4° (c = 0,808 in Methanol) und [«]? = -52±4° (c = 0,733 in 1 n-HCl).

Das Hydrazid ist in kaltem Äthanol und Methanol, sowie in kalter 1 η-Salzsäure gut löslich, dagegen nur in warmem Aceton; in Essigester ist es unlöslich.

g) Z-Pro-Phe-OCHs

Zur Lösung von 1 g (0,004 Mol) kristallinem Z-Pro-OH in 15 ml absolutem Tetrahydrofuran gibt man bei

— 10° 0,61ml (0,0044MoI) Triäthylamin und nach 5 Minuten bei der gleichen Temperatur 0,42 ml (0,0044 Mol) Chlorameisensäureäthylester. Das Triäthylaminhydrochlorid fällt sofort als weißer kristalliner Niederschlag aus.

Die gleichzeitig bereitete und vom Triäthylaminhydrochlorid filtrierte Lösung vom H-Phe-OCH₃ aus 1,1g (0,0051MoI) H-Phe-OCH₃ ■ HCl und 0,71 ml (0,0055 Mol) Triäthylamin wird ebenfalls auf

— 10° gekühlt und zur Lösung des gemischten Anhydrids gegeben. Nach 2stündigem Stehen bei Zimmertemperatur filtriert man vom Niederschlag ab und verdampft das Lösungsmittel im Vakuum bei 40 bis 45°. Den wasserklaren Rückstand nimmt man in Essigester auf, wäscht viermal mit je 5 ml 1 n-Salzsäure, zweimal mit Wasser, viermal mit je 2 ml 2 n-Natriumhydrogencarbonatlösung und zum Schluß mit Wasser neutral. Die Essigesterlösung hinterläßt nach Eindampfen und Trocknen 1,8 g gelbliches Öl, das noch wenig Lösungsmittel enthält. Der rohe Z-Pro-Phe-OCH₃ wird sofort zum H-Pro-Phe-OCH₃ decarbobenzoxyliert.

h) H-Pro-Phe-OCH₃

2,46 g (0,006MoI) Z-Pro-Phe-OCH₃ werden in 40 ml Methanol gelöst, mit 6 Äquivalenten methanolischer Salzsäure und 0,6 g Palladiumkohle (10% Pd) versetzt und bei Raumtemperatur und Normaldruck hydriert (gebildetes Kohlendioxyd in Natronlauge absorbiert). Nach Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Die vom Katalysator abfiltrierte Lösung wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in wenig Aceton aufgenommen. Bei Zugabe von Äther scheidet sich das Hydrochlorid des H-Pro-Phe-OCH₃ kristallin aus; Ausbeute: 1,62 g (86%). Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Aceton—Äther schmilzt die Substanz bei 157 bis 158°; [txfi = —41±1° (c = 4,15 in H₈O).

Zur Überführung in den freien Ester wird eine Lösung von 1,10 g (0,0035 Mol) des Hydrochlorids in 1 ml Wasser mit Essigester überschichtet und bei 0° unter kräftigem Schütteln mit gesättigter Kaliumcarbonatlösung versetzt. Der Essigesterauszug wird getrocknet, im Vakuum eingedampft und der Rückstand bei 0,1 mm Hg getrocknet. Das erhaltene H-Pro-Phe-OCH₃ (0,98 g) ist ein in Wasser und Äther leicht lösliches öl, das direkt für weitere Umsätze geeignet ist.

i) Z-Leu-His-Pro-Phe-OCH₃

Die Lösung von 6,6 g (0,0158 Mol) Z-Leu-His-NH-NH₂ in 50 ml 1 η-Salzsäure wird einmal mit wenig Essigester extrahiert, die Essigesterlösung nochmals mit 5 ml 1 η-Salzsäure gewaschen und die vereinigten Salzsäurelösungen mit frischem Essigester überschichtet und auf 0° gekühlt. Hierauf versetzt man langsam mit einer auf 0° gekühlten Lösung von 1,14 g (0,0165MoI) Natriumnitrit in 5 ml Wasser, beläßt 5 Minuten und stellt die salzsaure Azidlösung mit 9 ml gesättigter Natriumcarbonatlösung phenolphthalein-alkalisch. Die wäßrige Phase wird noch zwei weitere Male unter Eiskühlung mit viel Essigester extrahiert, dann die Essigesterlösungen mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.

ίο Aus 5 g (0,016 Mol) H-Pro-Phe-OCH,, · HCl, in 50 ml trockenem Essigester suspendiert, wird durch Zugabe von 2,25 ml (0,0162MoI) Triäthylamin die Lösung des freien H-Pro-Phe-OCH₃ gewonnen. Diese Lösung kühlt man auf 0° ab und versetzt sie mit der nach obiger Vorschrift bereiteten Azidlösung.

Nach 18stündigem Stehen bei 0 bis 5° und 2 Stunden bei Zimmertemperatur dampft man im Vakuum bei 40° ein Drittel des Lösungsmittels ab, wäscht mit

1 η-Salzsäure, eiskalter 2 n-Natriumcarbonatlösung ao und mit Wasser neutral. Die Salzsäure-, Natriumcarbonat- und Wasserauszüge werden in zwei weiteren Scheidetrichtern nochmals mit viel Essigester gewaschen.

Nach dem Verdampfen des Essigesters erhält man 9,17 g (87%) Z-Leu-His-Pro-Phe-OCH, als amorphes Pulver.

Die multiplikative Verteilung nach Craig über 36 Stufen von 1,32 g Carbobenzyloxytetrapeptidester zwischen 80%igem Methanol und Chloroform—Tetrachlorkohlenstoff 1: 1 ergibt 1,2 g reines Produkt. Die Analysenfraktion zeigt nach einmaligem Umkristallisieren aus Methanol—Wasser F. 110 bis 115°, [«]* = -57±4° (c = 1,031 in Methanol).

Z-Leu-His-Pro-Phe-OCHs ist in Alkohol, Methanol, Aceton, Essigester und ganz verdünnter Salzsäure gut löslich; in Petroläther und Äther dagegen unlöslich.

j) H-Leu-His-Pro-Phe-OCHs

3,4 g (0,005MoI) Z-Leu-His-Pro-Phe-OCH₃ in 30 ml abs. Methanol werden unter Zugabe von

2 Äquivalenten methanolischer Salzsäure in Gegenwart von 600 mg Palladium-Kohle (10% Pd) bei Zimmertemperatur bis zum Stillstand hydriert. Nach etwa 1 ³U Stunden ist ein wenig mehr als die berechnete Menge aufgenommen. Der Katalysator wird abfiltriert und die Lösung bei 40° im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 5 ml eiskaltem Wasser gelöst, mit 50 ml gekühltem Chloroform überschichtet und mit gesättigter Kaliumcarbonatlösung phenolphthaleinalkalisch gestellt. Die wäßrige Lösung wird noch zwei weitere Male mit je 20 ml Chloroform extrahiert, die organischen Phasen mit konz. Natriumsulfatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels bleiben 2,68 g amorpher Tetrapeptidester zurück, die direkt für die weitere Umsetzung verwendet werden.

k) Z-Val-Tyr-Leu-His-Pro-Phe-OHC₃

Die Lösung von 2,1 g (0,005 Mol) Z-Val-Tyr-OH in 10 ml trockenem Acetonitril versetzt man mit 1,16 g (5% Überschuß) Dicyclohexylcarbodiimid und der Lösung von 2,68 g (0,005 Mol) H-Leu-His-Pro-Phe-OCHg in 10 ml Acetonitril. Dabei scheidet sich

6g der Dicyclohexylharnstoff momentan aus. Nach etwa 5 Stunden beginnt die Abscheidung des N-Carbobenzoxy-hexapeptidesters als gallertige Masse. Man läßt 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen und dampft

15 16

anschließend das Acetonitril bei 40° unter verminder- n) Η-Asp (NH₂)-Arg-Val-Tyr-Leu-His-

tem Druck ab. Den Verdampfungsrückstand digeriert Pro-Phe-OCH₃ man mit 10 ml eiskaltem Methanol und wäscht fünf

weitere Male mit je 1 ml gekühltem Methanol nach. 410 mg (0,33 mMol) Z-Asp(NH₂)-Arg(NO₂)-Das Methanol wird im Vakuum abgedampft und der 5 Val-Tyr-Leu-His-Pro-Phe-OCHs werden in Rückstand in Chloroform dreimal mit 2 n-Salzsäure 10 ml Methanol suspendiert und durch Zugabe von (5 und zweimal 2 ml), fünfmal mit je 2 ml eiskalter 1 ml 1,39 n- (4 Äquivalente) Salzsäure in Methanol in Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser neutral Lösung gebracht. Man nitriert die flockigen Vergewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung unreinigungen ab und hydriert die Lösung in Gegenwird auf die Hälfte eingeengt und einmal kurz mit io wart von 250 mg Palladium-Kohle (10% Pd) unter Aktivkohle aufgekocht. Normalbedingungen. (Das gebildete Kohlendioxyd

Vollständiges Abdampfen des Lösungsmittels gibt wird in einem zweiten Hydriergefäß mit verdünnter

4,2 g rohen N-Carbobenzoxy-hexapeptidester, der Natronlauge absorbiert.) Nach 4V₂ Stunden und

noch mit wenig Dicyclohexylharnstoff verunreinigt ist. Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Menge

Der rohe Carbobenzoxyester wird in wenig kaltem 15 Wasserstoff ist die Hydrierung beendet. Der Kataly-

Aceton gelöst, vom restlichen Dicyclohexylharnstoff sator wird abfiltriert und die Lösung im Vakuum bei

abfiltriert und mit viel Äther wieder ausgefällt. 40° zur Trockne eingedampft. Man erhält 360 mg

Man erhält 3,7 g (79%) Z-Val-Tyr-Leu-His- Harz (406 mg berechnet für Trihydrochlorid und die

Pro-Phe-OCH₃. äquimolare Menge Ammoniumchlorid).

Das Analysenpräparat zeigt nach zwei weiteren 2° Das Produkt wird ohne weitere Reinigung weiter-

Reinigungen aus Aceton — Äther F. 142 bis 147°/149°; verarbeitet. Es ist in Wasser und Methanol gut löslich. [tx]f = -60 ±4° (c= 1,291 in Methanol).

o) H-AspiNH^-Arg-Val-Tyr-Leu-His-

1) H-Val-Tyr-Leu-His-Pro-Phe-OCH₃ Pro-Phe-OH

Zu 970 mg (~ 0,001 Mol) Z-Val-Tyr-Leu-His- 360 mg rohes H-Asp(NH₂)-Arg-Val-Tyr-

Pro-Phe-OCH₃ gibt man 6 ml einer ungefähr Leu—His-Pro-Phe-OCH₃· 3 HCl werden in 10 ml 2 η-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig. Dabei 66%igem Methanol gelöst und in Portionen mit ballt sich die Substanz zu einer klebrigen Masse V₁₀ η-Natronlauge versetzt, so daß der pjs-Wert der zusammen. Nach lstündigem Rühren mit einem 3° Lösung während 20 Minuten bei 10,5 bis 11 bleibt Magnetrührer tritt klare Lösung ein; man läßt noch (Totalverbrauch an V10 n-Natronlauge == 18,5 ml), eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur reagieren, Hierauf bringt man die Lösung mit festem Kohlendampft anschließend den Eisessig im Vakuum bei 40° dioxyd auf pn = 7 bis 8 und filtriert von den ausab und verreibt den Rückstand zweimal mit abs. Äther. geschiedenen Verunreinigungen ab (10 bis 20 mg), Das körnige Dihydrobromid des H-Val-Tyr-Leu- 35 dampft das Methanol im Vakuum bei 35° weitgehend His-Pro-Phe-OCH₃ löst man in 10 ml Wasser, ab und stellt die Lösung mit 2 n-Natriumcarbonatzieht die wäßrige Lösung einmal mit wenig Essigester lösung auf psc = 9.

aus, wäscht die Essigesterphase noch einmal mit 2 ml Die wäßrige Lösung wird viermal mit je 100 ml

Wasser und befreit die vereinigten Wasserlösungen im wassergesättigtem n-Butanol ausgezogen, die Butanol-Vakuum von gelöstem Essigester. Mit 2 n-Natrium- 40 auszüge einmal mit 10 ml Natriumsulfatlösung bicarbonatlösung stellt man die gekühlte Lösung auf gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Der Ph 8, filtriert vom abgeschiedenen Hexapeptidester ab Verdampfungsrückstand wird dreimal mit je 3 ml und wäscht mit Eiswasser neutral. Das getrocknete trockenem Butanol gewaschen, wodurch sich 50 mg Produkt (730 mg = 89%) zeigt^F. 130 bis 140° und leicht lösliche Anteile entfernen lassen, läßt sich aus Chloroform — Äther reinigen. [<x\f 45 Man erhält 190 mg H-Asp(NH₂)--Arg-Val-Tyr- = —53 ±4° (c = 0,636 in Methanol). Leu-His-Pro-Phe-OH als feines leichtgraugefärbtes

Pulver, das in Wasser und Methanol gut löslich ist.

m) Z-Asp (NH₂)-Arg(NO₂)-Val-Tyr-Leu- Eine Probe des Rohproduktes zeigt an der Ratte

His-Pro-Phe-OCH₃ ^eme gleich starke Wirkung wie Noradrenalin.

760 mg (0,96 mMol) H-Val-Tyr-Leu-His-Pro- ^ P) H-Asp(OH)-Arg-Val-Tyr-Leu-His-Phe-OCH₃ und 1,35 g (2,88 mMol) Z-ASp(NH₂)- Fro-ine-UH

Arg(NC>2)-OH in 10 ml Dimethylformamid versetzt 2,08 g (1,75 mMol) einmal aus Methanol — Aceton

man mit 690 mg (2,9 mMol) l-Cyclohexyl-3-(morpho- umgefälltes H-Asp(NH2)-Arg-Val-Tyr-Leu-Hislinyläthyl)-carbodiimid und läßt 2 Tage bei Zimmer- 55 Pro-Phe-OCH₃ · 3 HCl erwärmt man in konz. Salztemperatur reagieren. Hierauf wird das Dimethyl- säure während 85 Minuten auf 37°. Nach etwa formamid im Hochvakuum entfernt und das zurück- 10 bis 15 Minuten tritt klare Lösung ein. Die Salzbleibende Öl fünfmal mit je 5 ml Wasser unter Eis- säure wird rasch unter vermindertem Druck bei 25° kühlung verrieben, wobei es teilweise flockig wird. abgedampft und der Rückstand über Kaliumhydroxyd

Das Rohprodukt, 2,4 g, wird zur weiteren Reinigung 60 und Phosphorpentoxyd im Hochvakuum getrocknet, wiederholt mit viel eiskaltem Aceton und Methanol Die Ausbeute ist 2 g amorphes H-Asp(OH)-Arg-

gewaschen und ergibt 250 mg Carbobenzoxy-okta- Val-Tyr-Leu-His-Pro-Phe-OH · 3 HCl, das noch peptidester. Aus den Aceton- und Methanolauszügen mit Ammoniumchlorid verunreinigt ist. werden noch weitere 180 mg Carbobenzoxy-okta- 1,26 g des Rohproduktes werden in 20 ml Äthanol

peptidester gewonnen. 6g gelöst und das Peptid mit 120 ml Aceton wieder

DasroheZ-Asp(NH₂)-Arg(NO₂)-Val-Tyr-Leu- ausgefällt. Zwei weitere Umfällungen ergeben 1,08 g His-Pro-Phe-OCH₃ (430 mg) zeigt F. 175 bis 190° weißes, körniges Oktapeptid-trihydroehlorid. Im Tier- und wird direkt für die Weiterverarbeitung benutzt. versuch zeigt das ungefällte Produkt die gleiche

und

Aktivität wie Noradrenalin (Test nach Peart) die doppelte Wirkung an der nierenlosen Ratte.

Eine Probe (200 mg) des umgefällten H-Asp(OH)-Arg-Val-Tyr-Leu-His-Pro-Phe-OH · 3 HCl wird nach Craig über 30 Stufen zwischen n-Butanol und 0,3 cm³ Ammoniumacetat 1: 1 (pH = 6,5 bis 7) verteilt. G = 0,67. Die Lösungen dampft man im Vakuum bei 40° ein und sublimiert das Ammoniumacetat im Hochvakuum bei 40° während 30 Minuten ab.

71,5 g (0,27 Mol) Z-Ileu-OH, gelöst in 700 ml Essigester, zugefügt. Es tritt sofort leichte Erwärmung und bald darauf Abscheidung von kristallinem Dicydohexylharnstoff ein. Es wird kurze Zeit mit Eis gekühlt, so daß die Temperatur nicht über etwa +30° steigt. Nach einigen Minuten entsteht aus dem Gemisch eine gallertige Masse, die über Nacht bei Raumtemperatur belassen wird.
Das Gemisch wird filtriert, der Rückstand noch

Die Fraktionen 7 bis 16 (Maximum Fraktion 12) io zweimal mit je 50 ml Essigester zerrieben, abgesaugt

zeigen im Pearttest die gleiche Aktivität wie das unverteilte Produkt.

Die Ammoniak und Gesamtstickstoffbestimmungen zeigen, daß das Asparagin bei der sauren Verseifung zur Hauptsache zur Asparaginsäure verseift wurde. Qualitative Halogenproben zeigen, daß das Oktapeptid als Mono- oder Dihydrochlorid vorliegt.

Beispiel 2 (vgl. Fig. 2)

a)Z-Leu-Try-OCH₃ 940 mg (3,5 mMol) Z-Leu-OH löst man in 10 ml

absolutem Tetrahydrofuran, gibt 800 mg (10% Überschuß) Dicyclohexylcarbodiimid zu und anschließend 690 mg (3,5 mMol) H-Tyr-OCH₃, gelöst in 15 ml abs. Tetrahydrofuran. Man läßt über Nacht reagieren, filtriert vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab und dampft das Lösungsmittel im Vakuum bei 40° ab. Den Verdampfungsrückstand wäscht man in Essigester mit 1 η-Salzsäure, Wasser, 2n-Natriumbicarbonatlösung und Wasser neutral, trocknet die Essigesterlösung über Natriumsulfat und verdampft das Lösungsmittel im Vakuum. Man isoliert 1,4 g (90 %) rohen Carbobenzoxy-dipeptidester. Zweimaliges Umfallen des Rohesters aus Essigester—Petroläther ergibt reinen, aber amorphen Z-Leu-Tyr-OCH₃. [«]£ = _14 ± 4° (c = 1,108 in Methanol).

Der gleiche, nach der gemischten Anhydridmethode hergestellteZ-Leu-Tyr-OCH₃zeigt[a]f = -11 ±2° (c = 1,631 in Äthanol).

b) Z-Leu-Tyr-OH

Zu 2,37 g (5,3 mMol) Z-Leu-Tyr-OCH₃ gibt man 13,5 ml 1 η-Natronlauge, schüttelt bis zur vollständigen Lösung durch (5 Minuten) und verseift 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Die alkalische Lösung wird einmal mit 5 ml Essigester ausgezogen, die organische Phase noch einmal mit wenig Wasser gewaschen und die vereinigten wäßrigen Lösungen unter Vakuum während 10 Minuten vom Essigester befreit. Mit 13,5 ml ln-Salzsäure wird das Carbobenzoxydipeptid als klebrige Masse ausgefällt, die im Eiskasten erstarrt, bei Zimmertemperatur aber wieder zerfließt. Man dekantiert von der Mutterlauge ab, wäscht den gummiartigen Rückstand dreimal gut mit Wasser durch und trocknet über Kaliumhydroxyd und Phosphorpentoxyd im Hochvakuum. Man erhält 1,9 g (80%) amorphes Z-Leu-Tyr-OH, das nicht kristallisiert werden konnte. Die multiplikative Verteilung (Craig-Grundprozeß)
Methanol als

chlor kohlenstoff 1:1 als untere Phase (K = 1,54) ergibt ebenfalls ein nicht kristallines Produkt.

und bei 90° im Vakuum getrocknet. Aus dem so erhaltenen Gemenge von Dipeptid und Dicyclohexylharnstoff wird ersteres mit einer Lösung von 25 ml konz. Salzsäure in 20 ml Wasser und 80 ml Methanol als Hydrochlorid herausgelöst und der Rückstand noch zweimal mit je 2 ml konz. Salzsäure in 10 ml Wasser und 20 ml Methanol nachgewaschen. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum zur Trockne eingedampft und aus Methanol—Essigester kristallisiert.Manerhält52,6 gDipeptidhydrochlorid(=44,6% der Theorie) vom F. 170 bis 172°, unter Zersetzung. Aus den Mutterlaugen werden durch weiteres Eindampfen und Verdünnen mit Essigester noch 39,1 g Hydrochlorid (33,1% der Theorie) vom F. 160 bis 165° (Zersetzung) gewonnen.

d) Z-IIeU-HiS-NH-NH₂

2,5g(0,0053 Mol)Z-Ileu-His-OCH₃ ■ HCl werden in 10 ml abs. Methanol mit 1,5 ml Hydrazinhydrat 1 Stunde unter Rückfluß gekocht. Das Lösungsmittel wird im Vakuum weitgehend abgedampft und der Verdampfungsrückstand mit 100 ml Eiswasser versetzt. Die anfänglich ölige Ausfällung kristallisiert nach kurzem Stehen bei 0°. Das Carbobenzyloxydipeptidhydrazid wird abfiltriert, mit viel Wasser gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Schwefelsäure getrocknet. Die Rohausbeute ist 1,82 g (83%)> einmaliges Umkristallisieren aus siedendem Wasser ergibt 1,6 g analysenreines Produkt; F. 186 bis 187°; [«]? =-51 ± 4° (c = 1,327 in ln-Salzsäure), [«]? = -22 ± 4° (c = 0,558 in Methanol).

Das Hydrazid ist leicht löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Essigester und 1 η-Salzsäure, schwer löslich in heißem Wasser und unlöslich in Benzol, Äther und Petroläther.

e) Z-Ileu-His-Pro-Phe-OCH₃

Die Lösung von 1,49 g (0,035 Mol) Z - lieu-His NH-NH₂ in 15ml ln-Salzsäure wird einmal mit wenig Essigester extrahiert, die Essigesterphase nochmals mit 3 ml 1 η-Salzsäure gewaschen und die vereinigten salzsauren Lösungen im Scheidetrichter mit Essigester überschichtet und mit Eis auf 0° abgekühlt. Hierauf tropft man langsam 275 mg (0,004 Mol) Natriumnitrit in 5 ml Eiswasser dazu, läßt 3 Minuten reagieren und stellt die salzsaure Azidlösung mit 3 ml gesättigter Kaliumcarbonatlösung phenolphthaleinalkalisch. Die wäßrige Lösung wird noch zwei weitere

über 30 Stufen zwischen 80%igem 60 Male unter Eiskühlung mit viel Essigester extrahiert Oberphase und Chloroform—Tetra- und die organischen Phasen mit Wasser neutral

gewaschen.

Die eiskalte, über Natriumsulfat getrocknete Azidlösung filtriert man in die frisch bereitete, auf 0° gekühlte und vom Triäthylaminhydrochlorid befreite Lösung von L-Prolyl-L-phenylalanin-methylester, hergestellt aus 1,24 g (0,004MoI) L-Prolyl-L-phenylalanin-methylester-hydrochlorid und 0,55 ml (0,004

209 520/429

c)Z-Ileu-His-OCH₃

ZueinerLösungvon44,0 g(0,26 MoI)H-HiS-OCH₃ in 50 ml Acetonitril werden 55,5 g (0,27 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 100 ml Essigester, und

I 125 942

19 20

Mol) Triäthylamin in 15 ml abs. Essigester [vgl. Bei- das Chloroform vollständig abgedampft. Einmaliges spiel 1, h)]. Umfallen aus Chloroform—Äther ergeben 1,7 g

Man läßt 18 Stunden bei 0 bis 5° und 2 Stunden bei (76 %) Carbobenzoxy-hexapeptidmethylester. Zimmertemperatur reagieren, dampft das Lösungs- Das Analysenpräparat zeigt nach dreimaligem

mittel bei 40° im Vakuum auf die Hälfte ein und 5 Umfallen aus Chloroform—Äther F. 139 bis 141°, wäscht mit 1 η-Salzsäure, eiskalter 2n-Natriumcarbo- [«■]? = —51 ± 4° (c = 1,87 in Methanol), natlösung und mit Wasser neutral; trocknet über

Natriumsulfat und verdampft den Essigester im h.) H-Leu-Tyr-Ileu-His-Pro-Phe-OCHg

Vakuum.

Die Ausbeute ist 2 g (85%) gelblich amorpher io 1,2 g (1,28 mMol) Z-Leu-Tyr-Ileu-His-Pro-Carbobenzyloxy-tetrapeptidester. Die 36stufige Ver- Phe-OCH₃ werden in 20 ml abs. Methanol, die teilung zwischen 80%igem Methanol und Chloro- 2 Äquivalente Salzsäure enthalten, in Gegenwart von form—Tetrachlorkohlenstoff =1:1:1 ergibt 1,6 g 300 mg Palladium-Kohle (10% Pd) hydrogenolytisch reinen Z-Ileu-His-PrO-PlIe-OCH₃. Die Analysen- gespalten. Nach 2 Stunden ist etwas mehr als die fraktion zeigt nach einmaligem Umfallen aus Me- 15 berechnete Menge Wasserstoff aufgenommen. Die thanol—Wasser F. 105 bis 110°: [a]f = —56° ± 4° vom Katalysator befreite Lösung dampft man im (c = 0,971 in Methanol). Vakuum bei 40° zur Trockne ein, löst den Rückstand

Der N-Carbobenzyloxy-tetrapeptidester ist in den in 10 ml eiskaltem Wasser und gibt zur klaren Lösung meisten organischen Lösungsmitteln, außer Äther und 2,6 mMol Natriumcarbonat, gelöst in 10 ml Wasser. Petroläther, gut löslich. 20 Der ausgeschiedene Hexapeptidester wird mit 25 ml

und zweimal mit 10 ml n-Butanol—Chloroform 1: 1 f) H-Ileu-His-Pro-Phe-OCHs extrahiert, die wäßrigen Phasen dreimal mit 5 ml

1. Dihydrobromid: 1,72 g (2,61 mMol) Z-Ileu- Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet His-Pro-Phe-OCHg werden mit 8,3 ml Ι,ΐη-Brom- und im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt, wasserstoff in Eisessig versetzt, worauf alsbald Lösung 25 Durch Zugabe von viel Äther fällt der Hexapeptideintritt. Nach 2stündigem Stehen bei 21 ° wird der Eis- ester quantitativ aus. Einmaliges Umfallen aus Chloroessig bei 0,1 mm Hg und 25° vollständig abdestilliert form—Äther ergibt 840 mg (81 %) amorphes Produkt, und das zurückbleibende Harz mit Äther zerrieben, F. 130 bis 140°. Das Produkt ist für die Weiterwobei es körnig wird. Das rohe H-Ileu-His-Pro- verarbeitung genügend rein.

Phe-OCHs · 2HBr wiegt 1,79 g, F. 130 bis 140°. 30

2. Freier Ester: 1,96 g (2,85 mMol) H-Ileu-His- i) Z-Asp(NH3)-Arg(NO₂)-Leu-Tyr-Ileu-His-Pro-Phe-OCHs-2HBr wird in wenig Wasser gelöst, Pro-Phe-OCH₃

eine geringe Trübung durch Waschen mit etwas Essigester entfernt, die wäßrige Lösung mit 50 ml Chloro- Zur Lösung von 802 mg (1 mMol) H-Leu-Tyrform versetzt und unter Eiskühlung gesättigte Kalium- 35 Ileu-His-Pro-Phe-OCH-j in 6 ml frisch destilliertem carbonatlösung zugegeben, bis das pH der wäßrigen Dimethylformamid gibt man 360 mg (1,5 mMol) Phase = 10 ist. Der ausgeschiedene Ester löst sich Dicyclohexylcarbodiimid und nach kurzer Zeit 710 mg beim Umschütteln glatt in der Chloroformphase. Die (1,5 mMol) Z-Asp(NH₂)-Arg(NO₂)-OH [vgl. Bei-Chloroformlösung wird einmal mit wenig gesättigter spiel 1, b)] in 6 mg Dimethylformamid. Man läßt über Natriumsulfatlösung gewaschen; Kaliumcarbonat- und 40 Nacht bei Zimmertemperatur reagieren, filtriert vom Natriumsulfatlösung werden mit weiteren 30 ml Dicyclohexylharnstoff ab und dampft das Lösungs-Chloroform nachgewaschen. Die Chloroformlösungen mittel im Hochvakuum bei 40° ab. Den schaumigen hinterlassen nach Trocknen mit Natriumsulfat und Rückstand trocknet man noch eine weitere Stunde bei Eindampfen 1,31g H-Ileu-His-Pro-Phe-OCH₃ 40° und 0,01 mm Hg, zerreibt ihn anschließend mit als Harz, das sofort weiterverarbeitet wird. Ausbeute 45 viel Essigester und trocknet das pulverige Produkt 88%. wieder im Hochvakuum. Zur weiteren Reinigung wird r TT- TM. ^r das Rohprodukt wiederholt mit viel Aceton und eisg)Z-Leu-Tyr-Ileu-His-Pro-Phe-OCH_{3 kaltem} Methanol gewaschen. Man gewinnt 280 mg

DieLösungvon 1,03 g(2,4mMol)Z-Leu-Tyr-OH (22%) N-Carbobenzyloxy-octapeptidmethylester; [vgl. Beispiel 1, b)] in 10 ml trockenem Acetonitril 50 F. 204 bis 206°.

versetzt man mit 520 mg (5% Überschuß) Dicyclo- „ ,_ΧΤττ^ _{A T} τ _T, „· „ hexylcarbodiimid und der Lösungvon l,38g(2,5mMol) ^ H-AspiNH^-Arg-Leu-Tyr-Ileu-His-Pro-H-Ileu-His-Pro-Phe-OCH₃ in 10 ml Acetonitril. Phe-OCH₃ Dabei scheidet sich der Dicyclohexylharnstoff momen- 210 mg (0,22 mMol) Z-Asp(NH2)-Arg(NO₂)-tan aus. Nach etwa 6 Stunden beginnt die Abscheidung 55 Leu-Tyr-Ileu-His-Pro-Phe-OCH-, werden in 30ml des N-Carbobenzoxy-hexapeptidesters als gallertige abs. Methanol in Gegenwart von 4 Äquivalenten Salz-Masse. Man läßt 2 Tage bei Zimmertemperatur in der säure und 200 g Palladium-Kohle (10% Pd) unter Dunkelheit stehen und dampft anschließend das Normalbedingungen hydriert. (Das gebildete Kohlen-Acetonitril bei 40° unter vermindertem Druck ab. Den dioxyd wird in einem zweiten Hydriergefäß mit ver-Rückstand digeriert man mit 5 ml eiskaltem Methanol, 60 dünnter Natronlauge absorbiert.) Nach etwa 17 Stunfiltriert vom Dicyclohexylharnstoff ab und wäscht den ist etwas mehr als die berechnete Menge Wasserdrei weitere Male mit je 1 ml eiskaltem Methanol nach. stoff aufgenommen. Der Katalysator wird abfiltriert, Das Methanol wird am Vakuum abgedampft und der die Lösung bei 40° auf ein kleines Volumen einge-Rückstand in Chloroform dreimal mit 2 ml 2n-Salz- dampft und mit viel Äther versetzt. Dabei scheidet säure, fünfmal mit 2 ml eiskalter Natriumbicarbonat- 65 sich das Trihydrochlorid des Oktapeptidesters neben lösung und mit Wasser gewaschen. Ammoniumchlorid als weißes körniges Produkt ab.

Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung wird Ausbeute 240 mg (270 mg berechnet für Trihydro-

kurz mit wenig Aktivkohle aufgekocht, filtriert und chlorid und äquimolare Menge Ammoniumchlorid).

21 22

Das Produkt wird ohne weitere Reinigung weiter- (2,68 g entsprechend 99 % der Theorie) und das Filtrat verarbeitet. Es ist in Methanol, Äthanol und Wasser zur Trockne verdampft. Das zurückbleibende H-VaI-gut löslich. Tyr-OCH₃ (Harz 4,61 g) wird sofort weiterver-

k) H-Asp(OH)-Arg-Leu-Tyr-Ileu-His-Pro- , ^arbeitet

Phe-OH ⁵ c) Z-Asp(NH₂)-Arg(NO₂)-Val-Tyi-OCH₃

100 mg H-Asp(NH₂)-Arg-Leu-Tyr-Ileu-His- 3,72 g (13 mMol) frisch bereitetes H-Val-Tyr-

Pro-Phe-OCH₃ werden in 2 ml konz. reiner Salz- OCH₃ und 5,47 g (11,8 mMol) Z-Asp(NH₂)-Argsäure 85 Minuten bei 37° gehalten. Die Salzsäure wird (N0₂)-0H [vgl. Beispiel 1, b)] werden in 35 ml rasch im Vakuum bei 25° abgedampft und der Rück- io Dimethylformamid gelöst und 2,52 g (12,3 mMol) stand über Natriumhydroxyd und Phosphorpentoxyd !,S-Dicyclohexylcarbodiimidzugegeben. Nach24Stungetrocknet. den bei 21 ° wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharn-

Zur Reinigung löst man das schaumige Rohprodukt stoff abgenutscht und das Filtrat bei 0,1 mm Hg und unter gelindem Erwärmen in 1,5 ml Äthanol und fällt 45° Badtemperatur vollständig vom Dimethylformdas Oktapeptid-trihydrochlorid mit 8 ml Aceton aus. 15 amid befreit. Das hinterbleibende öl wird zuerst mit Abzentrifugieren und Nachwaschen mit zwei Portionen Petroläther, dann unter Eiskühlung mit verdünnter zu 2 ml Aceton ergeben 90 mg H-Asp(OH)-Arg- Bicarbonatlösung, Wasser, verdünnter Salzsäure und Leu-Tyr-Ileu-His-Pro-Phe-OH · 3HCl. Wasser gewaschen, wobei das anfänglich ölige Produkt

An der nierenlosen Ratte zeigt es die 20fache Akti- langsam körnig wird. Das Rohprodukt (8,79 g) wird vität von Noradrenalin. 20 zur weiteren Reinigung aus heißem Methanol umge-

Durch Craig-Verteilung oder Chromatographie an fällt und das in Methanol unlösliche Pulver mit Papierpulver in geeigneten Lösungsmittelgemischen heißem Aceton verrieben. Dabei werden 2,91 g (33%) (z. B. Butanol—Methanol—0,33 m Ammoniumfor- Z - Asp (N H₂) - Arg (NO₂) - VaI - Tyr - O C H₃ vom miat oder sek.Butanol—3% Ammoniak 120:44) F. 202 bis 206° erhalten; [λ]f = —4±4° (c = 0,94 in kann H-Asp(OH)-Arg-Leu-Tyr-Ileu- His-Pro- 25 Dimethylformamid).

Phe-OH von H-Asp(NH₂)-Arg-Leu-Tyr-Ileu- _{d) Z}__Asp(NH₂)-Arg(NO₂)-Val-Tyr-OH

His-Pro-Phe-OH getrennt werden. ' ^{F v K 2} *

2,58 g (2,5 mMol) Z-Asp (N H₂)-Arg (N O₂)-VaI-

Beispiel 3 (vgl. Fig. 3) Tyr-OCH₃ werden in 30 ml Dimethylformamid ge-

. 30 löst und innerhalb 15 Minuten insgesamt 100 ml

a) Z-VaI-Iyr-OCH₃ 7₁₀n-Natronlauge in mehreren Anteilen zugegeben, Eine Lösung von 68,1 g (0,275 Mol) Z-VaI-OH wobei darauf geachtet wird, daß das pn der Lösung 11

und 50,9 g (0,261 Mol) H-Tyr-OCH₃ in 1 1 Tetra- nicht überschreitet. Nach Zugabe der Lauge wird hydrofuran werden versetzt mit 59,2 g 1,3-Dicyclo- weitere 15 Minuten bei p_H = 11 belassen, dann durch hexylcarbodiimid und die Lösung 16 Stunden bei 21° 35 Zugabe von festem Kohlendioxyd auf Ph = 8 gebracht belassen. Hierauf wird der ausgeschiedene Dicyclo- und die Lösung zuerst bei 11 mm und 45° Badtempehexylharnstoff abgenutscht (46,0 g entsprechend 77% ratur vom Wasser, dann bei 0,1 mm vom Dimethylder Theorie) (F. 218 bis 224°) und das Filtrat zur formamid befreit. Der Rückstand wird in 30 cm³ Trockne verdampft. Der Rückstand (zähes öl) wird Wasser gelöst, von einer Spur Flocken abfiltriert und mit 300 ml heißem Petroläther zerrieben, bis Kristalli- 40 das klare Filtrat unter Kühlung mit 2n-Salzsäure sation eintritt. Die Kristalle werden abgenutscht, mit angesäuert. Das ausgeschiedene, zähe Produkt wird viel heißem Petroläther gewaschen. Umkristallisation beim Verreiben (unter Eiskühlung) fest. Das Rohaus Aceton—Petroläther ergibt insgesamt 91 g (81 %) produkt (2,14 g) wird in heißem Methanol gelöst und Z-Val-Tyr-OCH₃, F. 144 bis 147°, [λ] ?= +19 ±4° durch Zugabe von Acetonitril ausgefällt. Es werden (c = 1,06 in Chloroform). 45 1,77 g (70%) Z-Asp(NH₂)-Arg(NO_?)-Val-Tyr-Aus der Petrolätherlösung sowie aus der Mutter- OH als Pulver erhalten, F. etwa 175 bis 183° (Auflauge obiger Kristalle werden insgesamt 17 g eines schäumen); [κ]" — 0 +_4° (c = 0,4 in Methanol).
Nebenproduktes gewonnen, F. 128 bis 130° (aus

Petroläther). Es handelt sich dabei um l-(Carbobenz- ^e> Z-Asp(NH₂)-Arg(NO₂)-Val-Tyr-Ileu-His-

oxy-L-valyl-)-l,3-dicyclohexyl-harnstoff. 50 Pro-Phe-OCH₃

MW v„i Tw nrv 1,88 g (2,58 mMol) Z-Asp(NH₂)-Arg(NO₂)-Val-

b) M-Val-lyr-OCJria Tyr-OH und 1,31g (2,5OmMoI) frisch bereiteter

1. Hydrobromid: 20,0 g (0,0468 Mol) Z-Val-Tyr- H-Ileu-His-Pro-Phe-OCH₃ [vgl. Beispiel 2, f] OCH₃ werden gelöst in 200 ml einer Ι,ΐη-Lösungvon werden gelöst in 15 ml Dimethylformamid und eine Bromwasserstoff in Eisessig. Nach 1 Stunde bei 21° 55 Lösung von 0,62 g (2,62 mMol) l-Cyclohexyl-3-morwird das Gemisch im Vakuum bei 45° Badtemperatur pholinyläthyl-carbodiimid zugegeben. Die Lösung zur Trockne eingedampft und das hinterbleibende Öl wird 21 Stunden bei 20° belassen, hierauf das Dimemit viel Äther zerrieben, wobei es erstarrt. Der Rück- thylformamid im Hochvakuum entfernt und das zustand wird mit Äther gewaschen; man erhält 17,26 g rückbleibende Öl mit Wasser unter Eiskühlung zer-(98%) H-Val-Tyr-OCH₃-HBr, F. 206 bis 208°. 60 rieben, wobei es allmählich körnig wird. Das Pulver Beim Umkristallisieren aus Methanol—Äther werden wird mehrmals mit Wasser, dann mit verdünnter Nadeln vom F. 208 bis 209° erhalten; [«]/>=+31 ±4° Bicarbonatlösung und Wasser gewaschen und ge-(c = 1,08 in Methanol). trocknet. Das Rohprodukt (3,70 g) wird zur weiteren

2. Freier Ester: 5,63 g (15 mMol) des unter 1 erhal- Reinigung mit Aceton und Methanol gewaschen und tenen Hydrobromids werden suspendiert in 80 cm³ 65 ergibt 0,68 g Z-Asp(NH₂)-Arg(NO₂)-Val-Tyr-Essigester und 2,1 cm³ (15 mMol) Triäthylamin züge- Ileu-His-Pro-Phe-OCH,,.. F. 190 bis 205°; [λ] f geben. Die ausgefallenen Kristalle von Triäthylamin- = —29 ± 4° (c = 0,52 in Dimethylformamid). Das hydrobromid werden nach 10 Minuten abgenutscht Produkt ist schwer löslich in den gebräuchlichen

23 24

organischen Lösungsmitteln außer in Dimethylform- Das Material aus den Fraktionen 9 bis 21 wird ver-

amid, löslich in sehr verdünnter Salzsäure. einigt und nochmals gleich wie oben verteilt. Aktivität

λ υ λ ,χι™-ν λ λ. , τ τι u·· γ, ^{findet sidl} wiederum j_n den Fraktionen 9 bis 22,

f) H-Asp(NH₂)-Arg-Val-Tyr-Ileu-His-Pro- _{welche insgeS}amt 32 mg Material enthalten (Maximum Phe-OCH_{3 5} i_n Fraktion 16). Die Fraktionen 0 bis 8 enthalten noch

370 mg (0,3 mMol) Z-AspiNBy-ArgiNcy-Val- 20 mg inaktives Material, die Fraktionen 23 bis 32 Tyr-Ileu-His-Pro-Phe-OCHg werden in 15 ml noch etwa 15 mg inaktives Material. Methanol suspendiert und durch Zugabe von 1,0 ml Eine Probe der Substanz aus Fraktion 16 erweist

l,24n- (4 Äquivalente) Salzsäure in Methanol in sich im obigen Test als fünf-bis zehnmal stärker wirk-Lösung gebracht. Eine Spur Flocken wird durch i° sam als Noradrenalin.

Filtration entfernt und die Lösung in Gegenwart von Das Material aus den Fraktionen 9 bis 22 wird

100 mg Palladium-Kohle (10°/₀ Pd) bei Zimmertempe- wieder vereinigt und im System n-Butanol—4% Essigratur und Normaldruck hydriert (unter Verwendung säure in 30 Schritten verteilt (Craig-Grundprozeß). eines zweiten, mit verdünnter Natronlauge gefüllten Nach Beendigung des 30. Verteilungsschrittes wird das Hydriergefäßes zur Absorption des entwickelten 15 Ph aller Fraktionen durch Zugabe von etwas metha-Kohlendioxyds). Die Hydrierung ist nach 13 Stunden nolischer Ammoniaklösung auf 5,5 bis 6,0 gebracht, und Aufnahme von etwas mehr als der berechneten die Lösungen bei 40% und vermindertem Druck zur Menge Wasserstoff beendet. Die Lösung wird hierauf Trockene verdampft und die Eindampfrückstände zur vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum zur Entfernung von Ammoniumacetat 8 Stunden bei 50° Trockne eingedampft. Der Rückstand (Harz) wiegt 20 und 0,01 mm Hg getrocknet. Die Fraktionen 0 bis 6 310 mg [berechnet für ein Gemisch aus äquimolaren enthalten insgesamt 30 mg Substanz (Maximum bei Mengen Trihydrochlorid des H-Asp-(NH₂)-Arg- Fraktion 1, K= 0,051); die Fraktionen 7 bis 30 ent-Val-Tyr-Ileu-His-Pro-Phe-OCH₃ und Ammo- halten keine wägbaren Anteile. Die experimentell geniumchlorid = 360 mg]. Das Produkt wird ohne fundene Gewichtsverteilungskurve in den Frak-Reinigung weiterverarbeitet. Es ist leicht löslich in 25 tionen 0 bis 6 stimmt mit der theoretisch berechneten Wasser, aber schwer löslich in wäßrigem Alkali, löslich überein. Eine Probe der Substanz aus Fraktion 1 zeigt in Methanol, unlöslich in Äther. im oben angegebenen Test von Peart eine fünfmal

. _A , _ „ _TT. _ stärkere Wirksamkeit als Noradrenalin. Das so ge-

g) H-Asp(NH₂)-Arg-yal-Tyr-Ileu-His-Pro- _{reinigte H} - ASp(NH₂) - Arg - VaI-Tyr-Heu-His Phe-OH ₃₀ Pro-Phe-OHwirdinForrneinesfarblosenPulverser-

Zur Lösung von 256 mg (25 μ. Mol) H-Asp(NH₂)- halten; F. (nach Trocknen im Hochvakuum) 195 bis Arg-Val-Tyr-Ileu-His-Pro-Phe-OCH₃inl2,0cm³ 205° (Zersetzung). Im Papierchromatogramm zeigt es 66 % Methanol wird in mehreren Anteilen 0,1 n-Na- in den Systemen Äthanol—n-Butanol—Wasser Ditronlauge zugegeben, bis der pH-Wert der Lösung äthylamin (100:100:50:20), n-Butanol—Aceton— während 20 Minuten bei 10,5 bis 11,0 bleibt (total 35 Wasser—Diäthylamin (100:100:50:20), Äthanol— 18 ml 0,1 η-Natronlauge zugegeben). Nach insgesamt n-Butanol—Wasser (100:100:50), n-Butanol—Eis-30 Minuten wird durch Zugabe von etwas festem essig—Wasser (100: 10, ges. mit Wasser) und sek.Bu-Kohlendioxyd auf ph = 8 gebracht, eine flockige tanol—3 % Ammoniak (120: 44) auf Whatmann Nr. 1 Fällung (25 mg) durch Filtration entfernt und das die Rf-Werte 0,37, 0,31, 0,18, 0,15 und 0,24. Die Filtrat im Vakuum von Methanol befreit. Die wäßrige 40 Flecken zeigen die Pauly-Reaktion: auf dem Papier Lösung (Volumen 15 ml) wird mit ImI verdünnter sind keine ninliydrinpositiven Substanzen nachweisbar. Natriumcarbonatlösung versetzt und bei p_H = 9 vier- ,_Λτ. . ... „ _{TT T},. _.

mal mit je 100 ml wassergesättigtem n-Butanol ausge- ^h) H-Asp(OH)-Arg-yal-Tyr-Ileu-His-Pro-

schüttelt. Die Butanolauszüge werden einmal mit

8 ml verdünnter Natriumsulfatlösung gewaschen, mit 45 5 mg H-AspiNH^-Arg-Val-Tyr-Ileu-His-Pro-Natriumsulfat getrocknet und geben beim Eindampfen Phe-OH werden in 0,1 ml fconz.Salzsäure gelöst und 195 mg Rohprodukt. Dieses wird dreimal mit je 5 ml 100 Minuten bei 39° stehengelassen. Dann wird die trockenem n-Butanol gewaschen, wodurch sich 30 mg Lösung im Hochvakuum zur Trockne verdampft, leichter lösliche Anteile entfernen lassen. Die Haupt- der Rückstand pulverisiert und bei 40° im Hochmenge (135 mg) H-Asp(NH₂)-Arg-Val-Tyr-Ileu- 50 vakuum getrocknet. Das entstandene H-Asp(OH)-His-Pro-Phe-OH ist in trockenem Butanol schwer Arg-Val-Tyr-Ileu-His-Pro-Phe-OH (Hypertenlöslich und wird in Form eines farblosen, feinkörnigen sin II) kann durch Craigverteilung oder Chromato-Beschlages erhalten. Das Produkt ist löslich in Wasser graphie an eine Zellulosesäule mit geeigneten Lösungsund Methanol, mittelspektren, z. B. Butanol—Methanol—0,33 m Am-Das Rohprodukt (135 mg) wird einer 32stufigen 55 moniumformiat (3:1: 4; pH = 6,5) oder sek. Butamultiplikativen Verteilung (Craig-Grundprozeß) im nol —3 % Ammoniak (120: 44) von nicht verseiftem System n-Butanol—Wasser unterworfen. Die Haupt- Ausgangsmaterial abgetrennt werden. Wasserlösliches, menge (75 mg) des wirksamen Materials befindet sich farbloses Pulver, Rf = 0,2 im System sek. Butanol— in den Fraktionen 9 bis 21 mit einem Maximum bei 3% Ammoniak (130: 44). Fraktion 15 (G = 0,89). Die Fraktionen 0 bis 8 ent- 60 . . halten 45 mg einer langsamer wandernden, inaktiven Beispiel 4 (vgl. Fig. 4) Verunreinigung; die Fraktionen 22 bis 32 enthalten a) Z-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OCHg etwa 20 mg inaktives Material. Eine Probe der Sub- 1,95 g (0,003 Mol) Z-Val-Tyr-Val-His-OH stanz aus Fraktion 15 wirkt an der Ratte in der Ver- (vgl. Patentanmeldung C 15417 TVb/12q) werden in Suchsanordnung von Peart zweimal so stark wie 65 10 ml Dimethylformamid suspendiert und mit 0,83 g Noradrenalin (0,25 -//kg in 0,1ml physiologischer (0,003 Mol) H-Pro-Phe-0CH₃ [vgl. Beispiel 1, h)] Natriumchloridlösung intravenös entsprechen 0,5 γ und 0,84 g (0,0035 Mol) l-Cyelohexyl-3-morpholinyl-Noradrenalin). äthyl-carbodiimid versetzt. Nach 1 Stunde ist das

25 26

Ausgangsmaterial vollständig gelöst. Die Reaktions- Methanol gewaschen. Das so gereinigte Material

lösung wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehen- (289 mg, 67%) ist ein schwachgelbliches Pulver vom

gelassen, dann bei 0,1 mm Hg vom Dimethylform- F. 207 bis 210°.

amid befreit und der Rückstand mit Eiswasser ver- Zur weiteren Reinigung wird die Substanz im setzt. Das ausgeschiedene feste Material wird zweimal 5 Gegenstrom zwischen n-Butanol und O,l%iger Essigmit 2n-Salzsäure gewaschen (wobei das Reaktions- säure über 30 Schritte verteilt (K =4,17). Die Frakprodukt ein Hydrochlorid bildet, das in Wasser tionen 23 bis 28 liefern 132 mg reines Produkt, und löslich ist, jedoch nicht in 2n-Salzsäure), durch Be- die ein Nebenprodukt enthaltenden Fraktionen 17 handlung mit 0,5n-Kaliumcarbonatlösung wieder in bis 22 (74 mg) ergeben nach nochmaliger Verteilung die basische Form übergeführt, mehrmals mit Wasser io weitere 34 mg reines Material; total 166 mg (39%)· gewaschen und im Vakuum bei 35° getrocknet. Das Nach zweimaligem Umfallen aus Methanol schmilzt erhaltene Rohprodukt (2,40 g) wird in 100 ml Aceton die Substanz bei 214 bis 216°; [a]f = -27±2° aufgenommen, von unlöslichem Material (0,30 g) (c = 2,22 in Dimethylformamid),
abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand ergibt nach Verreiben mit Essigester 1,57 g 15 d) H-AspiNH^-Arg-Val-Tyr-Val-His-(58%) festes Material vom F. 151 bis 156°. Pro-Phe-OCH₃

1 g dieser Substanz wird zur weiteren Reinigung

durch Gegenstromverteilung im System Methanol— 85 mg (0,07 mMol) Z-ASp(NHJj)-A^(NO₂)-

Wasser 4:1 /Chloroform—Tetrachlorkohlenstoff 1:1 Val-Tyr-VaI-HiS-PrO-PlIe-OCH₃ werden in 10 ml

über 48 Schritte verteilt. Die Hauptmenge des Materi- 20 Methanol suspendiert, durch Zugabe von 0,3 m

als (0,84 g) befindet sich in Fraktionen 15 bis 28 mit Äquivalenten methanolischer Salzsäure in Lösung

einem Gewichtsmaximum in Fraktion 21 (K = 0,78). gebracht und in Gegenwart von 0,3 g Palladium-

Diese Fraktionen ergeben nach Umfallen aus Aceton Kohle (10% Pd) bei Zimmertemperatur und Normal-

0,66 g amorphes Material vom F. 158 bis 162°. druck während 15 Stunden in einer Wasserstoff-

Nach nochmaligem Umfallen aus viel Aceton zeigt die 25 atmosphäre geschüttelt. Die neutrale Lösung wird

Substanz F. 161 bis 163° und [<x]f —56±2° (c = 1,38 vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum ein-

in Äthanol). gedampft. Das halbfeste Reaktionsprodukt wird mit

b) H-Val-Tvr-Val-His-Pro-Phe-OCH, Aceton gewaschen und ergibt nach Umfallen aus

Methanol — Äther 51 mg (63%) Tnhydrochlorid des

635 mg (0,7 mMol) Z-Val-Tyr-Val-His-Pro- 30 Oktapeptidmethylesters.
Phe-OCH₃ werden mit 1 ml Eisessig verrieben, bis

eine einheitliche Lösung entsteht, und mit 1,9 ml _e) H-Asp(NH₂)-Arg-Val-Tyr-Val-His-

l,6n-Bromwasserstoff (3 mMol) in Eisessig versetzt. Pro-Phe-OH
Beim Stehen bei Zimmertemperatur beginnt sich das

Reaktionsprodukt nach 10 Minuten als öl auszu- 35 1. 48 mg (0,042 mMol) H-Asp(NH₂)-Arg-Val-

scheiden. Das Gemisch wird während 2,5 Stunden Tyr-Val-His-Pro-Phe-OCH₃ · 3 HCl werden in

geschüttelt und darauf bei 0,1 mm Hg und 30° voll- 0,5 ml Methanol suspendiert und innerhalb 1 Stunde

ständig eingedampft. Der Rückstand ergibt nach allmählich mit 0,3 ml 1 η-Natronlauge (etwa 7 Äqui-

Waschen mit Äther und Aceton 648 mg Dihydro- valente) versetzt, so daß die Lösung stets ein ph

bromid des Hexapeptidmethylesters als fast farbloses 40 zwischen 10,5 und 11,5 zeigt. Nach weiteren 30 Minu-

Pulver. ten wird die Lösung im Vakuum bei Raumtemperatur

Zur Überführung in den freien Ester wird eine vom Methanol befreit, mit 1 η-Essigsäure auf ph Lösung von 562 mg (0,6 mMol) dieser Substanz in = 7,4 eingestellt und lyophilisiert. Das als Rückstand 2 ml Wasser bei 0° mit gesättigter Kaliumcarbonat- erhaltene Gemisch von freiem Peptid und anorgalösung stark alkalisch gestellt und viermal mit je 45 nischen Salzen (79 mg) wird durch Gegenstrom-20 ml kaltem Chloroform extrahiert. Die Chloroform- verteilung im System Butanl — 0,1 n-Ammoniumauszüge werden mit wenig Wasser gewaschen, ge- hydroxyd fraktioniert. Das reine Octapeptid wird als trocknet und im Vakuum eingedampft. Der ölige farbloses Pulver erhalten, das in Wasser und Methanol Rückstand liefert beim Verreiben mit Äther 272 mg löslich ist, schwerer in Äthanol und unlöslich in (59%) des Peptidesters als schwachgelbes Pulver, 50 Aceton.

das direkt weiter umgesetzt wird. 2. 400 mg roher Oktapeptidmethylester (enthaltend

etwa 3 Mol HCl + 1 Mol NH₄Cl) werden in 4 ml

c) Z-AspiNH^-ArgtNOjO-Val-Tyr-Val- Methanol gelöst (klare, braungelbe Lösung) und nach

His-Pro-Phe-O C H₃ Zugabe von 8 ml 1 n-Kaliumcarbonat in Wasser bei

55 Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt. Zuletzt

Eine Lösung von 467 mg (1 mMol) Z-ASp(NH₂)- wird die Lösung, welche ein wenig braune Flocken als

Arg(NO₂)-OH [vgl. Beispiel 1, b)] und 272 mg Bodensatz enthält, mit 4 n-H Cl auf p_H = 6 neutrali-

(0,35mMol) H-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OCH₃ siert, mit Aceton — Kohlendioxyd gefroren und über

in 2,5 ml Dimethylformamid wird mit 237 mg Nacht im Hochvakuum lyophilisiert. Man erhält

(1 mMol) l-Cyclohexyl-S-morpholinyläthyl-carbodi- 60 dabei 930 mg eines bräunlichen Pulvers, das neben

imid versetzt. Nach 24stündigem Stehen bei Zimmer- dem Peptid etwa 590 mg Kaliumchlorid enthält,

temperatur wird die Reaktionslösung bei 0,1 mm Hg Die gesamte Menge wird über 30 Stufen verteilt

und 35° vom Dimethylformamid befreit. Der Rück- im System n-Butanol — 0,33m NH₄ COOH (Ammo-

stand wird mit Eiswasser verrieben und das abge- niumformiat) in Wasser (pH = 6,5). Phasenvolumen

schiedene feste Material mit Wasser gewaschen und 65 je 10 ml.

im Vakuum bei 30° getrocknet. Das Rohprodukt Das freie Oktapeptid zeigt G — 0,17 und wird aus

wird mit Aceton verrieben, darauf mit siedendem den vereinigten Röhrcheninhalten 0 bis 8 isoliert

Aceton extrahiert und schließlich mit eiskaltem durch dreimaliges Extrahieren mit je 400 ml eines

27 28

Butanol-Methanol-Gemisches (3: 1) und zweimaliges und das Toluolfiltrat im Vakuum zur Trockne

Waschen der organischen Lösung mit je 30 ml 5°/o verdampft, wobei das Diäthylphosphitamid des

Ammoniumformiat in Wasser. Nach Eindampfen bei H-Lys(Z)-OCH₃ als zähes Harz erhalten wird

45° (11mm Hg) und Trocknen im Hochvakuum (Gewicht 17,0 g). Es wird in 60 ml Diäthylphosphit (8 Stunden bei 40°) erhält man insgesamt 190 mg 5 gelöst, 10,9 g trockenes, feingepulvertes Z-Asp (N H)₂-

eines weißen, in Wasser leicht löslichen Pulvers, das OH (0,041 Mol) zugegeben und das Gemisch 1 Stunde

im biologischen Test an der nierenlosen Ratte eine auf 80° erwärmt, wobei das Z-Asp(NH₂)-OH nach

zwanzigmal stärkere Wirkung als Noradrenalin zeigt. wenigen Minuten in Lösung geht. Nach 1 Stunde

Im Papierchromatogramm erweist sich die Substanz wird das Diäthylphosphit unter vermindertem Druck als einheitlich, mit einem Rf-Wert = 0,19 im System 10 vollständig abdestilliert, das zurückbleibende Harz

sek. Butanol — 3% NH₃ (120:44). in viel Essigester aufgenommen und die Essigester-

AIs zweite Fraktion erhält man bei der Verteilung lösung mit verdünnter Salzsäure, Wasser, verdünnter

aus den Rohren 18 bis 30 (G = 42) noch 140 mg Sodalösung und Wasser gewaschen. Die Essigester-

unverseiftes Ausgangsmaterial zurück (Oktapeptid- phase hinterläßt nach Trocknen mit Natriumsulfat methylester). Rf-Wert im obigen System = 0,30. 15 und Eindampfen 13,0 g rohes Z-Asp(NH₂)-Lys(Z)-

3. 500 mg Oktapeptidmethylester (gleiches Aus- OCH₃ als gallertige Masse. Nach zweimaligem

gangsmaterial wie bei 1) werden in 2 ml konz. Salzsäure Umfallen aus Methanol — Äther werden 8,5 g des

gelöst und 100 Minuten bei 39° stehengelassen. Dann Produktes als flockiger Niederschlag erhalten; F. 152

wird die Lösung im Hochvakuum zur Trockne ein- bis 161°, Ausbeute 38% der Theorie, gedampft, der Rückstand fein pulverisiert und noch- 20

mais einige Stunden bei 40° im Hochvakuum getrock- ^) Z-Asd(NH )-Lvs(Z1-OH net. Man erhält so 510 mg eines hellbraunen Roh-

Produktes, das an der nierenlosen Ratte bereits die 5,00g (0,0092 Mol) Z-Asp(NH₂)-Lys(Z)-OCH₃

20fache Wirkung von Noradrenalin aufweist. vom F. 152 bis 161 ° werden gelöst in 60 ml Dimethyl-

Zur Reinigung werden 300 mg davon in 2 ml 25 formamid und portionenweise 0,1 η-Natronlauge zuWasser gelöst, mit 2 η-Natronlauge auf ph = 6 gegeben, bis der pH-Wert der Lösung während neutralisiert und über 30 Stufen verteilt im System 20 Minuten bei 10 bis 10,5 bleibt (insgesamt 140 ml n-Butanol — Methanol — 0,33 m Ammoniumformiat 0,1 η-Natronlauge zugegeben). Hierauf wird durch 3:1:4 (pH = 6,5), mit je 10 ml Phasenvolumen. Aus Zugabe von etwas festem Kohlendioxyd auf pH = 8 den Röhrchen 5 bis 14 können durch Aufarbeitung 30 gebracht und das Dimethylformamid-Wasser-Gemisch wie unter 1 170 mg Hydrolysat als farblose, in Wasser erst im Vakuum, dann im Hochvakuum auf ein kleines lösliche Substanz gewonnen werden, die sich an der Volumen eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser nierenlosen Ratte als zwanzig- bis fünfundzwanzigmal versetzt, wobei das Natriumsalz von Z-Asp(NH₂)-aktiver als Noradrenalin erweist. Im Papierchromato- LyS(Z)-OH als dicke, gallertige Masse ausfällt, gramm tritt im System sek. Butanol — 3 % Ammoniak 35 Es wird durch Zugabe von viel Wasser (etwa 200 ml) (120: 44) eine Aufspaltung in zwei Verbindungen in Lösung gebracht, von etwas Ungelöstem abfiltriert ein, mit den Rf-Werten 0,13 und 0,19. Der zweite und das Filtrat unter Eiskühlung mit konz. Salzsäure Fleck zeigt die größere Farbintensität mit Ninhydrin. tropfenweise auf pH = 1 gebracht. Die flockige Fällung

Die Verbindung mit dem Rf-Wert 0,13 stellt das wird abgenutscht, mit Eiswasser gewaschen, getrocknet

H-Asp(OH)-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH 40 und aus Methanoläther zweimal umkristallisiert. Es

dar, während es sich bei der Verbindung mit dem werden3,2gZ-Asp(NH₂)-Lys(Z)-OH(feineNadeln)

Rf-Wert 0,19 um das Oktapeptid mit dem Asparagynil- vom F. 175 bis 181 ° erhalten (Ausbeute 74% der

rest handelt. Theorie). Das Produkt ist löslich in sehr verdünnten

Die Röhrchen 15 bis 19 der Craig-Verteilung Alkalien, mit 2 η-Natronlauge oder Sodalösung ententhalten 55 mg Mischfraktion, während aus Röhrchen 45 steht ein gallertiges, schwerlösliches Natriumsalz. 20 bis 29 22 mg Ausgangsmaterial regeneriert werden
können (Rf = 0,30). _c) Z-Asp(NH₂)-Lys(Z)-Val-Tyr-Leu-His-

Außer durch Craig-Verteilung über viele Stufen Pro-Phe-OCH₃ lassen sich die beiden Hydrolyseprodukte (Aspara-

ginyl-und Asparagylverbindungen) auch durch Chro- 50 330 mg (0,42 mMol) H-Val-Tyr-Leu-His-Pro-

matographie an eine Säule aus Papierpulver mit Phe~OCH₃[vgl.Beispiell,l)]und445mg(0,84mMol)

geeigneten Lösungsmittelsystemen, z. B. Butanol — Z-Asp(NH₂)-Lys(Z)-OH werden in 3 ml Dimethyl-

Methanol — Ammoniumformiat, vollständig vonein- formamid gelöst, 200 mg (0,84 mMol) 1-Cyclohexyl-

ander trennen. 3-morpholinyläthyl-carbodiimid zugegeben und das

55 Reaktionsgemisch 21 Stunden bei 22° belassen. Dann

Beispiel 5 (vgl. Fig. 5) wird im Hochvakuum bei 45° zur Trockne verdampft

_a\ Z-Asp(NH )-LvsfZ)-OCH ^unc* ^^as !unterbleibende Öl mit kleinen Portionen

^{2 3} Wasser, sehr verdünnter Ammoniaklösung und Wasser

Zu einer auf 0° gekühlten Lösung von 12,0 g gewaschen, wobei es allmählich erstarrt. Das Pulver

(0,041 Mol)H-Lys(Z)-OCH₃und8,6 ml(0,061 Mol) 60 wird abgenutscht, getrocknet (520 mg) und weiterhin

Triäthylaminin60 ml absolutem Toluol wird innerhalb mit Aceton und schließlich mit Methanol gewaschen,

15 Minuten unter Feuchtigkeitsausschluß die ebenfalls wobei sich Z-Asp(NH₂)-Lys(Z)-Val-Tyr-Leu-His-

auf 0° gekühlte Lösung von 7,4 g 90% Diäthylchlor- Pro-Phe-OCH₃ in Form eines grauen, methanol-

phosphit (0,048 Mol) in 20 ml absolutem Toluol ein- unlöslichen Pulvers gewinnen läßt. F. etwa 190bis205°.

getropft. Das Reaktionsgemisch wird sodann 2 Stunden 65 Das Pulver wird in Dimethylformamid gelöst und mit

bei Zimmertemperatur gehalten; hierauf wird vom Äther gefällt, wobei 130 mg Flocken vom F. 210 bis

ausgeschiedenen Triäthylaminhydrochlorid abge- 215° erhalten werden. Ausbeute 24% der Theorie.

nutscht, mit wenig absolutem Toluol nachgewaschen Das geschützte Oktapeptid ist in den meisten gebrauch-

lichen Lösungsmitteln schwer löslich, in Dimethylformamid aber leicht löslich.

d) H-Asp(NH₂)-Lys-Val-Tyr-Leu-His-

Pro-Phe-OCHg

53 mg (41 μΜοΙ) Z-Asp(NH₂)-Lys(Z)-Val-Tyr-Leu-His-Pro-Phe-OCHs vom F. 210 bis 215° werden versetzt mit 0,3 ml 2,5 n-Bromwasserstoff in Eisessig und das Gemisch unter Feuchtigkeitsausschluß I¹/;, Stunden bei 21 ° gehalten, wobei das Material langsam in Lösung geht. Zum Schluß wird das Bromwasserstoff-Eisessig-Gemisch am Hochvakuum bei 25° Badtemperatur vollständig entfernt und das hinterbleibende Harz mit Aceton gewaschen, wobei es zu einem körnigen Pulver erstarrt. Das äußerst hygroskopische Produkt wird abgesaugt, mit wenig Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen werden 50 mg rohes H-ASp(NH₂) - Lys -VaI -Tyr - Leu - His- Pro - Phe-OCH₃ · 3 H Br vom F. etwa 180 bis 220° (Zersetzung) erhalten. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet.

e) H-Asp(NH₂)-Lys-Val-Tyr-Leu-His-

Pro-Phe-OH

34 mg (27 μΜοΙ) H-Asp(NH₂)-Lys-Val-Tyr-Leu-His-Pro-Phe-OCHg-SHBr vom F. 180 bis 220° werden gelöst in 1 ml Methanol und tropfenweise 0,1 η-Natronlauge zugegeben, bis der p_H-Wert der Lösung während 15 Minuten bei 10 bis 10,5 bleibt. Insgesamt werden 1,81 ml 0,1 η-Natronlauge zügegeben (6,7 Äquivalente). Hierauf wird durch Einblasen von Kohlendioxyd auf pH = 8 gebracht, das Methanol im Vakuum entfernt, das pH der wäßrigen Lösung durch Zugabe von wenig Natriumcarbonatlösung auf 8,5 bis 9,0 gebracht und die wäßrige Lösung mit drei Portionen wassergesättigtem n-Butanol (30, 20,20 ml) extrahiert. Die Butanolauszüge werden einmal mit 3 ml halbgesättigter Natriumsulfatlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und geben beim Eindampfen 18 mg rohes H-Asp(NH₂)-Lys-Val-Tyr-Leu-His-Pro-Phe-OH als farblosen, feinkörnigen Beschlag. Das Rohprodukt wird in dreimal 3 ml Wasser aufgenommen, wobei sich 4 mg wasserschwerlösliche Verunreinigung abtrennen lassen. Die wäßrigen Lösungen vereinigt und eingedampft geben 14 mg Rückstand. Dieser wird dreimal mit 1 ml trockenem n-Butanol gewaschen, wobei sich noch 1 mg in n-Butanol leichterlösliche Anteile entfernen lassen.

Beim Prüfen auf blutdrucksteigernde Wirkung an Ratten zeigt das Produkt an der nierenlosen Ratte eine sofortige, deutlich hypertensinähnliche Steigerung des Blutdrucks. Die Stärke der Wirkung ist, verglichen mit Noradrenalin, etwa ein Zehntel bis ein Fünfzehntel.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH:

   Verfahren zur Herstellung neuer hypertensinwirksamer Oktapeptide der Formel L-Asparaginyl-L-a-(amino-niederalkyl)-amino-acetyl-L-«-aminoniederalkyl-acetyl-L-tyrosyl-L-A-amino-niederalkyl- acetyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin, dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) L-Asparagin, dessen Aminogruppe mittels einer durch Reduktion abspaltbaren Gruppe geschützt ist, mit einem Nitro-L-argininester kondensiert, den erhaltenen Dipeptidester mit alkalischen Mitteln hydrolysiert, die freie Säure in Gegenwart eines Carbodiimids mit einem L-Valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester, erhalten durch Kondensation von L-Valyl-L-tyrosin mit geschützter Aminogruppe mit einem L-Leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester in Gegenwart eines Carbodiimids und Abspaltung der Aminoschutzgruppe, kondensiert, auf reduktivem Wege die Schutzgruppe des Asparaginrestes und die Nitrogruppe des Argininrestes abspaltet und den Oktapeptidester mittels Alkali zum freien Oktapeptid hydrolysiert oder

   b) L-Asparaginyl-nitro-L-arginin, dessen Aminogruppe des Asparaginrestes mittels einer durch Reduktion abspaltbaren Gruppe geschützt ist, in Gegenwart eines Carbodiimids mit einem L-Leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester, erhalten durch Kondensation von L-Leucyl-L-tyrosin mit geschützter Aminogruppe mit einem L-Isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester in Gegenwart eines Carbodiimids und Abspaltung der Aminoschutzgruppe, kondensiert, auf reduktivem Wege die Schutzgruppe des Asparaginrestes und die Nitrogruppe des Argininrestes abspaltet und den Oktapeptidester zum freien Oktapeptid verseift oder

   c) L-Asparaginyl-nitro-L-arginin, dessen Aminogruppe des Asparaginrestes mittels einer durch Reduktion abspaltbaren Gruppe geschützt ist, in Gegenwart eines Carbodiimids mit einem L-Valyl-L-tyrosylester reagieren läßt, den erhaltenen Tetrapeptidester mittels eines alkalischen Mittels in die freie Säure überführt, das Tetrapeptid in Gegenwart eines Carbodiimids mit einem L-Isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester kondensiert, auf reduktivem Wege die Schutzgruppe des Asparaginrestes und die Nitrogruppe des Arginylrestes entfernt und den Oktapeptidester im alkalischen Medium zum freien Oktapeptid hydrolysiert oder

   d) L-Asparaginyl-nitro-L-arginin, dessen Aminogruppe des Asparaginrestes mittels einer durch Reduktion abspaltbaren Gruppe geschützt ist, in Gegenwart eines Carbodiimids mit einem L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester, erhalten durch Kondensation von L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin mit geschützter Aminogruppe mit einem L-Prolyl-L-phenylalaninester in Gegenwart eines Carbodiimids und Abspaltung der Aminoschutzgruppe, kondensiert, auf reduktivem Wege die Schutzgruppe des Asparaginrestes und die Nitrogruppe des Argininrestes abspaltet und den Oktapeptidester mittels Alkali zum freien Oktapeptid hydrolysiert oder

   e) N-Carbobenzoxy-L-asparaginyl-(N ε-carbobenzoxy)-L-lysin in Gegenwart eines Carbodiimids mit einem L-Valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester kondensiert, die Carbobenzoxygruppen des Asparagin- und Lysinrestes abspaltet und den Oktapeptidester im alkalischen Medium zum freien Oktapeptid verseift und, wenn erwünscht, die Carbonamidgruppe des Asparaginrestes zur Carboxylgruppe verseift.

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