DE1027367B

DE1027367B - Process for the production of a mixed vaccine for dogs

Info

Publication number: DE1027367B
Application number: DEA27052A
Authority: DE
Inventors: Charles James York
Original assignee: ALLIED LAB Inc
Current assignee: ALLIED LAB Inc
Priority date: 1956-08-27
Filing date: 1957-04-29
Publication date: 1958-04-03

Description

Verfahren zur Herstellung einer Mischvaccine für Hunde Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Mi.schvaccine für Hunde gegen Staupe und infektiöse Hepatitis, welches darin besteht, daß man den ei-modifizierten lebenden Hundestaupevirus auf einen lebenden, in einer Gewebekultur modifizierten Virus der infektiösen Hepatitis einwirken läßt. Method of making a mixed vaccine for dogs The invention relates to a method for producing a Mi.schvaccine for dogs against distemper and infectious hepatitis, which consists in taking the egg-modified live one Canine distemper virus to a live tissue culture modified virus of the infectious hepatitis.

Die Staupe und die infektiöse Hepatitis sind zwei Viruserkrankungen, die hei Hunden sehr häufig auftreten. In vielen Fällen befallen beide Krankheiten gleichzeitig denselben Hund, und dann ist das Sterblichkeitsverhältnis anscheinend viel größer als bei jeder der beiden Erkrankungen für sich allein. Distemper and infectious hepatitis are two viral diseases which are very common in hot dogs. In many cases both diseases affect at the same time the same dog, and then the mortality ratio is apparent much larger than either of the two diseases on its own.

In den letzten Jahren sind ei-modifizierte Stämme des Staupevirus zulr Herstellung vonVaccinen, die den lebenden Virus enthalten, benutzt worden. Diese Vaccine schützen Hunde gegen Staupe und rufen nicht die üblichen Symptome der Staupe bei den dnniit behandelten Hunden hervor. Der modifizierte Hundestaupevirus immunisiert also Hunde in befriedigender NVeise gegen die Staupe, aber die Hunde bleiben empfänglicl1 gegen die infektiöse Hepatitis. In recent years egg-modified strains of the distemper virus are has been used to manufacture vaccines containing the live virus. These vaccines protect dogs against distemper and do not cause the usual symptoms distemper in the thinly treated dogs. The modified canine distemper virus thus immunizes dogs in a satisfactory manner against distemper, but does immunize dogs remain susceptible to infectious hepatitis.

Fieldsteel und Emery (Proceedings of The Society for Experilmental I3foiogy and Ätedicine, 1954, Bd. 86, S. 819 bis 823) haben kürzlich ein Gewebekulturverfahren zur Züchtung und Umwandlung des Virus der infektiösen Hundehepatitis beschrieben. Der Virus der ansteckenden Lebererkrankung der Hunde wird modifiziert, indem man ihn nacheinander 51mal oder öfter durch Gewebekulturen von Hundenieren, Hundemilz, Hundeuterus oder Hundetesticeln schickt. Fieldsteel and Emery (Proceedings of The Society for Experilmental I3foiogy and Ätedicine, 1954, vol. 86, pp. 819-823) recently have a tissue culture method on the breeding and conversion of the canine infectious hepatitis virus. The canine infectious liver disease virus is modified by one it successively 51 times or more by tissue cultures from dog kidneys, dog spleen, Hundeuterus or Hundetestesteln sends.

Dabei wird der Virus so weit verändert, daß ein empfänglicher Hund nach Impfung mit dem lebenden Virus nicht die üblichen Symptome der infektiösen Hepatitis entwickelt, sondern gegen eine spätere Einwirkung des virulenten Hundevirus der infektiösen Hepatitis geschützt ist.This changes the virus to such an extent that it becomes a susceptible dog after vaccination with the live virus does not have the usual symptoms of infectious Hepatitis developed, but against subsequent exposure to the virulent canine virus of infectious hepatitis is protected.

Es ist nun gefunden worden, daß man unter geeigneten Bedingungen den lebenden, ei-modifizierten Virus der Hundestaupe zusammen mit dem Eimaterial auf das flüssige Material der Gewebekultur, welche den lebenden, modifizierten Virus der infektiösen Hundehepatitis enthält, in Gegenwart eines geeigneten Stabilisierungsmittels einwirken lassen, dann das flüssige Material bei niedriger Temperatur rasch einfrieren und im gefrorenen Zustand trocknen lassen kann. Man erhält auf diese Weise ein trockenes, stabiles Präparat, welches beide Virusarten enthält. It has now been found that under suitable conditions the live, egg-modified canine distemper virus along with the egg material on the liquid tissue culture material containing the live, modified virus of infectious canine hepatitis, in the presence of a suitable stabilizing agent leave to act, then quickly freeze the liquid material at low temperature and let it dry when frozen. In this way a dry, stable preparation that contains both types of virus.

Das getrocknete Viruspräparat kann später mit destilliertem Wasser oder einem anderen geeigneten Mittel verdünnt und als Vaccine für die Immunisierung empfänglicher Hunde sowohl gegen Staupe als auch gegen infektiöse Hepatitis der Hunde benu.tzt werden.The dried virus preparation can later with distilled water or other suitable means and diluted as a vaccine for immunization susceptible dogs to both distemper and infectious hepatitis Dogs are used.

Es ist leicht einzusehen, daß sich aus der Vereinigung der beiden lebenden, modifizierten Virusarten in einem einzigen Produkt in solcher Weise, daß beide Komponenten im Hervorrufen der Immunität gegeniiber der Erkrauknug, gegen welche sie bestimmt sind, ebenso wirksam bleiben, wie wenn man sie gesondert verwenden würde, viele Vorteile ergeben. Die Suspendierung der beiden Stoffe vor der Kältetrocknung in dem gleichen flüssigen Medium schaltet die Notwendigkeit der Verwendung von zwei Behältern aus, wie es der Fall sein würde, wenn die Vaccine getrennt hergestellt werden. Weiter werden erhehliche Ersparnisse dadurch erzielt, daß nur eine einzige Gefriertrocknung und bloß eine einmalige Verpackung und Handhabung erforderlich sind. Die neue Vaccine bringt manche Fortschritte in medizinischer Hinsicht mit sich. Beispielsweise ist nur eine Injektion erforderlich, um einen empfänglichen Hund gegen beide Krankheiten zu schützen. Dies entbindet von der Notwendigkeit mehrfacher Injektionen, wie es bei Verwendung getrennter Vaccine der Fall sein würde. It is easy to see that from the union of the two living, modified virus species in a single product in such a way that both components in eliciting immunity to the disease, to which they are intended to remain just as effective as if you use them separately would yield many benefits. The suspension of the two substances before the cold drying in the same liquid medium switches off the need to use two Containers made as it would be the case if the vaccine was made separately will. Significant savings are also made by having only one Freeze drying and only one time packaging and handling required are. The new vaccine brings some advances in medical terms themselves. For example, only one injection is required to make a susceptible Protect dog against both diseases. This relieves the need for multiple Injections, as would be the case using separate vaccines.

Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung wird der lebende, nach der Methode von Fieldsteel und Emery modifizierte Virus der infektiösen Hepatitis in Kolben mit Gewebekulturpräparaten eingetragen und bei einer geeigneten Temperatur etwa 4 Tage lang bebrütet. Nachher wird die Flüssigkeit geerntet Zu etwa der gleichen Zeit, zu der die Präparate der infektiösen Hepatitis auf den Gewebekulturen ausgesät werden, impft man angebrütete, befruchtete Eier mit dem lebenden, modifizierten Hundestaupevirus. Nach einer angemessenen Inkubationszeit von etwa 5 Tagen werden die infizierten Membranen der Eier geerntet und mit einer Saccharoseglutamatlösung zu einer gleichförmigen Suspension verarbeitet, so daß je 2 ml davon ungefähr 1 g des infizierten Gewebes enthalten. Man, fügt nun zu je 2 ml der mit dem Staupevirus infizierten, homogenen Tasse 2 ml der flüssigen Gewebekultur, welche den Virus der infektiösen Hepatitis enthält. Die entstandene Lösung wird dann in geeignet abgemesslene Mengen. in sterile Behälter abgefüllt. Die Flüssigkeit in den Behältern läßt man rasch einfrieren und trocknet sie im gefrorenen Zustand im Vakuum ein. Dabei wird eine trockene Vaccine erhalten, die beide lebenden Viren in stabiler Form enthält. In practicing the present invention, the living, after the method of Fieldsteel and Emery modified virus of infectious hepatitis entered in flasks with tissue culture preparations and at an appropriate temperature incubated for about 4 days. Afterwards the liquid is harvested at about the same Time at which the preparations of infectious hepatitis sown on the tissue cultures be, one inoculates hatched, fertilized Eggs with the living, modified canine distemper virus. After a reasonable incubation period of about 5 days the infected membranes of the eggs are harvested and treated with a sucrose glutamate solution processed into a uniform suspension, so that for every 2 ml of it approximately 1 g of infected tissue. Now add 2 ml of the one with the distemper virus infected, homogeneous cup of 2 ml of the liquid tissue culture containing the virus of the Contains infectious hepatitis. The resulting solution is then appropriately measured out Amounts. filled in sterile containers. The liquid in the containers is left freeze quickly and dry them in the frozen state in a vacuum. It will receive a dry vaccine that contains both live viruses in a stable form.

Herstellung der lebenden, modifizierten Hundestaupe-Komponente Hühnereier, diel 7 bis 8 Tage lang bebrütet worden waren, werden für die Kultivierung des Hundestaupevirus benutzt. Die Eier werden durchleuchtet, und nur lebende Embryonen werden beimpft. In die Schale des bebrüteten. Eies wird oberhalb des Luftsackes ein kleines Loch gebohrt, und 1 ml einer 10- bis 20fachen Verdünnung einer rekonstitu ierten Suspension von chorio-allantischer Membran aus mit dem modifizierten Hundestaupevirus infizierten Eiern werden auf der Membran aufgetragen. Das Loch im Ei wird dann verschlossen und das Ei bei 370 C 5 bis 7 Tage lang bebrütet. Naohher werden die infizierten Membranen unter sterilen Bedingungen geerntet. Die geernteten Membranen werden anschließend mit einer sterilen Saccharoseglutamatlösung zu einer gleichförmigen, homogenen Suspension verarbeitet, so daß je 2 ml etwa 1 g des infizierten Gewebes enthalten. Die verwendete Lösung von Saccharoseglutaminat hat folgende Zusammensetzung: 75 g Saccharose, 0,99 g Monokaliumphosphat, 2,38 g Dinatriumphosphat, 0,96 g Monokalium -1 - glutamat - monohydrat, aufgefüllt mit Wasser zu 1000 ml. pl-Endsvert = 7,2 bis 7,4.Production of the live, modified canine distemper component chicken eggs, which have been incubated for 7 to 8 days are used to cultivate canine distemper virus used. The eggs are x-rayed and only live embryos are inoculated. In the bowl of the incubated. There will be a small hole above the air sac drilled, and 1 ml of a 10 to 20-fold dilution of a reconstituted suspension infected with the modified canine distemper virus from the chorio-allantic membrane Eggs are applied to the membrane. The hole in the egg is then sealed and incubate the egg at 370C for 5 to 7 days. The infected will be closer Membranes harvested under sterile conditions. The harvested membranes are then used with a sterile sucrose glutamate solution to form a uniform, homogeneous suspension processed so that every 2 ml contains about 1 g of the infected tissue. The used Solution of sucrose glutaminate has the following composition: 75 g sucrose, 0.99 g monopotassium phosphate, 2.38 g disodium phosphate, 0.96 g monopotassium -1-glutamate - monohydrate, made up to 1000 ml with water. pl-Endsvert = 7.2 to 7.4.

Herstellung der modifizierten, infektiösen Hundehepatitis-Virusko,mponente F,ine mit Trypsin versetzte Kultur von Hundenieren in einem Nährmedium, das aus 8 Teilen Earlescher Lösung (Earles ausgeglichene Salzlösung enthält 6,8 g Natriumchlorid, 0,40 g Kaliumchlorid, 0,20 g Calciuinchlorid, 0,20 g Magnesiumsulfat, 0,125 g saures Natriumphosphat, 1,00 g Glukose und 2,20 g Natriumbicarbonat, aufgefüllt mit Wasser zu 1000 ml), 1 Teil S0loigem Lactalbumin-Hydrolysat und 1 Teil inaktiviertem Pferdeseram oder einer Kultur, die suspendierte Reste einer Hundeniere enthält, zusammengesetzt ist, wird mit 0,2 ml einer unverdünnten, flüssigen, vorher mit Trypsin versehenen Kultur aus Hundenierengewebe, die einen modifizierten ICH-Virus enthält, der aufeinanderfolgend mindestens 51mal, vorzugsweise 100 und mehr Male hindurch geschickt worden war, beimpft. Der pu-Wert des Mediums wird auf 7,6 bis 7,8 eingestellt und die Inkubation der Kulturen bei 350 C ausgeführt. Nach viertägiger Inkubation wird die flüssige Masse, die eine hohe Konzentration an lebendem, geschwächtem ICH-Virus enthält, unter sterilen Bedingungen geerntet. Manufacture of modified, infectious canine hepatitis virus components F, a trypsinized canine kidney culture in a nutrient medium made from 8 parts of Earle's solution (Earle's balanced salt solution contains 6.8 g of sodium chloride, 0.40 g potassium chloride, 0.20 g calcium chloride, 0.20 g magnesium sulfate, 0.125 g acid Sodium phosphate, 1.00 g glucose and 2.20 g sodium bicarbonate, made up with water to 1000 ml), 1 part of dissolved lactalbumin hydrolyzate and 1 part of inactivated horse amine or a culture containing suspended canine kidney residues is, 0.2 ml of an undiluted, liquid, previously provided with trypsin Culture from canine kidney tissue containing a modified ICH virus, sequentially had been sent through at least 51 times, preferably 100 and more times, inoculates. The pu value of the medium is adjusted to 7.6 to 7.8 and the incubation the cultures carried out at 350.degree. After four days of incubation, the liquid Mass containing a high concentration of live, weakened Ich virus, harvested under sterile conditions.

Ähnliclie Herstellungsmethoden können unter Verwendung von Schweinenieren an Stelle von Hundenieren ausgeführt werden. Ebenso kann man für die Herstellung der Nierengewebekulturen andere Lösungen benutzen als das Medium 199.Similar manufacturing methods can be made using pig kidneys instead of dog kidneys. Likewise, for the Manufacturing of kidney tissue cultures use different solutions than medium 199.

Herstellung der kombinierten Vaccine Zu je 2 ml des mit dem Staupevirus infizierten Eierembryohomogenats werden 0,2 ml der flüssigen Gewebeikulltur hinzugefügt, welche den lebenden Virus der infektiösen Hepatitis enthält, und die Massen werden gründlich miteinander gemischt. Je 2 ml der gemischten Flüssigkeiten werden dann unter steilen Bedingungen in Glasbehälter abgefüllt. Die Flüssigkeit in den Behältern wird anschließend rasch bei einer Temperatur von etwa -500 C einfrieren gelassen und im gefrorenen Zustand im Vakuum unter Aufrechterhaltung einer tiefen Temperatur eingetrocknet. Für die Verwendung zur Immunisierung von Hunden wird die getrocknete, eingefrorene Vaccine mit destilliertem Wasser oder einer Normal-Kochsalzlösung wieder zu 2 ml rekonstituiert. Production of the combined vaccine 2 ml each with the distemper virus infected egg embryo homogenate is added 0.2 ml of the liquid tissue culture, which contains the live infectious hepatitis virus, and the masses will thoroughly mixed together. Each 2 ml of the mixed liquids are then bottled in glass containers under steep conditions. The liquid in the containers is then allowed to freeze rapidly at a temperature of about -500 C. and in the frozen state in a vacuum while maintaining a low temperature dried up. For use in immunizing dogs, the dried, Frozen Vaccine with distilled water or a normal saline solution again reconstituted to 2 ml.

Die in den vorstehenden Beispielen verwendeten Verhältnisse der Viruskomponenten stellen bevorzugte Mengenverhältuisse dar. Man kann aber auch andere Verhältnisse benutzen und erhält immer noch eine wirksame Vaccine. Immerhin ist es notwendig, daß jede Viruskomponente in solcher Menge vorhanden ist, daß sie infizierend wirkt, und jeder Virus muß lebend bleiben. Die Lebensfähigkeit der kombinierten Viren scheint etwas von dem verwendeten Saccharoseglutamatpuffer abhängig zu sein. Es ist vorteilhaft, wenn der Puffer in dem angegebenen Betrag vorhanden ist. Man kann aber auch größere Mengen mit befriedigendem Erfolg anwenden. The ratios of virus components used in the previous examples represent preferred quantitative ratios. However, other ratios can also be used use and still receive an effective vaccine. After all, it is necessary that each virus component is present in such an amount that it has an infectious effect, and every virus has to stay alive. The viability of the combined viruses appears to be somewhat dependent on the sucrose glutamate buffer used. It is beneficial if the buffer is available in the specified amount. But you can also do bigger ones Apply quantities with satisfactory results.

Die Wirksamkeit der kombinierten Vaccine als Iminunisierungsmittel für Hunde ergibt sich aus den nachstehenden Versuchen. The effectiveness of the combined vaccines as immunization agents for dogs results from the experiments below.

48 Hunde wurden subkutan mit je 2 ml der kombinierten Vaccine, die tvie oben beschrieben hergestellt war und den modifizierten infekflösen Hundehepatitisvirus und den modifizierten Hundestaupevirus enthielt, geimpft. Von diesen Hunden wurden zur Zeit der Impfung Serumproben, gezogen, und diese Maßnahme wurde drei oder mehr Wochen später wiederholt. Mit diesen Serumproben wurden Neutralisationsprüfungen vorgenommen, wobei man als Test den infektiösen Hundehep atiti.svirus in der Gewebekultur und den Hundestaupevirus in bebriiteten Eiern benutzte. In Ergänzung der Prüfung der Serumproben auf die Bildung von Antikörpern wurden 31 der Hunde mit einem virulenten, krankheitserregenden Stamm von Hundestaupe und einem virulenten, krankheitserregenden Stamm von infektiöser Hepatitis behandelt. In allen Fällen waren die Serumproben der Hunde, die zur Zeit der Impfung gezogen wurden, frei von Antikörpern. Nach der Impfung entwiclmelten alle Hunde einen beträchtlichen Anstieg der Ablvehrbereitschaft gegen den Hundestaupevirus und den Virus der infektiösen Hepatitis. Alle 31 Hunde, die mit den krankheitserregenden Viren behandelt worden waren, widerstanden erfolgreich diesem Angriff. 48 dogs were administered subcutaneously with 2 ml each of the combined vaccines, the prepared as described above and the modified canine infectious hepatitis virus and the modified canine distemper virus was vaccinated. From these dogs were at the time of vaccination, serum samples were drawn, and this measure was three or more Repeated weeks later. Neutralization tests were carried out with these serum samples made, using the infectious canine hepatiti.svirus as a test in the tissue culture and used canine distemper virus in cooked eggs. In addition to the exam of the serum samples for the formation of antibodies, 31 of the dogs were infected with a virulent, pathogenic strain of canine distemper and a virulent, pathogenic strain Treated strain of infectious hepatitis. In all cases the serum samples were of the dogs bred at the time of vaccination free of antibodies. After Vaccination, all dogs developed a considerable increase in willingness to volunteer against canine distemper virus and infectious hepatitis virus. All 31 dogs, those treated with the disease-causing viruses successfully resisted this attack.

Claims

PATENT APPROVAL INCrTE 1. Process for the production of a mixed vaccine for the simultaneous immunization of dogs against infectious hepatitis and distemper, characterized in that one egg tissue, which with modified canine distemper virus infected, mixed with a tissue culture fluid containing the living, modified Infectious virus Contains canine hepatitis and the liquid mixture subjected to freeze-drying.

2. The method according to claim 1, characterized in that the egg tissue consists of poultry unryonal tissue.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that one 10 parts of the embryonic egg tissue to 1 part of the liquid from the dog tissue culture applies.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that one the embryonic egg tissue prior to addition to the tissue culture fluid with a Mix sucrose glutamate buffer.

5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that one approximately a ratio of the individual substances of 1 part of the embryonic egg tissue to 2 parts sucrose glutaminate and 0.1 part of the tissue culture fluid.