DE1022230B

DE1022230B - Verfahren zur Gewinnung des Cycloserins und seiner wasserunloeslichen Metallsalze

Info

Publication number: DE1022230B
Application number: DEC11646A
Authority: DE
Inventors: Roger Lee Harned
Original assignee: Commercial Solvents Corp
Current assignee: Commercial Solvents Corp
Priority date: 1954-08-03
Filing date: 1955-08-03
Publication date: 1958-01-09

Description

Verfahren zur Gewinnung des Cycloserins und seiner wasserunlöslichen Metallsalze Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reindarstellung des Cycloserins und seiner wasserunlöslichen Metallsalze aus einer Nährstofflösung, in dem es durch Mikroorganismen gebildet wird.
Cycloserin besitzt eine große Wirkungsbreite und ist sowohl gegen gramnegative als auch grampositive Bakterien, einschließlich Mykobakterien, wirksam. Es wird durch die Mikroorganismenart Streptomyces orchidaceaus gebildet, ist ein amphoteres Polypeptid, das schwach saure und schwach basische Gruppen besitzt, ist in Wasser leicht löslich, in Glykolen, Isopropylalkohol, Methanol, Äthanol und Aceton wenig löslich und in Hexan, Benzol, Chloroform, Äther, Petroläther, Dioxan, Butanol-(1), Äthylacetat und Äthylendichlorid unlöslich. Es schmilzt bei etwa 153' unter Zersetzung und wird durch 1 n-Salzsäure bei 140' hydrolysiert.
Zur Herstellung des Cycloserins wird der Mikroorganismus Streptomyces orchidaceaus in einer Nährstofflösung gezüchtet, die eine geeignete Eiweiß- und Kohlehydratquelle enthält, wobei der Nährstofflösung Luft zugeführt und die Temperatur zwischen etwa 20 und 30' gehalten wird.
An sich ist die Anwendung von Ionenaustauschern bei den Antibiotika zur Reinigung der wäßrigen Rohlösungen bereits bekannt. Es ist ferner bekannt, wasserunlösliche Salze der Antibiotika herzustellen, diese zu zersetzen und dann das Antibiotikum amorph oder kristallisiert zu gewinnen.
Es wurde nun ein Reindarstellungsverfahren für Cycloserin und seine wasserunlöslichen Metallsalze aus unreinen wäßrigen Lösungen, die durch Filtrieren der das Cycloserin enthaltenden Gärflüssigkeit gewonnen wurde, gefunden, das bequem, wirtschaftlich und wirksam die Gewinnung des Cycloserins in guten Ausbeuten in amorpher oder kristalliner Form gestattet.
Das neue Verfahren zur Reindarstellung des Cycloserins und seiner wasserunlöslichen Metallsalze besteht darin, daß man Cycloserin entweder aus seiner unreinen wäßrigen Lösung, die durch Filtrieren der das Cycloserin enthaltenden Gärflüssigkeit gewonnen wurde, oder aus der nach der Adsorption des Rohcycloserins in an sich bekannter Weise an ein basisches Anionenaustauscherharz und Auswaschen mit einer geeigneten wäßrigen Salz- bzw. Säurelösung erhaltenen Lösung durch Zusatz eines wasserlöslichen, anorganischen Metallsalzes, das mit Cycloserin ein in Wasser unlösliches Metallsalz bildet, als unlösliches Metallsalz fällt, dieses von der überstehenden Flüssigkeit abtrennt, das wasserunlösliche Cycloserinsalz mit Wasser aufschlämmt, das Metallion des unlöslichen Cycloserinsalzes als wasserunlösliches Salz fällt, die nach Abtrennung des anorganischen Niederschlags verbleibende gereinigte wäßrige Cycloserinlösung entweder im Vakuum gefriertrocknet oder das Cycloserin mit einem Überschuß an wasserlöslichem, organischem Fällungsmittel kristallin ausfällt. Ganz besonders hat sich im vorliegenden Fall die Herstellung des Silbersalzes als außerordentlich praktisch und wirtschaftlich erwiesen, wie im folgenden noch näher ausgeführt werden wird.
Bei der Durchführung der Erfindung -wird die unreine, wäßrige Lösung des Cycloserins, z. B. die Gärflüssigkeit, in der das Cycloserin gebildet worden ist, zunächst filtriert oder in anderer Weise geklärt; vorzugsweise wird eine solche Lösung zuerst filtriert und dann mit Aktivkol-de entfärbt, oder aber man adsorbiert das Cycloserin aus der wäßrigen Lösung an ein stark basisches Anionenaustauscherharz in der Hydroxydform. Geeignete stark basische Aionenaustauscherharze, die angewendet werden können, sind in großer Zahl bekannt, z. B. die unter den Handelsbezeichnungen bel#:annten"Dowex"-und"Arnberlite«-.'#ustanscherharze.
Nach der Adsorption des Cycloserins vom stark basischen Anionenaustauscherharz wird es aus dem Harz mit einer wäßrigen Lösung eines Salzes oder einer Säure ausgewaschen, die ein Anion besitzen und das Cvcloserin aus dem Harz zu verdrängen vermögen. Geeignete Eluierungsmittel sind wasserlösliche Sulfate, Chloride, Acetate, Formiate, Phosphate, Citrate, Oxalate, Schwefelsäure, Salzsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Phosphorsäure, Citronensäure und Oxalsäure. Das Verfahren zur Adsorption von Cycloserin an das Anionenaustauscherharz ist an sich bekannt; ein geeignetes Verfahren besteht darin, die wäßrige Lösung des Cycloserins durch eine Säule zu leiten, die das Harz enthält, bis die größte Menge des Cycloserins vom Harz adsorbiert ist. Dies wird durch das Austreten des Cycloserins am unteren Ende der Säule angezeigt, das dann in größeren Mengen im Ablauf aus der Säule gefunden wird. Das Auswaschen des Cycloserins aus dein Harz mit dem Eluierungsmittel setzt man so lange fort, bis das Cycloserin vollständig ausgewaschen ist, was durch dessen verringerte Mengen und schließlich durch dessen völlige Abwesenheit im Ablauf angezeigt wird.
Dann wird, wenn es notwendig ist, das Eltiat mit Aktivkohle entfärbt und das Cycloserin aus der wäßrigen Lösung als unlösliches Metallsalz gefällt. Man gibt also zu der wäßrigen Lösung des Cycloserins ein wasserlösliches Metallsalz, das mit dem Cycloserin ein unlösliches Salz bildet, das somit ausfällt. Vor der Zugabe des Metallsalzes zu der Cycloserinlösung wird deren pH-Wert auf etwa 5,5 bis 9,0 eingestellt und nach Zugabe des Metallsalzes wieder auf einen p,1-Wert in diesem Bereich gebracht. Bevorzugt wird ein p11-Wert von 6,5. Bei einem pH-Wert unter 5,5 wird sehr wenig unlösliches Metallsalz des Cycloserins gebildet, und bei einem pn-Wert über 9,0 bilden sich bei Zugabe des wasserlöslichen Metallsalzes zu der wäßrigen Lösung des Cycioserins übermäßige Mengen von Metallhydroxyd. Metalle, die mit Cycloserin unlösliche Salze bilden, sind Silber, ' Kupfer, Quecksilber, Zink, Blei, Aluminium und Kobalt. Geeignete wasserlösliche Salze sind demnach Silbernitrat, Cuprichlorid, Kupfersulfat, Mercuriacetat, Zinknitrat, Zinksulfat, Bleiacetat, Bleinitrat, Aluminiumchlorid, Kobaltnitrat, Kobaltchlorid und Kobaltsulfat. Bevorzugt fällt man das Cycloserin mit Silbernitrat oder einem wasserlöslichen Kupfersalz.
Man kann natürlich die unlöslichen Metallsalze des Cycloserins aus jeder seiner wäßrigen Lösungen fällen. Es wurde gefunden, daß das Cycloserin als unlösliches Metallsalz aus einer geklärten Nährstofflösung, in dem es gebildet wird, ausgefällt werden kann, ohne daß es notwendig ist, das Cycloserin an ein Anionenaustauschharz zu adsorbieren und es aus diesem auszuwaschen. Nach diesem Verfahren wird die Nährstofflösung, in der das Cycloserin gebildet wurde, filtriert und mit Aktivkohle geklärt, wodurch man eine teilweise gereinigte wäßrige Lösung des Cycloserins erhält, aus der es als unlösliches Metallsalz -ausgefällt werden kann.
Nach der Ausfällung des Cycloserins und der Abtrennung des unlöslichen Metallsalzes aus der darüberstehenden Lösung wird das unlösliche Metallsalz in Wasser aufgeschlämmt und mit einem Fällungsmittel für das Metallion versetzt, wodurch das frei gemachte Cycloserin im Wasser in Lösung geht. Wenn z. B. das Cycloserin als Silbersalz ausgefällt worden ist, kann man das Silbersalz des Cycloserins in Wasser aufschlämmen und Salzsäure zufügen. Das Silber fällt als Süberchlorid aus, und das Cycloserin geht als freie Säure in Lösung. Wenn genügend Salzsäure angewandt wird, kann das Cycloserin in das Hydrochlorid umgewandelt werden, während das Silber als Silberchlorid ausgefällt wird. In gleicher Weise kann Schwefelwasserstoff angewandt werden, wobei das Silber als Silbersulfid ausfällt und das Cycloserin im MTasser in Lösung geht. Man kann aber auch eine Mischung aus Salzsäure und Schwefehvasserstoff anwenden, um das Silber vollkommen zu entfernen. Wenn das unlösliche KapfersaU des Cycloserins in Wasser aufgeschlämmt und Schwefelwasserstoff zugegeben wird, fällt das Kupfer als Kupfersulfid aus, und das Cycloserin geht im Wasser in Lösung. In ähnlicher Weise kann Quecksilber als Sulfid ausgefällt werden; auch die anderen Metalle lassen sich in ähnlicher Weise entfernen.
Nach der Entfernung des Metallions, das zur Bildung des -unlöslichen Metallsalzes des Cycloserins gebraucht wurde, wird die wäßrige Lösung des Cycloserins gegebenenfalls entfärbt und sodann der Geiriertrocknung im Vakuum unterworfen, wobei es in amorplier Form von sehr hoher Reinheit erhalten wird. Für die meisten Anwendungen des Cycloserins ist die amorphe Form geeignet.
Das Cycloserin kann aus der wäßrigen Lösung aber auch kristalliert erhalten werden. Es wird durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, in welchem es nur wenig oder gar nicht löslich ist, zu dessen gereinigter wäßriger Lösung kristallisiert erhalten. Geeignete, mit Wasser mischbare Lösungsmittel, die zur Kristallisation des Cycloserins aus wäßriger Lösung angewandt werden können, sind Aceton, Methanol und Dioxan. So wird besonders das Silbersalz des Cycloserins nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt, indem man Silbernitrat entweder zu einer unreinen wäßrigen, durch Zusatz von Klärungsmitteln und bzw. oder Filtrieren geklärten Cycloserinlösung oder zu der nach der Adsorption des Rohcycloserins in an sich bekannter Weise an ein basisches Anionenaustauscherharz und Auswaschen mit eitler geeigneten wäßrigen Salz- bzw. Sätirelösung erhaltenen Lösung bei einem pff-Wert zwischen 5,5 und 9,0 gibt und das gefällte Silbercycloserin abfiltriert, mit Aceton wäscht und im Vakuum trocknet.
Gewöhnlich ist Cvcloserin nicht sehr beständig, wenn es nicht in reiner wasserfreier Form vorliegt. Als Silbersalz jedoch ist es gut beständig, unbegrenzt lange lagerfähig und kann daraus nach Bedarf in reines kristallines Cycloserin übergeführt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 von -1,8 Einheiat)e1,29COylcINosäelirrisntojefflcösumngwumridteeninfielmtriCe.rethaulntd durch eine Säule, die 101 starkbasisches Anionenaustauschharz in der OH-- Form enthielt und unter der Handelsbezeichnung "Dowex-2" bekannt ist, mit einer Fließgeschwindigkeit von 1200 ccm je Minute geleitet. Das Austauschharz wurde sodann mit Wasser gewaschen und das Cycloserin aus dem Harz mit 0,2 n-Schwefelsäure mit einer Geschwindigkeit von 1200 cem je Minute eluiert, wobei das Eluat in achtzehn Fraktionen zu 2 1 aufgefangen wurde. Der pl,-Wert der Eluatfraktion wurde sodann auf einen pH-Wert von etwa 7,0 eingestellt, diese mit 1 Gewichtsprozelit Entfärbungskohle behandelt und die Mischung filtriert. Sodann wurden zu dem entfärbten Eluat 0,5 mg Silbernitrat je Einheit wirksanteni Cycloserin gegeben und der pl,-Wert mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt. Aus dem Eluat schied sich das kristallisierte Silbersalz des Cycloserins ab; es wurde abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum bei einer Temperatur von 65,5' getrocknet. Die folgende Tabelle gibt die Ergebnisse für neun der obenerwähnten Eluatfraktionen an.

Eluat Ehlat Einheiten entfärbtes Filtrat Stärkeeinheiten zugesetzte.9 Silbersalz Einheiten

Volumen Volumen AgNo,

Nr. je Cem je Ccm je cein je Ccm 9 9 je cem

10 2260 15 2400 12 22,6 12,8 1,92

11 2280 27 - 21 24,0 2-1,4 1,23

12 2180 34 21340 31 35,0 33,9 1,80

13 2020 47 2120 - 43,4 29,7 2,12

14 2220 55 2400 - 53,3 38,2 2,5

15 2160 32 2465 28 36,7 29,-1 2,4

16 2130 25 2370 20 28,8 24,4 2,0

17 2050 17 2220 13 22,6 21,8 1,18

18 1960 11 2100 8 12,7 10,4 0

10 g kristallisiertes Silbersalz aus dem Eluat 14 wurden mit 60 ccm Wasser und dann mit 89 ccm 0,5165 n-Salzsäure versetzt. Aus der Lösung wurde das Silberchlorid ausgefällt und durch Filtrieren abgetrennt. Die verbleibende Lösung wurde im Vakuum der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 4,4 g festes amorphes Cycloserin mit 5,15 Einheiten je mg erhalten wurden.

b) 1 g des nach den Angaben unter a) erhaltenen amorphen Cycloserins wurde in 7,5 ccm Wasser gelöst und diese Lösung mit 5 ccm Aceton versetzt. Aus der Lösung fiel kristallines Cvcloserin aus. Danach wurden weitere 5 ccm Aceton zugegeben, um die vollständige Kristallisation zu bewirken. Die Kristalle wurden abfiltriert und mit Aceton gewaschen, wobei 0,6177 g lufttrockene Kristalle mit 4,32 Einheiten je mg erhalten wurden, die 140/', Feuchtigkeit enthielten. Nach der Entfernung der Feuchtigkeit durch Trocknen enthielt das kristallisierte Cvcloserin 5,02 Einheiten je mg. Beispiel 2 102 ccm. 'Nährstofflösung, die 5 Einheiten je ccm Cycloserin enthielt, wurden mit 4 % Aktivkohle verrührt und anschließend filtriert. Durch Zusatz von 170 mg Silbernitrat wurde das Silbersalz des Cycloserins in Form kleiner weißer Kristalle ausgefällt. Die Kristalle wurden abfiltriert und getrocknet, wodurch 160 mg des kristallisierten Silbersalzes des Cycloserins erhalten wurden. Dieses wurde dann in 10 ccm Wasser aufgeschlämmt und mit 1,47 ccm 0,505 n-Salzsäure versetzt, Das Süberchlorid fiel aus der Lösung aus und wurde abzentrifugiert. Die verbleibende Lösung wurde wie im Beispiel 1 mit Aktivkohle behandelt und sodann im Vakuum der Gefriertrocknung unterworfen, wodurch das Cvcloserinhydrochlorid mit 4,85 Einheiten je mg erhalten wurde.
Beispiel 3 100ccm wäßrige Cycloserinlösung, die 88Einheiten Cycloserin je ccm emthalten, wurden mit 4,89 g Kupfersulfat versetzt, und der PH-Wert der Mischung wurde mit Natriumhydro.xyd auf 6,7 eingestellt. Das ausgefällte Kupfersalz des Cycloserins wurde abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet, wodurch 3,92 g des Cvcloserinkupfers mit 1,88 Einheiten je mg erhalten wurden. 1 g des Kupfersalzes wurde in 20 ccm Wasser aufgeschlämmt und 5 Minuten Schwefelwasserstoff durch die Aufschlämmung geleitet. Aus der Lösung fiel das unlösliche Kupfersulfid aus, das abfiltriert wurde. Das Filtrat wurde im Vakuum der Gefriertrocknung unterworfen, wodurch 0,457 g Cycloserin mit 3,3 Einheiten je mg erhalten wurden.

Claims

PATF,NTANSPRÜCHE-. 1. Verfahren zur Gewinnung des Cycloserins und seiner wasserunlöslichen Metallsalze, dadurch gekennzeichnet, daß man Cycloserin entweder aus seiner unreinen wäßrigen Lösung, die durch Filtrieren der das Cycloserin enthaltenden Gärflüssigkeit gewonnen wurde, oder aus der nach der Adsorption des Rohcycloserins in an sich bekannter Weise an ein basisches Anionenaustauscherharz und Auswaschen mit einer geeigneten wäßrigen Salz- bzw. Säurelösung erhaltenen Lösung durch Zusatz eines wasserlöslichen, anorga,-nischen Metallsalzes, das mit Cycloserin ein in Wasser unlösliches Metallsalz bildet, als -unlösliches Metallsalz bei einem pr,-Wert von 5,5 bis 9 fällt, dieses von der überstehenden Flüssigkeit abtrennt, das wasserunlösliche Cycloserinsalz mit Wasser aufschlämmt, das Metallion des unlöslichen Cvcloserinsalzes als wasserunlösliches Salz fällt, die nach der Abtrennung des anorganischen Niederschlags verbleibende gereinigte wäßrige Cycloserinlösung entweder im Vakuum gefriertrocknet oder das Cycloserin mit einem Überschuß an wasserlöslichem, organischem Fällungsmittel kristallin ausfällt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Cycloserin mit Silbernitrat oder einem wasserlöslichen Kupfersalz fällt. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Cycloserinsilbei bzw. -kupfer mit Salzsäure oder Schwefelwasserstoff oder deren Gemischen zerlegt.
In Betracht gezogene Druckschriften: USA.-Patentschriften Nr. 2 541420, 2 479 832, 2 667 441; französische Patentschriften Nr. 952 376, 986 277, 1017 468; britische Patentschrift Nr. 653 088.