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Verfahren zur Reinigung synthetischer Folsäure Von W a 11 e r et al.,
J. A. C. S. 70, 19 bis 28 (19q.8), wurden mehrere Verfahren zur Synthese des L.
casei-Faktors, der auch unter dem Namen Fölsäure oder Pteroylglu.taminsäure bekannt
ist, beschrieben. Bei allen bekannten Verfahren zur Synthese von Folsäure, die auf
der Kondensation verschiedener relativ komplizierter Säuren und komplizierter Amine
beruhen, werden Produkte erhalten, die schwankende Mengen verschiedener unerwünsehter
Stelflungsisomere, Oxydationsprodukte, nicht umgesetzter Zwischenprodukte, Kondensations-,
Palymerisationsprodukte und Hydrolyse-Zersetzungsprodukte en:dhaken. Viele dilmer
Nebenprodukte sind mit der biologisch aktiven Folsäure nahe verwandt und besitzen,
wie zit erwarten war, ähnliche physikalische und chemische Eigenschaften, sind jedoch
größtenteils biologisch inaktiv. Die Folsäure kann von vielen ihrer natürlichen
Nebenprodukte aabgeürennt werden. Es ist jedoch schwer, die Folsäuxe von jenen sie
beg'lieitenden Pterinen, die in den bei chemischen Synthesen erhaltenen Gemischen
auftreten, abzutrennen.
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Es sind zahlreiche Methoden zurr Reinigung von Folsäure beschrieben
worden, beispielsweise die von J. J. P f i f f n e r et a1., Journ. Am. Chem. Soc.
69, 1476 (19q.7), beschriebene Methode, die auf der Adsorption an Ionenaustausrihharzen
beruht. Gemäß weiteren Methoden wird' das Syntheseprodukt in Alkali gelöst, worauf
die Pteroylglubaminsäure
bei einem pH von etwa 3 bis 4. daraus ausgefällt
wird. Die Reinigung kann auch durch Auflösen in einer starken Säure mit anschließender
Verdünnung mit Wasser zwecks Ausfällung der gelösten Folsäure erfolgen.
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Es ist weiterhin vorgeschlagen worden, die Reinigung der synthetischen
Folsäure unter der Verwendung von Erdalkaliverbindungen vorzunehmen, um damit Erdalka'fi@metallsalze
der Folsäure zu binden. Nachträglich werden de Verunrein:igungen unter Ausnutzung
der verschiedenen Löslichkeitsgrade der Erdalkalitnetal:lsalze und Verunreinigungen
abgetrennt. Die Ausbeuten an reiner Folsäure sind in diesem Fall sc'hlec'ht.
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Während die bisher bekannten Verfahren zur Reinigung von synthetischer
Fo1'säure für die Herstellung eines Materials mit einem Gelbalt von bis zu etwa
8o %. Folsäure geeignet sind, sind sie für die großtechnische Herstellung von Folsäure
für pharmazeutische Zwecke nicht sehr befriedigend, da sie mehrmals durchgeführt
werden müssen, um die nahe verwandten Pterine zu entfernen. Es ist gewöhnlfith auch
erwünscht, die Folsäure schließlich aus Wasser zu kristallisieren. Sie ist jedoch
in heißem Wasser nur in einer Menge von etwa 0,5 g/1 löslich, so daß sehr große
Volumina Wasser benötigt werden, was unbequem und mit hohen Kosten verbunden ist.
Außerdem muß gewöhnlich, aktivierte Kohle verwendet werden, um unerwünschte Färbungen
zu teeseitigen. Dabei gehen jedoch beträchtliche Mengen Folsäure verloren, da diese
sich in erheblichem Ausmaß an aktivierte Kohle adsorbiert.
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Es wurde gefunden, da:ß Folsäure von pharmazeutisch annehmbarer Reinheit
aus einem Material, das nur 6511/o Fo%äure enthält, erhalten werden kann, indem
eine wäßrige alkalische Lösung dieser rohen Folsäure (die mit ihren genetisch verwandten
Pterinen verunreinigt ist) mit einem feinzerteilten, festen Oxyd, Hydroxyd oder
Carbonat eines Metalls der 2. Gruppe des Periodischen Systems mit einer Ordnungszahl
von 12 bis 56 inkl., wie z. B. Calciumhydroxyd, in innige Berührung gebracht, das
feste Material davon abgetrennt und die Folsäure aus der geklärten a.Ikafi#chen
Lösung isoliert wird. Calciiumhydiroxyd wird zwar bevorzugt, es können jedoch auch
andere feste, feinzerteilte Oxvde, Hydroxyde und Carbonate, z. B. diejenigen des
Magnresiums, Calciums, Zinks, Strontiums, Cadmiums und Bariums, verwendet werden.
Die folgenden sind besonders geeignet: Caleiumhydroxyd, Calci.umcarbonat, Magnesiumhydroxyd,
Magnesiumcarbonat, Zinkcarbonat, Magnesiumoxyd, Zinkhydroxyd, Calciumoxyd, Zinkoxyd
und Cadmiumcarbonat.
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überraschenderweise wird Falsäure durch Calciumhydroxyd und weitere
Oxyde, Hydroxyde und Carbonate von Metallen der 2. Gruppe aus einer alkalischen
Lösung nicht adsorbiert, während die die Folsäure begleitenden Pterine und andere
färbende Substanzen durch die Metalloxyde, -hydroxyde oder -carbonate stark adsorbiert
«-erden. Die meisten der unerwünschten Pteririe können auf diese. Weise entfernt
werden. 9o bis 981/& der anfänglich. in der Lösung vorhandenen Folsäure kann
in gereinigter Form zurückgewonnen «-erden, indem man einfach die geklärte Lösung
auf etwa go° C erhitzt, das pIi der Lösung auf etwa 3,0 einstellt und die
Folsäure daraus auskristallisieren läßt.
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Da überschüssiges Alkali neutralisiert werden muß, um die gereinigte
Folsäure auszufällen, sollte nur gerade so viel Alkali verwendet werden, als zur
Auflösung der rohen Folsäure und der sie be-
gleitenden genetischen Verunreinigungen
erforderlich ist. Man verwendet am besten etwa 3 M01-äquivalente Alkali pro Mol
Folsäure. Zur Auflösung der rohen Folsäure können verschiedene Alkalien verwendet
werden, wie z. B. Ammoniümhyd.roxyd und Al'kafihyd@roxyd.e, wobei vorzugsweise Natriumhydroxyd
verwendet wird.
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Lösungen mit einem Gehalt von etwa 3 bis 1o g Folsäure pro Liter,
und vorzugsweise diejenigen, die auf etwa 8 g/1 konzentriert sind, können nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren be'fimidelt werden. Die rohe Folsäure kann direkt im
erforderlichen Volumen an verdünntem Alkali oder zweckmäßiger in einem kleinen Volumen
einer i n-Afkalilösung gelöst werden, die dann auf eine für die anschließende Behandlung
mit dem Oxyd, Hydroxyd oder Carbonat eines Metalls der 2. Gruppe geeignete Folsäurekonzentration
verdünnt wird. Da die Folsäure durch die Oxyde, Hydroxyde und Carbonate der Metalle
der 2. Gruppe nicht adsorbiert wird, während die genetischen Verunreinigungen der
Folsäure mit Leichtigkeit adsorbiert werden, kann die Menge des zerkleinerten festen
Meta;1'loxyds, -hydroxyds oder -carbonats innerhalb weiter Grenzen schwanken. Aus
wirtschaftlichen Gründen ist es jedoch gew6hnlic;h zweckmäßig, ein Verhältnis von
etwa i g der zerkleinerten festen Metalloxyde, -hydroxyde oder -carbonate pro Gramm
Folsäure anzuwenden. Calciumhydroxyd, das vorzugsweise für die Durchführung des
erfindungsgemäßen-Verfahrens verwendet wird, ist in Wasser etwas löslich, und zwar
mehr löslich in kaltem als in heißem Wasser (etwa 0,13 g Ca0/ioo cm3 bei o° C und
etwa o,o6 g Ca0/ioo cm3 bei ioo° C). Um die gewünschte Adsorption zu erzielen, muß
desthaalb dafür gesorgt werden, daß eine genügende Menge Calciumhy droxyd in Form
diskreter Partikel in der Suspension vorhanden ist. Ähnliche Überlegungen gelten
auch für die anderen genannten @1 etalloxyde, -hydroxyde und -carbonate. Das Gemisch
wird gewöhnlich während etwa 11/z Stunden bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Es
eignen sich jedoch auch kürzere oder längere Zeiten und etwas tiefere oder höhere
Temperaturen.. Wenn gewünscht, kann die alkalische Folsäurelösung, die auch die
genetischen Verunreinigungen gelöst enthält, mehrmals mit dem Metalloxyd, -hydroxyd
oder -carbonat behandelt oder aufeinanderfolgenden Bethandlungen mit verschiedenen
Metalloxyden, -hydroxyden und -carbonaten unterworfen -#verden..'in welchem Fall
die erforderliche Gesamtmenge kleiner sein kann
als die für eine
einzige Behandlung erforderliche Menge und eine größere Menge Folsäure mit einem
höheren Reinheitsgrad erhalten werden kann als bei einer einzigen Behandlung.
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An Stelle von Calciumhydroxyd (gelöschter Kalk) kann man äquivalente
Mengen gebrannten Kalk (Calciumoxyd) verwenden. Normalerweise spielt die Reinheit
des Kalkes keine Rolle, so daß gewdhnlich technische Produkte verwendet werden können.
Zur Erzielung einer maximalen Adsorptionswirkung sollte der Kalk in gepulverter
Form verwendet werden. Die gleichen Überlegungen gelten für die Behandlungen, bei
welchen andere Metallhyd.roxyde, -oxyde oder -carbonate verwendet werden.
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Das Metalloxyd, -hydroxyd oder -carhonat und die daran adsorbierten
Verunreinigungen können auf verschiedene Arten von der Alkali'lösung der Folsäure
abgetrennt werden, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Die Lösung
kann, wenn gewünscht, direkt filtriert werden, wird jedoch zweckmäßigerweise unter
Verwendung eines Filtrierhilfsmittels, wie z. B. Diatomeenerde, filtriert.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Folsäure aus der gereinigten Alkali'lösung isoliert, indem das pH der Lösung
auf etwa 3,0 eingestellt wird, wobei die Folsäure ausfällt. Um Folsäure in
kristallisierter Form zu erhalten, die leicht filtrierbar ist, arbeitet man vorzugsweise
so, daß man die Alkalilösung von gereinigter Folsäure auf eine Konzentration von
etwa 3 g Folsäure pro Liter verdünnt, die Lösung auf etwa 9o bis 98° C erhitzt und
dann das PH der heißen Lösung auf etwa 3,0 mit verdünnter Salzsäure einstellt. Die
Folsäure kristallisiert dann langsam aus der Lösung aus.
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Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren im besonderen mit Bezug auf
ein Material, das etwa 65 bis 85 % Folsäure enthält, beschrieben wurde, kann es
natürlich auch zur Reinigung von Gemischen, die andere Mengen Folsäure enthalten,
angewendet werden.
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Die folgenden Beispiele besitzen aussc'hließlic'h erläuternden und
nicht etwa einschränkenden Charakter. Beispiel i Eine Alkalilösu.ng von rollier
Folsäure, die durch Auflösen von 26,2- g roher Falsäure mit einem
Gehalt von 17,2 g Fol,säu,re (65,6%) im 137 cm3 i n-Natrium!hydroxydlösung und Verdünnen
der Lösung mit 189o cm3 Wasser hergestellt worden war, wurde mit 17,2 g Calciumhydroxyd
vermischt und bei Raumtemperatur während etwa 1i/2 Stunden gerührt. Nachdem die
erhaltene Suspension sich gesetzt hatte, wurde die Flüssigkeit abdekantiert. Die
Flüssigkeit wurde filtriert. Das feste Material wurde mit 58,5 crn3 Wasser gewaschen
und .abfiltriert. Die Filtrate wurden vereinigt und auf 5,7, 41 verdünnt. Das pli
der verdünnten Alkalilösung von gereinigter Folsäure wurde mit in-Salzsäure auf
8,o bis io,o eingestellt, worauf die Lösung auf etwa 9o bis 95° C erhitzt und deren
PH durch Zugabe von i n-Salzsäure unter fortwährendem Rühren auf etwa
3,0 eingestellt wurde. Der erhaltene Schlamm wurde während 2 Tagen in einem
Eiskasten gekühlt und dann filtriert Der Filterkuchen wurde durch Wiederaufschlämmung
mit 65o cm3 angesäuertem Wasser vom PH 3,0 gewaschen und filtriert. Der Filterkuchen
wurde dann eingefroren und getrocknet, wobei 16,99 g Folsäure erhailten wurden,
die 7,4% Feuchtigkeit enthielten und einen Gehalt von 94,10/0 Folsäure, bezogen
auf den Trockenzustand, aufwiesen. Beispiel e Eine Lösung von roher Folsäure, hergestellt
durch Auflösen von 564 g rdher Folsäure mit einem Gehalt vom 489 g Folsäure in 3
1 1 n-Natriumhydroxyd'lösung und Verdünnen mit 56,4 1 Wasser, wurde mit 489 g Calciumhydroxyd
während 1i/2 Stunden gerührt und dann durch ein Bett von Diatomeenerde filtriert.
Die geklärte Alkalilösung von Folsäure wurde hierauf auf etwa 9o bis 95° C erhitzt
und mit i n-Salzsäure versetzt, um deren PH auf etwa 3,0 einzustellen. Der
erhaltene Schlamm wurde über Nacht gekühlt und dann filtriert. Es wurden 485 g kristallisiertes
Material mit einem Gehalt von 90,3%. Folsäure erhalten, das sieh für die therapeutische
Verwendung eignete. Beispiel 3 2,3 g rohes Material mit einem Geh alt von 2 g Folsäure
wurden in 15 cm3 i n-Ammoniumhydroxydlösung gelöst. Die Lösung wurde mit
250 cm3 Wasser verdünnt. Ein ioo :m3 betragender aliquoter Teil dieser Lösung
wurde mit 80o mg Calciumhydroxyd vermischt und während 1i/2 Stunden gründlich gerührt.
Die Suspension wurde filtriert, worauf die erhaltene geklärte Alkalilös.ung von
Folsäune mit 150 cm= Wasser verdünnt und deren pH mit i n-Salzsäure auf etwa
3,0 eingestel'lt wurde. Nachdem die angesäuerte Lösung während 24 Stunden
im einem Eiskasten stehengelassen worden war, wurde die kristallisierte Folsäure
abfiltriert und getrocknet. Es wurden 68o mg eines Materials erhalten, das einen
Gehalt von 89,60/a Folsäure und eine gute Farbe aufwies. Beispiel 4 Eine wäßrige
Aufschlämmung von roher Folsäure wurde in einer minimalen Menge wäßriger 5 n-Natriumhydroxyd'lösung
gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser auf eine Konzentration von 5,11 g Folsäure pro
Liter verdünnt.
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Zu ioo cm3 dieser Lösung wurden 51o mg Magnesiumhydroxyd gegeben.
Die erhaltene Suspension wurde während 9o Minuten gerührt, dann mit ioo mg Filtriersufistanz
versetzt und durch ein Bett von Filtriersubstanz filtriert. Der Filterkuc
hei
wurde mit 25 cms Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden. auf Zoo cm3
verdünnt. Ein igo cm3 betragender aliquoter Teil der Lösung wurde auf etwa 95° C
erhitzt, worauf dessen pH im Verlauf von etwa 15 Minuten auf 3,0 eingestellt
wurde. Nachdem die angesäuerteLösungüber Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen
worden war, wurde der Niederschlag abfiltriert und in gefrorenem Zustand getrocknet.
Es wurden 542 mg eines Materials erhalten, das einen Gehalt von 93,40/0 Folsäure,
bezogen auf den Trockenzustand (91-% Ausbeute), aufwies.
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Beispiel s Ein zweiter, ioo cm3 betragender aliquoter Teil der im
Beispiel 4 genannten Fal'säurelösungwurde in der im Beispiel, beschriebenen Weise
mit 5 io mg Zinkcarbonat behandelt. Es wurden 552 mg eines Materials erhalten, das
einen Gehalt von 95 0/0 Folsäure (95,3 0/a Ausbeute), bezogen auf den Trockenzustand,
aufwies.
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Beispiel 6 Chromatographieren von Folsäure Durch Eintragen eines Schlammes
aus 0,5 g gelöschtem Kalk und i g Filtriersubstanz in Wasser in ein Glasrohr
und Abtropfenlässen des Wassers wurde eine Kolonne hergestellt. Nachdem der Wasserspiegel
knapp über dem oberen. Ende der Kolonne lag, wurden 40 em3 einer Lösung, hergestellt
durch Auflösen von o,5 g eifies etwa 82% Folsäure enthaltenden Materials in etwa
3 cm3 wäßriger 2,5 n-Natriumhydroxydlösung und Verdünnen auf ioo cm3, auf das obere
Ende der Kolonne gegeben, wobei der Abfluß gesammelt wurde. In der Kolonne entwickeilte
sich ein dunkelbraunes Band. Der Abfluß war befIgelb, gefärbt. Durch Analyse- wurde
festgestellt, daß 9¢% der anfänglic'h- vorhandenen Folsäure in gereinigter Form
erhalten worden waren. Die Erfindung ist nicht auf die im vorangehenden beschriebenen
Ausführungsformen beschränkt.