DE1045392B

DE1045392B - Verfahren zur Herstellung von reinen Verbindungen des Tetracyclins

Info

Publication number: DE1045392B
Application number: DEA26165A
Authority: DE
Inventors: Leland Leroy Smith; Michael Marx; Siegfried Arthur Muller
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1955-12-09
Filing date: 1956-12-07
Publication date: 1958-12-04

Description

Verfahren zur Herstellung von reinen Verbindungen des Tetracyclins Die Erfindung betrifft die Herstellung reiner Verbindungen des Tetracyclins.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden diese Verbindungen erhalten, indem man eine Lösung von Tetracycldn bzw. seinen Salzen mit Säuren oder Basen mit Harnstoff, vorzugsweise einer wäßrigen Harnstofflösung, bei einem p$ Wert von 2,5 bis 6,0, vorzugsweise 3 bis 4, umsetzt und die erhaltene Tetracyclin@Harnstoff-Additionsverbindung in einem organischen, besonders hydroxylgruppenhaltige.n Lösungsmittel mit Wasser oder Säuren gewünschtenfalls zersetzt.
Bei der Durchführung des Verfahrens ist es besonders zweckmäßig, etwa 6 bis 301 Äquivalente kristallisierten Harnstoff je Äquivalent Tetracyclin zu ver-,venden.
Das Verfahren wird mit Vorteil auf Methylisobutylketon-, Butanol- oder wäßrige Lösungen von Tetracyclin angewandt. Man kann es aber auch mit sehr gutem Erfolg auf eine Tetracyclinlösung anwenden. die bei der Hydrierung von Ch@lortetracyclin in Gegenwart eines Palladiumkatalysators erhalten wurde.
Die neue erfindungsgemäß herstellbare Verbindung ist auch bei längerer Lagerung noch stabil, wodurch eine bequeme Möglichkeit geschaffen wird, Tetracyelinp.räparate als Harnstoffverbindung beliebig lange zu lagern und dann leicht wieder in reines Tetracyclin überzuführen. Das neue Produkt kann daher für Export- und andere Zwecke verwendet werden, wo es erforderlich ist, Tetracyclinpräparate über längere Zeiträume zu lagern, ohne daß dabei Verluste an antibiotischer Wirksamkeit auftreten. Ein besonderer Vorteil ist auch darin zu sehen, daß die erfindungsgemäß herstellbare Verbindung zum Reinigen von Tetracyclin, insbesondere zum Abtrennen aus Gärlösungen, verwendet werden kann.
Die erfindungsgemäß herstellbare Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung weist ein Molverhältnis von Tetracyclin zu Harnstoff wie 1 : 1 auf. Die Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung kann in einer Anzahl hydratisierter Formen, z. B. als Trihydrat oder als Monohydrat, erhalten werden. Die Löslichkeit dieser Verbindung in Wasser liegt in der Größenordnung von 32,5 y/ml. Die optische Drehung der Verbindung wurde zu [a] ö5 = - 220,0° (0,5 °% in Methanol) und [a] 05=-229,0° (0,5/o in 0,03 n-Salzsäure) bestimmt. Die Verbindung schmilzt bei 143 bis 146° C unter Zersetzung, und ihr Infrarotspektrum weist deutliche Banden bei 5,75 und 6,55 IL oberhalb der normalen Tetracyclin-Infrarotbanden auf.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im einfachsten Fall Tetracycli.n oder ein Säure- oder Basensalz desselben, z. B. Salze mit Mineralsäuren, Alkali-, Erdalkali-, Ammoniumhydroxyden und Aminen, in einer wäßrigen Harnstofflösung aufgeschlämmt und die dann ausgefallene Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung abgetrennt.
Die Herstellung einer Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung dient auch zur Gewinnung von verhältnismäßig reinemTetracyclin ausLösungsmittelextrakten, die rohes Tetracyclin und gleichzeitig Verunreinigungen enthalten.
Zum Beispiel wird ein organischer Lösungsmittelextrakt von rohem Tetracyclin mit einer wäßrigen Harnstofflösung versetzt, das Gemisch gerührt und der pH-Wert durch Zugabe einer geeigneten Mineralsäure, wie Salzsäure, Schwefelsäure u. dgl., auf einen Wert innerhalb des Bereichs von 2,5 bis 6,0, vorzugsweise 3 bis 4, gebracht, worauf sich die Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung bildet und aus der Lösung ausscheidet und die Verunreinigungen gelöst bleiben. Die Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung wird dann durch Filtrieren gewonnen. Das erhaltene Produkt ist praktisch frei von Verunreinigungen.
Es werden vorzugsweise etwa 3 bis. etwa 30 Äquivalente Harnstoff in wäßriger Lösung mit 1 Äquivalent rohem Tetracyclin in dein Usungsmittelextrakt umgesetzt. Die wäßrige Harnstofflösung ist vorzugsweise nur zur Hälfte oder weniger gesättigt. Es werden Ausbeuten von 90 % und darüber an Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung aus Lösungsmittelextrakten erhalten.
Beispielsweise kann ein Methylisobutylketonextrakt von Tetracyclin mit angesäuertem Wasser vom pH 1,5 bis 2.5 in Berührung gebracht werden. Die beiden Phasen werden vermischt, getrennt, und das Säuresalz des Tetracyclins gelangt in die wäßrige Phase. Dieser saure wäßrige Extrakt kann dann, statt ihn durch Zugabe einer Base auf einen pH-Wert von 2,5 bis 8 zu bringen, mit etwa 6 bis etwa 30 Äquivalenten festem Harnstoff je Äquivalent Tetracyclin versetzt werden. Der pH-Wert des sauren wäßrigen Extrakts kann dann auf einen Wert zwischen 3 und 5 eingestellt werden, worauf die Tetracyclin-Harnstoff Verbindung ausfällt und durch Filtrieren gewonnen werden kann. Es kann beispielsweise als Trihydrat hoher Reinheit abgetrennt werden.
In gleicher Weise kann auch der wäßrige Extrakt, den man aus dem sauren Butanolextrakt von Tetracyclin aus Gärmaischen gewonnen hat, mit festem Harnstoff unter Bildung der beschriebenen Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung behandelt werden.
Auch aus Tetracyclinlösungen, die bei der Hydrierung von Chlortetracyclin erhalten werden (vgl. zum Beispiel Journ. Amer. Chem. Soc., Bd. 75, 19'53, S.4621), kann Tetracyclin mit wäßrigem Harnstoff unter Bildung der Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung umgesetzt werden. Bei dieser Arbeitsweise wird ein sehr hochwertiges Tetracyclin großer Reinheit gebildet.
Es ist auch eine vorteilhafte Zwischenverbindung beim Umkristallisieren von rohem Tetracyclin im Anschluß an dessen Gewinnung aus der Gärmaische.
Zum Beispiel kann man rohes neutrales Tetracyclin in wäßriger Harnstofflösung in den oben angegebenen Mengen aufschlämmen und den pH-Wert der Lösung auf einen Wert zwischen 3 und 5 einstellen. Dabei kristallisiert dieTetracyclin-Harnstoff-Verbindung als Trihydrat aus. Bei diesem Umkristallisierungsverfahren wurden Ausbeuten von 85 bis 90 % erhalten, und die durchschnittliche Reinheit betrug etwa 96 bis 10011/0.
Zur Gewinnung des Tetracyclins aus der Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung kann diese in bekannter Abreise zersetzt werden. Zum. Beispiel wird die Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung in einem geeigneten hydroxylhaltigen organischen Lösungsmittel, z. B. in Butanol oder 2-Äthoxyäthanol, aufgeschlämmt und mit einer Säure zum Zwecke der Fällung eines Säuresalzes des Tetracyclins behandelt, wobei der Harnstoff in Lösung bleibt. So kann beispielsweise Salzsäure unter Bildung von Tetraeyclinhydrochlorid verwendet werden. Tetracyclinhydrochlorid kann auch durch Lösen der Tetracycl.in-Harnstoff-Verbindung in einem Gemisch aus 2-Äthoxy äthanol und Butanol durch Zugabe einer Base, z. B. Triäthylamin, und anschließendes Ansäuern mit Salzsäure gebildet werden. Selbstverständlich kann man auch andere Säuren, z. B. Ameisensäure oder Trichloressigsäure, verwenden. Die Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung kann auch in einem organischen Lösungsmittel gelöst und anschließend daraus neutrales Tetracyclin durch Zugabe von Wasser und Erhöhen des pH-Wertes der Lösung bis zur ungefähren Neutralität gefällt werden. Geeignete organische Lösungsmittel sind Methanol, Äthanol, Butanol, Aceton oder Tetrahydrofuran. Neutrales Tetracyclin. kann auch durch Lösen der Verbindung in angesäuertem Wasser und Neutralisieren mit Alkali unter Kristallisation des neutralen Tetracyclins erhalten werden. Es hat sich gezeigt, daß die Ausbeuten bei der Überführung der Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung in Tetracyclinhydrochlorid nach den oben beschriebenen Arbeitsweisen in der Größenordnung von 90 0/0 liegen.
Es ist überraschend, daß Tetracyclin mit Harnstoff eine schwerlösliche Verbindung bildet, da mit anderen Antibiotika, wie Chlortetracycliin, Oxytetracyclin, Anhydrotetracyclin, Ouatrimycin oder Chlorquatrimycin, keine schwerlöslichen Harnstoffverbindungen gebildet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 21 Tetracyclinmais.che mit einem Aktivitätsgehalt von 5100 y/ml wurden mit 25%iger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 1,8 eingestellt, 40 Minuten gerührt und mittels 200 g Filterhilfe »Hyflo-Supercel« filtriert. Die Feststoffe wurden in 1.51 Wasser von 45° C aufgeschlämmt und mit 2,5 ml 25%iger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 1,85 eingestellt, 40 Minuten gerührt und abfiltriert. Die vereinigten Filtrate wurden mit 88,2 g Ammoniumoxalat versetzt, 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt, 2 Stunden bei 4° C stehengelassen und filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 501 ml Wasser gewaschen. Die gewonnenen 2,97 1 wäßrigen Extrakts wurden mit 300 m1 Methylisobutylketon und 15 ml 50%igem Cetyltrimethylamrnoniumchlorid (»Arquad 16«) versetzt. Das Gemisch wurde mittels 23 ml 18 n-Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,8 gebracht. Nach 20minütigem Rühren wurden die beiden Phasen getrennt. Zu der wäßrigen Phase wurden 100 ml Methylisobutylketon. 5 ml 500/aiges Cetyltrimethylammoniumchlorid und zur pH-Werteinstellung auf 9,8 2 ml 18 n-Natronlauge gegeben. Das Gemisch wurde 20 Minuten gerührt und getrennt, und die wäßrige Phase wurde mit weiteren 100 ml des gleichen Lösungsmittels extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 40 ml Wasser geschüttelt, das Waschwasser wurde abgetrennt und verworfen. Es wurde ein zweites Mal mit 40 1 Wasser gewaschen, wobei Natriumhydroxyd zur Einstellung des pH-Wertes auf 11,5 vor dem Filtrieren und Abtrennen verwendet wurde.
200 ml des geklärten Methyl.isobutylketonextrakts mit einem Aktivitätsgehalt von 40 5001 y/ml Tetracyclin wurden mit 32 ml gesättigter wäßriger Harnstofflösung und 32 ml Wasser behandelt. Zur Senkung des pn-Wertes von 9,0 auf 5,5 wurde konzentrierte Salzsäure zugesetzt. Das Gemisch wurde 16 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung gehalten und nach Einstellung des pH-Wertes auf 3,0 durch weiteren Zusatz von Salzsäure weitere 48 Stunden gerührt. Das ausgefallene Produkt wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 50° C getrocknet. Man erhielt eine Ausbeute von 7,80 g der Tetracycldn-Harnstoff-Verbindung mit einem Aktiv itätsgehalt von 938 y/mg, was einer Ausbeute von 90,3 % der Theorie entspricht.
Analyse für Tetracyclin-Harnstoff-Monohydrat (C23 1-130 N4 010) : Berechnet C = 52,80 0/0, H = 5,75 %., N = 10,72 1/o; gefunden C = 52,85%, H = 5,68%, N = 10,70%. Beispiel 2 Zu 1,051 Methylisobutylketonextrakt mit einem Aktivitätsgehalt von 95 400 y/ml Tetracyclin (hergestellt wie im Beispiel l beschrieben) wurden 525m1 Wasser gegeben. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 52 ml konzentrierter Salzsäure auf 1,75 eingestellt. Durch Schütteln und Trennen des Gemisches erhielt man 736 ml wäßrigge Phase mit einem Aktivitätsgehalt von 124 800 y/ml. 100 ml des wäßrigen Extrakts wurden bis zur vollständigen Lösung mit 50 g Harnstoff gerührt. Der pH-Wert wurde mit 18 n-Natriumhydroxyd auf 4,60 eingestellt und das Gemisch 24 Stunden gerührt. Das Produkt wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 50° C getrocknet. Man erhielt eine Ausbeute von 10,78 g der Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung mit einem Aktivitätsgehalt von 905 y/mg, entsprechend einer Ausbeute von 78,1 % der Theorie.
Beispiel 3 400 ml eines, wie im Beispiel 2 beschrieben, hergestellten wäßrigen Extrakts mit einem Aktivitäts-gehalt von 67 500 ylml Tetracyclin wurden mit 120 g Harnstoff bis zur vollständigen Lösung gerührt. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von Natriumhydroxyd auf 3,3 erhöht. Nach 40stündigem mäßigem Rühren wurde der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 50° C getrocknet. Man erhielt eine Ausbeute von 26,46 g Tetracyclin^Harnstoff-Verbindung mit einem Aktivitätsgehalt von 932y /mg, entsprechend 91,2 % der Theorie.
Beispiel 4 21 Tetracyclinmaische mit einem Aktivitätsgehalt von 3970 y/ml wurden mit 10g Magnesiumtrisilikat (»Magnesoil«) und 120g einer Filterhilfe (»Hyflo«) behandelt. Der pH-Wert wurde mit Natriumhydroxyd auf 7,6 eingestellt. Nach 30minütigem Rühren wurde das Gemisch filtriert und der Filterkuchen in 600 ml Butanol aufgeschlämmt und mit 18 ml konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,42 gebracht. Nach 40minütigem Rühren wurde die Aufschlämmung filtriert und der Kuchen erneut mit 600 ml Butanol und 30 ml Wasser aufgeschlämmt, mit 2 ml Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,47 eingestellt, 40 Minuten gerührt und abfiltriert. Dieser Kuchen wurde in 600 ml Butanol und 30- ml Wasser aufgeschlämmt und durch Zugabe von 1 ml Salzsäure auf einen p11-Wert von 1,38 eingestellt. Das Gemisch wurde 40 Minuten gerührt, filtriert und der Kuchen mit 250 ml Butanol gewaschen.
Die 3 Butanolextrakte und. das Waschbutanol wurden vereinigt, mit 2 g Entfärbungskohle (»Darco G 60«) und 10 g Natriumchlorid behandelt, 15 Minuten gerührt und mittels eines Filterhilfsmittels (»Hyflo«) filtriert. Die filtrierte Lösung wurde bei 4° C stehengelassen und. die Salzlösungsphase abgetrennt. Der geklärte Butanolextrakt wurde mit 18 n-Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 1,85 eingestellt und im Vakuum bei 20 bis 24° C auf etwa 110 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde viermal mit 110 ml Wasser extrahiert, wobei zur Aufrechterhaltung eines PH-Wertes von 1,8 bis 2,0 konzentrierte Salzsäure verwendet wurde. Die vereinigten wäßrigen Extrakte wurden zweimal mit 22 ml Chloroform gewaschen. Der gewaschene wäßrige Extrakt wurde im Vakuum auf 120 ml eingeengt und das Konzentrat mit 2,5 ml Butanol und 3 g 80%igem Tetranatriumäthylendiamintetraacetat (»Versene«) versetzt. Der pÄ Wert wurde mit 18 n-Natriumhydroxyd auf 6,2 eingestellt. Die Lösung wurde über Nacht gerührt, und die Kristalle wurden abfiltriert, zweimal mit 6 ml mit Butanol gesättigtem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt eine Ausbeute von 5,77 g. Das Produkt hat einen Aktivitätsgehalt von 1003 y/mg. Dies stellt eine 810/aige Ausbeute an Tetracyclin aus der Maische dar, wenn man die während des Verfahrens für die Gehaltsprüfung entnommenen Proben berücksichtigt.
10g rohes neutrales Tetracyclin (815 y/mg) wurden 30 Minuten in 50 ml gesättigter wäßriger Harnstoff lösung aufgeschlämmt, die 4 Tropfen eines Netzmittels, nämlich des Isooctylphenyläthers von Polyäthylenglykol (»Triton-X-100«), enthielt. Lösung und Kristallisation erfolgten gleichzeitig. Das Produkt wurde abfiltriert, mit Wasser und dann mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt eine Ausbeute von 8,54 g Tetracyclin-Harnsto.ff-Verbindung mit einem Aktivitätsgehalt von 863 y /mg, was 90,5 % der Theorie entspricht.
Beispiels 5 g rohes Tetracyclinhydrochlorid wurden in 25 ml gesättigter wäßriger Harnstofflösung und 25 ml Wasser gerührt. Man erhielt eine praktisch klare Lösung, die filtriert wurde. Die Kristallisation setzte nahezu augenblicklich ein. DieAufschlämmu:ng wurde 5 Stunden stehengelassen und dann filtriert. Das Produkt wurde mit fünf 10-ml-Anteilen Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 3,34 g Tetracyclin-Harnstoff-Trihydrat vom F. = 143 bis 146° C (Zersetzung). Die spektrophotometrische Prüfung ergab eine Wirksamkeit von 842 y/mg, die mikrobiologische Prüfung (Trübungsmessung) von 810 7/mg; optische Drehung [a] 2D5= - 220° (0,5 % in Methanol), [a] ä5 = - 229,0° (0,5 % in 0,03 n-HCl). Analyse: C93 H28 N4 09 - 3H2 O Berechnet ... C = 49,46 %, H = 6,14 %, N = 10,03 %, Harnstoff = 10,75 0/0; gefunden . . . C = 49,69 0/0, H = 6,42 %, N = 9,97%, Harnstoff = 11,23 0/0. Beispiel 6 5 g Chlortetracyclinhydrochlorid wurden mit 10 ml 2-Äthoxyäthanol, 10 ml Butanol, 0,7 ml Wasser, 0,7 g 50/aigem Palladi.umkatalysator auf Aktivkohle und 3,4 ml Triäthylamin vermischt. Das Gemisch wurde auf einer Parr-Schüttelvorrichtung hydriert, wobei die berechnete Wasserstoffmenge nach 20 Minuten aufgenommen worden war. Der Katalysator wurde abfiltriert und mit 5 ml Butanol gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeiten wurden vereinigt. Die vereinigte Lösung wurde mit 30 ml gesättigter wäßriger Harnstofflösung und 30 ml Wasser und zur Einstellung des pH-Wertes des Gemisches auf etwa 3 mit 0,83 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. Nach 28stündigem Stehenlassen wurde die ausgefallene Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Das Material wog 4,0 g und ergab bei der Gehaltsprüfung 924 y/mg und 3,36 0/0 Wasser.
5 g dieser Verbindung wurden in 35 ml eines Gemisches aus Butanol und 2-Äthoxyäthanol (90:10), welches das berechnete Äquivalent an konzentrierter Salzsäure enthielt, aufgeschlämmt. Die erhaltene Lösung wurde sofort filtriert, angeimpft und 48 Stunden zum Zwecke der Kristallisation gerührt. Das Produkt wurde abfiltriert, mit Propanol-(2) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 3,94 g Tetracyclinhydrochlorid mit einem Aktivitätsgehalt von 1002 7 ,/mg, was einer Ausbeute von 91,4 °/o der Theorie entspricht.
Beispiel 7 9 g der, wie im Beispiel 1 beschrieben, hergestellten Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung wurden in 45m1 eines Gemisches aus Butanol und 2-Äthoxyäthanol (2: 1) aufgeschlämmt und zur Senkung des pH-Wertes auf 1,7 mit konzentrierter Salzsäure versetzt. Das Gemisch wurde 60 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und dann filtriert. Das Produkt wurde mit Propanol-(2) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 7,49 g Tetracyclinhydrochlorid mit einem Aktivitätsgehalt von 982 y/wg (90,2Q/oige Ausbeute}. Das Produkt entsprach allen vorgeschriebenen Prüfungen für Tetracyclinhydrochlorid für orale Verabreichung. Beispiel 8 5 g der Tetracyclin-Harnstoff-Verbindung mit einem Aktivitätsgehalt von 817 y/mg wurden unter Erwärmen in 100 ml Methanol unter Bildung einer klaren Lösung gelöst. Die Lösung wurde noch warm filtriert und mit 100 ml destilliertem Wasser vermischt. Das Gemisch wurde etwa 3 Stunden lbßi Zimmertemperatur stehengelassen. Das gebildete neutrale Tetracyclin wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über P205 getrocknet. Das Produkt hatte einen Aktivitätggehalt von 1009 y/mg. Die Mikroanalyse ergab, daß das Produkt ein hydratisiertes neutrales Tetracyclin war. Für die Herstellung der Ausgangsverbindungen wird Schutz im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht beansprucht.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von reinen Verbindungen des Tetracyclins, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung von Tetracyclin bzw. seinen Salzen mit Säuren oder Basen mit Harnstoff, vorzugsweise einer wäßrigen Harnstofflösung, bei einem pl,-Wert von 2,5 bis 6,0, vorzugsweise 3 bis 4, umsetzt und die erhaltene Tetracyclin-Harnstoff-Additionsverbi.ndung in einem organischen, besonders hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmittel mit Wasser oder Säuren gewünschtenfalls zersetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 6 bis etwa 30 Äquivalente kristallisierten Harnstoff je Äquivalent Tetracyclin verwendet.
3. Verfahren mach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangslösung eine Methylisobutylketon- oder B@utanol- oder wäßrige Lösung von Tetracyclin verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangslösung eine Lösung verwendet, die bei der Hydrierung von Chlortetracyclin in Gegenwart eines Palladiumkatalysators erhalten wurde.