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EP2115111B1 - Carboxylgruppen tragende benzophenon- oder benzoesäureanilid-derivate als enzymstabilisatoren - Google Patents

Carboxylgruppen tragende benzophenon- oder benzoesäureanilid-derivate als enzymstabilisatoren Download PDF

Info

Publication number
EP2115111B1
EP2115111B1 EP07847764.3A EP07847764A EP2115111B1 EP 2115111 B1 EP2115111 B1 EP 2115111B1 EP 07847764 A EP07847764 A EP 07847764A EP 2115111 B1 EP2115111 B1 EP 2115111B1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
protease
amino
cooh
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Not-in-force
Application number
EP07847764.3A
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
EP2115111A1 (de
Inventor
Andreas Michels
Robin Ghosh
Cornelius Bessler
Daniela Lowis
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Priority to PL07847764T priority Critical patent/PL2115111T3/pl
Publication of EP2115111A1 publication Critical patent/EP2115111A1/de
Application granted granted Critical
Publication of EP2115111B1 publication Critical patent/EP2115111B1/de
Not-in-force legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38663—Stabilised liquid enzyme compositions

Definitions

  • the present invention relates to detergents containing carboxyl-bearing benzophenone or benzoic acid anilide derivatives which act as protease inhibitors and are thus suitable enzyme stabilizers.
  • enzymes in detergents are well established in the art. They serve to extend the range of services of the funds concerned according to their specific activities. These include in particular hydrolytic enzymes such as proteases, amylases, lipases and cellulases. The first three hydrolyze proteins, starches and fats and thus contribute directly to Schmutzentfemung. Cellulases are used in particular because of their tissue effect.
  • hydrolytic enzymes such as proteases, amylases, lipases and cellulases.
  • the first three hydrolyze proteins, starches and fats and thus contribute directly to Schmutzentfemung.
  • Cellulases are used in particular because of their tissue effect.
  • Another group of detergent enzymes are oxidative enzymes, in particular oxidases, which, if appropriate, together with other components, preferably serve to bleach soiling or to produce the bleaching agents in situ.
  • enzymes which are subjected to constant optimization, further enzymes are constantly being made available for use in detergents, in order in particular to be able to optimally treat special soiling, such as, for example, pectinases, ⁇ -glucanases, mannanases or further hemicellulases for the hydrolysis of, in particular, special vegetable polymers.
  • special soiling such as, for example, pectinases, ⁇ -glucanases, mannanases or further hemicellulases for the hydrolysis of, in particular, special vegetable polymers.
  • proteases and in particular serine proteases, which include the subtilases. They cause the degradation of protein-containing stains on the items to be cleaned. However, they also hydrolyze themselves (autoproteolysis) and all other proteins contained in the agents concerned, i. especially other enzymes. This happens especially during the cleaning process, i. in the aqueous wash liquor, if comparatively favorable reaction conditions are present. However, this also happens during the storage of the respective agent, which is why with increasing storage time always a certain loss of enzyme activities, such as the protease activity, accompanied.
  • the enzyme activity in the detergent is inversely proportional to the storage time, with increasing storage time the enzyme activity decreases more and more. This is particularly problematic in gel or liquid and in particular in water-containing formulations, because in this with the water contained both the reaction medium and the hydrolysis reagent are available.
  • One goal in the development of detergents is therefore to stabilize the enzymes contained, especially during storage.
  • the protection understood against various unfavorable influences such as against denaturation or decay by physical influences or oxidation.
  • One focus of these developments is the protection of the contained proteins and / or enzymes against proteolytic cleavage. This can be done by the construction of physical barriers, such as by encapsulation of the enzymes in special enzyme granules or by packaging the means in two- or multi-chamber systems.
  • Another frequently approached approach is to add chemical compounds to the agents which inhibit the proteases and thus act collectively as stabilizers for the proteases and the other proteins and enzymes contained. It must be reversible protease inhibitors, since the protease activity is only temporarily, especially during storage, but not be suppressed during the cleaning process.
  • Polyols in particular glycerol and 1,2-propylene glycol, benzamidine hydrochloride, borax, boric acids, boronic acids or their salts or esters are established as reversible protease inhibitors in the prior art.
  • These include, in particular, derivatives with aromatic groups, for example ortho, meta or para-substituted phenylboronic acids, in particular 4-formylphenylboronic acid (4-FPBA) or the salts or esters of the abovementioned compounds.
  • 4-FPBA 4-formylphenylboronic acid
  • peptide aldehydes that is oligopeptides with reduced C-terminus, especially those of 2 to 50 monomers, are described for this purpose.
  • peptidic reversible protease inhibitors include ovomucoid and leupeptin.
  • specific, reversible peptide inhibitors and fusion proteins from proteases and specific peptide inhibitors are used for this purpose.
  • polyols such as glycerol and 1,2-propylene glycol have proved to be unfavorable due to their high concentrations of use necessary, because the other active ingredients of the respective agents can thus be contained only in proportionally smaller proportions.
  • Boric acid derivatives occupy an outstanding position among the serine protease inhibitors, which are effective at comparatively low concentrations.
  • the international patent application discloses WO 96/21716 A1 that acting as protease inhibitors boric acid derivatives are also suitable to stabilize enzymes in detergents.
  • a selection of particularly powerful stabilizers are disclosed in the international patent application WO 96/41859 A1 ,
  • boric acid derivatives have a decisive disadvantage.
  • a protease is to be understood as meaning all enzymes which are capable of hydrolyzing acid amide linkages of proteins.
  • the proteases are also detailed below.
  • the compound represented by the general structural formula is an aromatic compound having two benzene rings linked by a keto or an acid amide group according to the feature (a). It is thus a benzophenone or benzoic acid anilide derivative.
  • This benzophenone derivative can according to the features (b) and (c) in both rings as radicals R1, R2, R3, R4 and R5 (in ring 1) or R6, R7, R8, R9 and R10 (in ring 2) Hydrogen (H), a carboxyl (COOH), a methyl (CH 3 ), an ethyl (C 2 H 5 ), a hydroxyl (OH), a hydroxymethyl (CH 2 OH), an amino (NH) 2 ) and / or carry a halogen.
  • the prerequisite is that in each of the two rings at least one carboxyl group (COOH) is present.
  • rings 1 and 2 can be distinguished, ring 1 being the one which can be attributed to the benzoic acid or its substitution product, and ring 2 being the one which can be attributed to the aniline or its substitution product.
  • a benzophenone or benzoic acid anilide derivative which has in one of the two rings 1 or 2 as possible substituents two of the radicals R 1 to R 10 (A) and (B) which are ortho-stable with one another ( A) a mandatory or optionally further carboxyl group (COOH) mentioned in (b) and / or (c) and (B) are a hydroxymethyl group present as such groups or optionally as a grouping -CH 2 -O-CO- and thus together represent a five-membered lactone with the C atoms of the ring carrying them.
  • a mandatory or optionally further carboxyl group (COOH) mentioned in (b) and / or (c) and (B) are a hydroxymethyl group present as such groups or optionally as a grouping -CH 2 -O-CO- and thus together represent a five-membered lactone with the C atoms of the ring carrying them.
  • two of the substituents (A) and (B) according to (b) and (c) are a carboxyl group (COOH) or a hydroxymethyl group, respectively, in a ring immediately adjacent, ie orthostatic to each other and are present in the form of the hydroxyl group and the carboxymethyl group side by side.
  • these two groups together form a lactone and bind in lactone form to the protease to be inhibited. It is also possible that the binding takes place without prior formation of the lactone form.
  • the realization of the present invention to predetermine the lactone form during the synthesis and to add the already formed lactone as stabilizer to the agent in question.
  • the most suitable form is to be determined experimentally on the basis of the protease to be inhibited and of the envisaged stabilizer, which does not pose any fundamental difficulties for the person skilled in the art.
  • this lactone carboxyl group is counted as a carboxyl group according to feature (b) and (c), respectively but may also be present in addition to another, carboxyl group.
  • the present invention encompasses the compounds mentioned in all protonated and / or deprotonated forms.
  • the carboxyl group (s) (COOH) and optionally the amino group (s) (NH 2 ) are present depending on the pH of the surrounding medium as carboxylate (COO - ) or as ammonium groups (NH 3 + ).
  • carboxylate COO -
  • ammonium groups NH 3 +
  • oppositely charged cations H + , Na + , K + or the like
  • anions Cl - , Br - , formate, acetate, etc.
  • the present invention can be realized. Decisive in each case is the interaction between the invention-relevant compound and the invention to be inhibited / stabilizing protease.
  • the compounds relevant to the invention form a complex with the protease to be inhibited / stabilized according to the invention.
  • the active site of the protease is blocked by a compound which is not hydrolyzable by this enzyme and is not available for hydrolysis of other proteins present.
  • the equilibrium coefficient of this reaction is called the inhibition constant or K i .
  • the first advantage of the compounds relevant to the invention over the prior art, in addition to their lower volume requirement compared with the polyols, is that they have favorable inhibition constants with respect to the proteases which can be used in detergents. This applies, for example, to serine proteases, but also to metalloproteases.
  • the inhibitors thus bind reversibly, i. they do not interfere with solid and not too loose transient interactions with the enzyme.
  • the majority of the protease relevant to the invention is thus present during storage in the form of a protease-inhibitor complex.
  • the protease and possibly other proteins contained, in particular other enzymes are protected in this way against proteolysis by this enzyme (stabilized against proteolysis).
  • the binding equilibrium is shifted in the direction of dissociation, so that the complex dissolves and most of the protease protease protease is proteolytically active.
  • the compounds relevant to the invention are functioning protease inhibitors and thus enzyme stabilizers for detergents in accordance with the task formulated.
  • the second advantage of the invention relevant compounds over the prior art is that they have as elements only C, H, N and O and optionally halides and / or sulfur and in particular are free of boron. They thus do not form the undesirable boron by-products with other detergent ingredients.
  • the compounds mentioned are presumed to act as reversible inhibitors because they bind the substrate of the proteases, in particular with regard to the acid amide bond to be hydrolyzed, structurally same.
  • all proteases can be inhibited by the compounds relevant to the invention, so that they are suitable as protease inhibitors according to the invention.
  • serine proteases as has been shown with reference to the examples of the present application with the positive effect of the compounds experimentally described there on the basis of serine proteases, specifically subtilases, even more specific subtilisins, namely a variant of the subtilisin from Bacillus lentus DSM 5483.
  • the stabilizing compound is selected from one of the following stabilizers: structural formula Surname a) 2- (4-carboxybenzoyl) benzoic acid b) 3,3'-carbonyl-benzoic acid c) 2- (3-carboxybenzoyl) benzoic acid d) 4,4'-carbonylbis-benzoic acid e) 2,2'-carbonyl-benzoic acid f) 3- (4-carboxybenzoyl) benzoic acid G) 2 - [[(3-carboxyphenyl) amino] carbonyl] -benzoic acid H) 2 - [[(4-carboxyphenyl) amino] carbonyl] -benzoic acid i) 2 - [(2-carboxybenzoyl) amino] benzoic acid j) 2-amino-2 ', 4-carbonylbis-benzoic acid k) 3 - [[(4-carboxyphenyl) amino] carbony
  • Such detergents are preferred according to the invention in which the stabilizing compound has an inhibition constant (Ki) of 0.01 to 10 mM, preferably 0.1 to 5, particularly preferably 0.5 to 2, with respect to the protease contained.
  • Ki inhibition constant
  • [E], [I] and [EI] represent the respective molar equilibrium concentrations of enzyme (E), inhibitor (I) and the enzyme-inhibitor complex (EI). According to this definition, a substance with a small Ki is a good inhibitor under the respective test conditions.
  • K i The determination of K i is carried out on the basis of the activity test of the protease in the presence of the corresponding inhibitor.
  • the kinetics of invertin action, Biochem. Z. 49: 333-369 ), the enzymatic parameters K m , and k cat are determined in the presence of various concentrations of the inhibitor. For a Michaelis-Menten kinetics is simplified:
  • K l can be calculated using the Cheng-Prusoff equation ( Equation 2, Cheng Y., Prusoff WH (1973) Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108 ) are determined via the IC 50 value.
  • the determination of the IC 50 via the determination of the catalytic activity to a substrate in the presence of various concentrations of the inhibitor and the fitting of the experimental data to a sigmoidal dose-response with variable slope equation (pseudo-Hill slopes). It is the inhibitor concentration needed to achieve 50% inhibition.
  • K i IC 50 / 1 + S / K d
  • [S] is the substrate concentration in the assay and K d is the dissociation constant for the substrate, which at the IC 50 concentration of the inhibitor can be considered to be identical to K m for the substrate.
  • a protease namely the Bacillus lentus alkaline protease F49 (according to WO 95/23221 A1 ) in the presence of an inhibitor. Since this is a typical subtilisin protease, the values obtained with this enzyme are also typical of other serine proteases, in particular other subtilisin proteases. The exact value for a protease of interest must be determined in doubt on the basis of each specific protease.
  • the protease is in particular in a content of 2 .mu.g to 20 mg per g of the agent, preferably 5 .mu.g to 17.5 mg per g of the agent, more preferably from 20 ⁇ g to 15 mg per g of the agent, most preferably from 50 ⁇ g to 10 ⁇ g of the agent.
  • the stabilizer is contained in agents according to the invention in particular in a content of up to 50 mg per g of the agent, preferably up to 10 mg, more preferably up to 7 mg, most preferably up to 5 mg per g of the agent. Furthermore, it is preferred that the stabilizer in a content of 0.01 to 100 x K i (based on the protease contained), preferably 0.1 to 10 x K l more preferably 1 to 5 x K i is included.
  • the molar ratio of stabilizer to protease is preferably in the range from 1: 1 to 1000: 1, in particular from 1: 1 to 500: 1, particularly preferably from 1: 1 to 100: 1, very particularly preferably from 1: 1 to 20 :1.
  • an agent according to the invention may contain at least one further stabilizer.
  • the detergent is thus characterized in that it contains at least one further stabilizer.
  • these compounds act synergistically, ie the stabilization effect achieved by both compounds exceeds the sum of the two individual stabilization effects.
  • the stabilizer (s) is one or more polyols, in particular glycerol or 1,2-ethylene glycol, an antioxidant, lactate or one or more lactate derivatives or combinations thereof. It is likewise preferably one or more of those enzyme-stabilizing or inhibiting compounds which are described in the international patent applications WO 07/113241 A1 or WO 02/008398 are disclosed.
  • the protease stabilized or reversibly inhibited according to the invention is preferably a serine protease, in particular a subtilase, more preferably a subtilisin.
  • subtilisins BPN 'and Carlsberg examples of such proteases are the subtilisins BPN 'and Carlsberg, the protease PB92, the subtilisins 147 and 309, the alkaline protease from Bacillus lentus, subtilisin DY and the enzymes thermitase, proteinase K which can no longer be assigned to the subtilisins in the narrower sense and the proteases TW3 and TW7.
  • Subtilisin Carlsberg is available in a further developed form under the trade name Alcalase® from Novozymes A / S, Bagsv ⁇ rd, Denmark.
  • the subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase®, and Savinase® by the company Novozymes. From the protease from Bacillus lentus DSM 5483 derived under the name BLAP® protease variants derived.
  • proteases are, for example, under the trade names Durazym ®, relase ®, Everlase® ®, Nafizym, Natalase ®, Kannase® ® and Ovozymes ® from Novozymes, under the trade names Purafect ®, Purafect ® OxP and Properase.RTM ® from Genencor , under the trade name Protosol® ® from Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, under the trade name Wuxi ® from Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, under the trade names Proleather® ® and protease P ® from Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, and the enzyme available under the name Proteinase K-16 from Kao Corp., Tokyo, Japan.
  • proteases are particularly well stabilized or reversibly inhibited by the compounds described.
  • certain variants of proteases i. also variants of said proteases, stabilized by these compounds particularly advantageous.
  • Such protease variants are part of the invention described below.
  • a protease stabilized or reversibly inhibited according to the invention can be a wild-type enzyme or a protease variant.
  • wild-type enzyme is to be understood that the enzyme is present in a naturally occurring organism or in a natural habitat can be isolated from this.
  • enzymes are modifiable and sometimes selectively modified, in particular in order to adapt their properties to the intended uses or to influence their catalytic activity. These changes often occur by altering the amino acid sequence of the enzyme. Such changes can be targeted and thus local or random, for example, by random mutagenesis done.
  • An enzyme variant is understood as meaning enzymes which have been generated from an initial enzyme, for example a wild-type enzyme, by altering the amino acid sequence.
  • the alteration of the amino acid sequence is preferably carried out by mutations, wherein amino acid substitutions, deletions, insertions or combinations thereof may be made.
  • the incorporation of such mutations into proteins is well known in the art and to those skilled in the art of enzyme technology. In principle, all enzymes can be changed in this way.
  • Protease variants are preferred according to the invention. These were generated from an initial protease, for example a wild-type protease, by altering the amino acid sequence, preferably amino acid substitutions, deletions, insertions or combinations thereof.
  • the starting protease does not necessarily have to be a naturally occurring wild-type protease; a protease known from the prior art in which changes have already been made can also be further developed and therefore again serve as an initial protease for generating further protease variants.
  • all of the proteases described above may be used unchanged in agents according to the invention and be stabilized by the compounds described.
  • they can also be the starting enzyme for a variant which is then contained in an agent according to the invention and stabilized by the compounds described.
  • the detergent is therefore characterized in that the protease has been obtained from an initial protease by at least one change of an amino acid, the change being a substitution, insertion or deletion of an amino acid, and at least to the starting protease at the amino acid level 90%, preferably at least 92.5%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 97.5% is identical.
  • sequence comparisons are known to the person skilled in the art of enzyme technology.
  • sequence comparisons for example, the identity or homology values are determined for sequences to be compared.
  • Such a comparison is accomplished by associating similar sequences in the nucleotide or amino acid sequences of the proteins of interest. This is called homologization.
  • a tabular assignment of the respective positions is referred to as alignment.
  • alignments are created using computer programs, such as the algorithms FASTA or BLAST; This procedure is for example by DJ Lipman and WR Pearson (1985) in Science, Vol. 227, pp. 1435-1441 described.
  • a summary of all matching positions in the compared sequences is called a consensus sequence.
  • Such a comparison also allows a statement about the similarity or homology of the compared sequences to each other. This is represented in percent identity, that is the proportion of identical nucleotides or amino acid residues at the same or in an alignment corresponding positions. A broader concept of homology includes the conserved amino acid substitutions in this value. It then speaks of percent similarity. Such statements can be made about whole proteins or genes or only over individual areas.
  • homologous regions of different proteins are defined by matches in amino acid sequence. These can also be identified by identical function. It goes as far as complete identities in the smallest areas, so-called boxes, which contain only a few amino acids and usually perform essential functions for the overall activity.
  • the functions of the homologous regions are to be understood as the smallest partial functions of the function carried out by the entire protein, such as, for example, the formation of individual hydrogen bonds for the complexation of a substrate or transition complex.
  • sequence comparisons or alignments also serve to determine mutually corresponding positions in different molecules.
  • positions in the respective amino acid or nucleic acid sequence correspond to one another, even if the respective sequences have, for example, different total lengths or different domains or partial sequences or if additional amino acids or nucleotides are present within a sequence are.
  • a specific position in a first sequence can therefore be concretely assigned to a corresponding position in a second sequence, whereby it is quite possible for the positions corresponding to one another to be located at different locations in the molecule.
  • different amino acid residues may be present at the corresponding positions. Therefore, for such sequence comparisons or for determining a Specifically stated position, which position it is and which enzyme is assumed, that is, which counting method of determining position is to be based.
  • the amino acid sequence of the mature protein of the alkaline protease from Bacillus lentus DSM 5483 is used for determining the position, which is described in International Published Patent Application WO 91/02792 A1 and has a length of 269 amino acid residues (referred to in the present application as Bacillus lentus alkaline protease).
  • the detergent is characterized in that the protease was obtained from an initial protease by at least one change of an amino acid, the change being a substitution or insertion of an amino acid in that region of the amino acid sequence corresponding to positions 95 to 103 of the amino acid sequence Assigned alkaline protease from Bacillus lentus in an alignment.
  • Such a protease variant is particularly preferably a variant with an insertion of a single amino acid according to one or more of the positions 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 and / or 103 and very particularly preferably between positions 97 and 98 and / or positions 99 and 100.
  • the detergent is characterized in that the protease has been obtained from an initial protease by at least one modification of an amino acid corresponding to the positions 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 and 268 of the Bacillus lentus alkaline protease are associated in an alignment, wherein the alteration is a substitution, insertion or deletion of an amino acid.
  • an amino acid change relative to the parent molecule occurs in one or more of the following positions: 3, 4, 43, 61, 188, 193, 199, 211, 224, 250 and 253 (count according to Bacillus lentus alkaline protease), more preferably with one or more of the amino acid substitutions X3T, X4I, X43V, X61A, X188P, X193M, X199I, X211L, X211D, X211E, X211G, X211N or X211Q, X224V, X250G and / or X253N.
  • the protease is a variant with a point mutation at position 211, preferably with a substitution of a single amino acid in this position, more preferably with the amino acid substitution X211 L.
  • the above positional information relates in turn to those amino acid residues which are assigned to said positions of the alkaline protease from Bacillus lentus in an alignment.
  • Agents according to the invention may contain, in addition to the protease, one or more further enzymes, in particular from the following group: one or more further proteases, amylases, hemicellulases, cellulases, lipases and oxidoreductases.
  • the amylase is preferably an ⁇ -amylase.
  • the hemicellulase is preferably a ⁇ -glucanase, a pectinase, a pullulanase and / or a mannanase.
  • the cellulase is preferably a cellulase mixture or a one-component cellulase, preferably or predominantly an endoglucanase and / or a cellobiohydrolase.
  • the oxidoreductase is preferably an oxidase, in particular a choline oxidase, or a perhydrolase.
  • Agents according to the invention preferably comprise at least one complexing agent and / or builder substances, the builder being in particular a zeolite builder, and / or a nonionic surfactant, the nonionic surfactant preferably being a hydroxy mixed ether, and / or optical Brightener, wherein the optical brightener is diphenyl compounds, in particular distyryl biphenyl derivatives, and / or stilbentriazine derivatives.
  • V1 is the strongest and thus most suitable protease inhibitor or stabilizer, followed by V2, V3, V4 (practically as good as V3) and V5.
  • these compounds are also suitable for stabilizing the enzymatic activities in protease-containing detergents and cleaning agents during storage.
  • a liquid detergent was prepared with the following composition (all figures in percent by weight): 0.3-0.5% xanthan gum, 0.2-0.4% anti-foaming agent, 6-7% glycerol, 0.3 -0.5% ethanol, 4-7% FAEOS, 24-28% nonionic surfactants, 1% boric acid, 1-2% sodium citrate (dihydrate), 2-4% soda, 14-16% coconut fatty acids, 0.5 % HEDP, 0-0.4% PVP, 0-0.05% optical brightener, 0-0.001% dye, balance: demineralized water.
  • the initial values for the proteolytic activity of the agent in question were compared with the values determined after storage. The higher the activity remaining after storage, the better the protease contained was inactivated during storage and the better the compound in question is suitable as a stabilizer according to the invention.

Landscapes

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Waschmittel, enthaltend Carboxylgruppen tragende Benzophenon- oder Benzoesäureanilid-Derivate, die als Proteaseinhibitoren wirken und somit geeignete Enzymstabilisatoren sind.
  • Der Einsatz von Enzymen in Waschmitteln ist im Stand der Technik etabliert. Sie dienen dazu, das Leistungsspektrum der betreffenden Mittel entsprechend ihren speziellen Aktivitäten zu erweitern. Hierzu gehören insbesondere hydrolytische Enzyme wie Proteasen, Amylasen, Lipasen und Cellulasen. Die ersten drei genannten hydrolysieren Proteine, Stärke und Fette und tragen somit unmittelbar zur Schmutzentfemung bei. Cellulasen werden insbesondere wegen ihrer Gewebewirkung eingesetzt. Eine weitere Gruppe von Waschmittelenzymen sind oxidative Enzyme, insbesondere Oxidasen, die ggf. im Zusammenspiel mit anderen Komponenten vorzugsweise dazu dienen, Anschmutzungen zu bleichen oder die bleichenden Agentien in situ zu erzeugen. Neben diesen Enzymen, die einer fortwährenden Optimierung unterworfen werden, werden laufend weitere Enzyme für den Einsatz in Waschmitteln bereitgestellt, um insbesondere spezielle Anschmutzungen optimal angehen zu können, wie beispielsweise Pektinasen, β-Glucanasen, Mannanasen oder weitere Hemicellulasen zur Hydrolyse insbesondere spezieller pflanzlicher Polymere.
  • Die am längsten etablierten und in praktisch allen modernen, leistungsfähigen Waschmitteln enthaltenen Enzyme sind Proteasen und hierunter insbesondere Serin-Proteasen, zu denen auch die Subtilasen zählen. Sie bewirken den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Allerdings hydrolysieren sie auch sich selbst (Autoproteolyse) und alle anderen in den betreffenden Mitteln enthaltenen Proteine, d.h. insbesondere auch weitere Enzyme. Dies geschieht besonders während des Reinigungsvorgangs, d.h. in der wässrigen Waschflotte, wenn vergleichsweise günstige Reaktionsbedingungen vorliegen. Dies geschieht aber auch während der Lagerung der betreffenden Mittel, weshalb mit zunehmender Lagerdauer immer auch ein gewisser Verlust von Enzymaktivitäten, beispielsweise der Proteaseaktivität, einhergeht. In der Regel ist die Enzymaktivität in dem Waschmittel umgekehrt proportional zur Lagerdauer, mit fortschreitender Lagerdauer nimmt die Enzymaktivität immer weiter ab. Besonders problematisch ist dies in gelförmigen oder flüssigen und insbesondere in wasserhaltigen Rezepturen, weil in diesem mit dem enthaltenen Wasser sowohl das Reaktionsmedium als auch das Hydrolyse-Reagenz zur Verfügung stehen.
  • Ein Ziel bei der Entwicklung von Waschmitteln besteht somit darin, die enthaltenen Enzyme besonders während der Lagerung zu stabilisieren. Darunter wird der Schutz gegen verschiedene ungünstige Einflüsse verstanden, wie beispielsweise gegen Denaturierung oder Zerfall durch physikalische Einflüsse oder Oxidation. Ein Schwerpunkt dieser Entwicklungen besteht im Schutz der enthaltenen Proteine und/oder Enzyme gegen proteolytische Spaltung. Diese kann durch den Aufbau physikalischer Barrieren erfolgen, etwa durch Verkapselung der Enzyme in speziellen Enzymgranulaten oder durch Konfektionierung der Mittel in Zwei- oder Mehrkammersystemen. Ein anderer vielfach beschrittener Weg besteht darin, den Mitteln chemische Verbindungen zuzusetzen, die die Proteasen inhibieren und somit insgesamt als Stabilisatoren für die Proteasen und die anderen enthaltenen Proteine und Enzyme wirken. Es muss sich dabei um reversible Proteaseinhibitoren handeln, da die Proteaseaktivität nur vorübergehend, insbesondere während der Lagerung, nicht aber mehr während des Reinigungsprozesses unterbunden werden soll.
  • Als reversible Proteaseinhibitoren sind im Stand der Technik Polyole, insbesondere Glycerin und 1,2-Propylenglycol, Benzamidin-Hydrochlorid, Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester etabliert. Darunter sind vor allem Derivate mit aromatischen Gruppen, etwa ortho-, meta- oder para-substituierte Phenylboronsäuren zu erwähnen, insbesondere 4-Formylphenyl-Boronsäure (4-FPBA) beziehungsweise die Salze oder Ester der genannten Verbindungen. Ein besonders guter Schutz ergibt sich, wenn Borsäurederivate zusammen mit Polyolen eingesetzt werden, da sie dann einen das Enzym stabilisierenden Komplex bilden können. Auch Peptidaldehyde, das heißt Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, insbesondere solche aus 2 bis 50 Monomeren, sind zu diesem Zweck beschrieben. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren gehören unter anderem Ovomucoid und Leupeptin. Auch spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren sowie Fusionsproteine aus Proteasen und spezifischen Peptid-Inhibitoren werden hierfür eingesetzt.
  • Polyole wie Glycerin und 1,2-Propylenglycol haben sich jedoch aufgrund ihrer hohen notwendingen Einsatzkonzentrationen als unvorteilhaft erwiesen, weil die übrigen Wirkstoffe der betreffenden Mittel damit nur noch in entsprechend geringeren Anteilen enthalten sein können.
  • Unter den bereits in vergleichsweise niedriger Konzentration wirksamen Serin-Protease-Inhibitoren nehmen Borsäurederivate eine herausragende Stellung ein. Beispielsweise offenbart die internationale Patentanmeldung WO 96/21716 A1 dass als Proteaseinhibitoren wirkende Borsäurederivate auch geeignet sind, Enzyme in Waschmitteln zu stabilisieren. Eine Auswahl besonders leistungsfähiger Stabilisatoren sind offenbart in der internationalen Patentanmeldung WO 96/41859 A1 .
  • Unabhängig von ihrer stabilisierenden Wirkung weisen die Borsäurederivate jedoch einen entscheidenden Nachteil auf. Viele Borsäurederivate, wie beispielsweise Borat, bilden mit einigen anderen Waschmittelinhaltsstoffen unerwünschte Nebenprodukte, so dass diese in den betreffenden Mitteln nicht mehr für den erwünschten Reinigungsszweck zur Verfügung stehen oder sogar als Verunreinigung auf dem Waschgut zurückbleiben.
  • Es stellte sich somit die Aufgabe, borfreie chemische Verbindungen zu identifizieren, die als Proteaseinhibitoren wirken und somit als Enzymstabilisatoren in Waschmitteln geeignet sind.
  • Hierbei war der Einsatz in insgesamt flüssigen, gelförmigen oder pastösen Waschmitteln von besonderem Interesse, und darunter insbesondere in solchen, die Wasser enthalten.
  • Diese Aufgabe wird durch folgende Mittel gelöst:
    • Waschmittel, enthaltend eine Protease und eine Verbindung der allgemeinen Strukturformel:
      Figure imgb0001
       in der
      1. (a) X für eine Carbonylgruppe (C=O) oder eine Säureamidgruppe (NHCO) steht,
      2. (b) R1, R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt,
      3. (c) R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt, und
      4. (d) optional zwei der Reste R1 bis R10 (A) und (B), die zueinander orthoständig sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte obligatorische oder gegebenenfalls weitere Carboxylgruppe (COOH) und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind, die als solche Gruppen oder optional als Gruppierung -CH2-O-CO- vorliegen und somit zusammen mit den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges Lacton darstellen.
  • Unter einem Waschmittel sind erfindungsgemäß alle Mittel zu verstehen, die sich zum Waschen von insbesondere Textilien eignen. Hierfür geeignete Inhaltsstoffe werden weiter unten detailliert ausgeführt.
  • Unter einer Protease sind erfindungsgemäß alle Enzyme zu verstehen, die in der Lage sind, Säureamidverknüpfungen von Proteinen zu hydrolysieren. Auch die Proteasen werden weiter unten detailliert ausgeführt.
  • Bei der in der allgemeinen Strukturformel dargestellten Verbindung handelt es sich um eine aromatische Verbindung mit zwei Benzolringen, die gemäß Merkmal (a) über eine Keto- oder eine Säureamidgruppe verknüpft sind. Es handelt sich somit um ein Benzophenon- oder ein Benzoesäureanilid-Derivat.
  • Dieses Benzophenon-Derivat kann gemäß den Merkmalen (b) und (c) in beiden Ringen als Reste R1, R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1) bzw. R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen tragen. Voraussetzung ist, daß in jedem der beiden Ringe mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt.
  • Das gleiche gilt für ein derartiges Benzoesäureanilid-Derivat. Hierbei können die Ringe 1 und 2 unterschieden werden, wobei Ring 1 derjenige ist, der sich auf die Benzoesäure bzw. deren Substitutionsprodukt zurückführen läßt, und Ring 2 derjenige, der sich auf das Anilin bzw. dessen Substitutionsprodukt zurückführen läßt. Auch dieses Benzoesäureanilid-Derivat kann als R1, R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1) bzw. R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) Wasserstoff (H), eine Carboxyl-(COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl-(CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen tragen. Voraussetzung ist wiederum, daß in jedem der beiden Ringe mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt.
  • Erfindungsrelevant ist gemäß Merkmal (d) auch ein derartiges Benzophenon- oder Benzoesäureanilid-Derivat, welches in einem der beiden Ringe 1 oder 2 als mögliche Substituenten zwei der Reste R1 bis R10 (A) und (B) aufweist, die zueinander orthoständig sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte obligatorische oder gegebenenfalls weitere Carboxylgruppe (COOH) und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind, die als solche Gruppen oder optional als Gruppierung -CH2-O-CO- vorliegen und somit zusammen mit den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges Lacton darstellen.
  • Es ist also möglich, dass zwei der gemäß (b) und (c) möglichen Substituenten (A) und (B) eine Carboxylgruppe (COOH) bzw. eine Hydroxymethylgruppe sind, in einem Ring unmittelbar benachbart, d.h. zueinander orthoständig sind und in Form der Hydroxylgruppe und der Carboxymethylgruppe nebeneinander vorliegen. In diesem Fall kann es dazu kommen, dass diese beiden Gruppen miteinander ein Lacton ausbilden und In Lactonform an die zu inhibierende Protease binden. Es ist auch möglich, dass die Bindung ohne vorherige Ausbildung der Lactonform stattfindet. Es ist zur Verwirklichung der vorliegenden Erfindung auch möglich, bereits bei der Synthese die Lactonform vorzugeben und das bereits gebildete Lacton als Stabilisator dem betreffenden Mittel zuzugeben. Die am besten geeignete Form ist anhand der zu inhibierenden Protease und des ins Auge gefassten Stabilisators experimentell zu ermitteln, was dem Fachmann keine grundlegenden Schwierigkeiten bereitet.
  • Bei der Zählung der Carboxylgruppen gemäß den Merkmalen (b) und (c) und den bevorzugten Ausführungsformen, die auf die Anzahl der pro Molekül enthaltenen Carboxylgruppen bezug nehmen, wird diese Lacton-Carboxylgruppe als Carboxylgruppe gemäß Merkmal (b) bzw. (c) mitgezählt, kann aber auch zusätzlich neben einer weiteren, Carboxylgruppe vorliegen.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt die genannten Verbindungen in allen protonierten und/oder deprotonierten Formen. Insbesondere die Carboxylgruppe(n) (COOH) und ggf. die Aminogruppe(n) (NH2) liegen je nach pH-Wert des umgebenden Mediums als Carboxylat- (COO-) bzw. als Ammoniumgruppen (NH3 +) vor. Gegebenenfalls sind entgegengesetzt geladene Kationen (H+, Na+, K+ oder ähnliche) bzw. Anionen (Cl-, Br-, Formiat, Acetat etc.) anwesend. In all diesen Formen kann die vorliegende Erfindung verwirklicht werden. Entscheidend ist jeweils die Wechselwirkung zwischen der erfindungsrelevanten Verbindung und der erfindungsgemäß zu inhibierenden/- stabilisierenden Protease.
  • Ohne an diese Theorie gebunden sein wollen, wird erfindungsgemäß davon ausgegangen, daß die erfindungsrelevanten Verbindungen mit der erfindungsgemäß zu inhibierenden/stabilisierenden Protease einen Komplex ausbilden. Dieser sieht wahrscheinlich so aus, daß sich die erfindungsrelevante Verbindung in die Substratbindungstasche der Protease einlagert und dort nicht-kovalent gebunden wird. Auf diese Weise wird das aktive Zentrum der Protease durch eine nicht durch dieses Enzym hydrolysierbare Verbindung blockiert und steht nicht für eine Hydrolyse anderer zugegener Proteine zur Verfügung. Hierbei handelt es sich um eine reversible Bindung, d.h. um ein Gleichgewicht zwischen Assoziation und Dissoziation. Der Gleichgewichtskoeffizient dieser Reaktion wird als Inhibitionskonstante oder Ki bezeichnet.
  • Der erste Vorteil der erfindungsrelevanten Verbindungen gegenüber dem Stand der Technik besteht neben ihrem gegenüber den Polyolen geringeren Volumenbedarf darin, daß sie günstige Inhibitionskonstanten bezüglich der in Waschmitteln einsetzbaren Proteasen aufweisen. Dies gilt beispielsweise für Serin-Proteasen, aber auch für Metalloproteasen. Die Inhibitoren binden somit reversibel, d.h. sie gehen nicht zu feste und nicht zu lose vorübergehende Wechselwirkungen mit dem Enzym ein. Vorteilhafterweise liegt damit während der Lagerung der Großteil der erfindungsrelevanten Protease in Form eines Protease-Inhibitor-Komplexes vor. Die Protease und ggf. weitere enthaltene Proteine, insbesondere weitere Enzyme werden auf diese Weise gegenüber einer Proteolyse durch dieses Enzym geschützt (gegen Proteolyse stabilisiert). Andererseits wird im Augenblick der Verdünnung des erfindungsgemäßen Mittels mit Wasser zur Herstellung einer wäßrigen Wasch- bzw. Reinigungsflotte während des Reinigungsvorgangs das Bindungsgleichgewicht in Richtung Dissoziation verschoben, so daß sich der Komplex auflöst und der Großteil der erfindungsreievanten Protease proteolytisch aktiv wird. Es handelt sich bei den erfindungsrelevanten Verbindungen also gemäß der formulierten Aufgabe um funktionierende Protease-Inhibitoren und somit Enzym-Stabilisatoren für Waschmittel.
  • Der zweite Vorteil der erfindungsrelevanten Verbindungen gegenüber dem Stand der Technik besteht darin, daß sie als Elemente lediglich C, H, N und O und gegebenenfalls Halogenide und/oder Schwefel aufweisen und insbesondere frei von Bor sind. Sie bilden somit nicht die unerwünschten, auf Bor zurückzuführenden Nebenprodukte mit anderen Waschmittelinhaltsstoffen.
  • Ferner verfügen sie insbesondere aufgrund der in jedem aromatischen Ring enthaltenen Carboxylgruppen über eine gute Wasserlöslichkeit, so daß sie in entsprechende Mittel einfach eingearbeitet werden können und ein Ausfällen während der Lagerung vermieden wird.
  • Grundsätzlich wirken die genannten Verbindungen vermutlich deshalb als reversible Inhibitoren, weil sie dem Substrat der Proteasen, insbesondere hinsichtlich der zu hydrolysierenden Säureamidbindung, strukturell gleichen. Umgekehrt lassen sich also grundsätzlich alle Proteasen durch die efindungsrelevanten Verbindungen inhibieren, so diese erfindungsgemäß als Protease-Inhibitoren geeignet sind. Dies gilt insbesondere für Serin-Proteasen, wie anhand der Beispiele zur vorliegenden Anmeldung mit der positiven Wirkung der dort experimentell beschriebenen Verbindungen anhand von Serin-Proteasen, konkret Subtilasen, noch spezieller Subtilisinen gezeigt worden ist, und zwar anhand einer Variante des Subtilisins aus Bacillus lentus DSM 5483.
  • Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung betreffen:
    • die Verwendung einer oben beschriebenen Verbindung als reversibler Inhibitor und/oder Stabilisator einer Protease, im Rahmen einer Waschmittelrezeptur;
    • Waschverfahren, in dem eine Protease zur Wirkung kommt, die mit einer oben beschriebenen Verbindung inhibiert und/oder stabilisiert ist;
    • die Verwendung eines erfindungsgemäßen Waschmittels zum Waschen und/oder Reinigen von Textilien sowie
    • die Verwendung einer Protease und einer oben beschriebenen Verbindung zur Herstellung eines Waschmittels.
  • Besonders bevorzugt wird in allen erfindungsgemäßen Aspekten die stabilisierende Verbindung aus einem der folgenden Stabilisatoren ausgewählt:
    Strukturformel Name
    a)
    Figure imgb0002
         		2-(4-Carboxybenzoyl)-Benzoesäure
    b)
    Figure imgb0003
         		3,3'-Carbonylbis-Benzoesäure
    c)
    Figure imgb0004
         		2-(3-Carboxybenzoyl)-Benzoesäure
    d)
    Figure imgb0005
         		4,4'-Carbonylbis-Benzoesäure
    e)
    Figure imgb0006
         		2,2'-Carbonylbis-Benzoesäure
    f)
    Figure imgb0007
         		3-(4-Carboxybenzoyl)-Benzoesäure
    g)
    Figure imgb0008
         		2-[[(3-Carboxyphenyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure
    h)
    Figure imgb0009
         		2-[[(4-Carboxyphenyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure
    i)
    Figure imgb0010
         		2-[(2-Carboxybenzoyl)amino]-Benzoesäure
    j)
    Figure imgb0011
         		2-Amino-2',4-carbonylbis-Benzoesäure
    k)
    Figure imgb0012
         		3-[[(4-Carboxyphenyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure
    l)
    Figure imgb0013
         		4-[(4-Carboxybenzoyl)amino]-Benzoesäure
    m)
    Figure imgb0014
         		4-(2-Carboxybenzoyl)-1,2-Benzoldicarboxylsäure
    n)
    Figure imgb0015
         		2-(2-Carboxybenzoyl)-1,4-Benzold icarboxylsäu re
    o)
    Figure imgb0016
         		2-(4-Carboxybenzoyl)-1,4-Benzoldicarboxylsäure
    p)
    Figure imgb0017
         		4-(3-Carboxybenzoyl)-1,2-Benzoldicarboxylsäure
    r)
    Figure imgb0018
         		2-[[(1,3-Dihydro-3-oxo-5-isobenzofuranyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure
    s)
    Figure imgb0019
         		2-[[(1,3-Dihydro-1-oxo-5-isobenzofuranyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure
  • Erfindungsgemäß sind solche Waschmittel bevorzugt, in denen die stabilisierende Verbindung bezüglich der enthaltenen Protease eine Inhibitionskonstante (Ki) von 0,01 bis 10 mM, vorzugsweise 0,1 bis 5, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 aufweist.
  • Die Inhibitionskonstante Ki kann auf folgende Weise ermittelt werden:
    • Für die Charakterisierung eines reversiblen Inhibitors der enzymatischen Aktivität, ist die Inhibitionskonstante Ki eine charakteristische und entscheidende Größe. Ki beschreibt das Gleichgewicht zwischen Enzym, Inhibitor und Enzym-Inhibitor Komplex für eine reversible Bindung. Der Enzym-Inhibitor Komplex ist dabei katalytisch nicht aktiv und inhibiert die Reaktion durch Herabsetzung der Konzentration von freiem Enzym, das noch zur Bindung von Substrat zur Verfügung steht. Der Ki ist dementsprechend definiert als: K i = l x E / El
      Figure imgb0020
  • Darin bedeuten [E], [I] und [EI] die jeweiligen molaren Gleichgewichtskonzentrationen von Enzym (E), Inhibitor (I) und dem Enzym-Inhibitor-Komplex (EI). Dieser Definition entsprechend ist eine Substanz mit einem kleinen Ki unter den jeweiligen Testbedingungen ein guter Inhibitor.
  • Die Bestimmung des Ki erfolgt auf der Grundlage des Aktivitätstests der Protease in Anwesenheit des entsprechenden Inhibitors. Über die im Stand der Technik etablierte und dem Fachmann bekannte Michaelis-Menten-Kinetik (Leonor Michaelis, Maud Menten (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung, Biochem. Z. 49:333-369) werden die enzymatischen Parameter Km, und kcat in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen des Inhibitors bestimmt. Für eine Michaelis-Menten-Kinetik gilt vereinfacht:
    Figure imgb0021
  • Hierin bedeuten:
    • E: Enzym
    • S: Substrat
    • ES: Enzym-Substrat-Komplex
    • P: Produkt
    • k1,k-1,k2: Geschwindigkeitskonstanten
  • Hierin ist k2 ein Maß der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung (Vmax), auch Wechselzahl, molekulare Aktivität, "turnover number" oder kcat genannt (kcat = Vmax/ [Eo], wobei [Eo] die Ausgangskonzentration des Enzyms ist). Die Michaeliskonstante (d.h. die Substratkonzentration, die bei der Halbsättigung vorliegt, bei der die Umsatzgeschwindigkeit also v = Vmax/2 beträgt), ergibt sich zu
    Km = k-1 / k1 (Michaelis-Menten-Fall, gegeben wenn k2<<k1) oder bzw. allgemeiner zu
    Km = k-1 + k2 / k1 (Briggs-Haldane-Situation, gegeben für den Fall, dass k2 gegenüber k1 nicht vernachlässigt werden kann).
  • Die Sättigungsfunktion eines "Michaelis-Menten Enzyms" ergibt sich unter Verwendung der Parameter Km und Vmax wie folgt: v = v max ⋅ S K m + S
    Figure imgb0022
  • Hierin bedeutet: v: Bildungsgeschwindigkeit von P (v = "Geschwindigkeit") [mol l-1 s-1]
    • vmax: maximale Geschwindigkeit [mol l-1 s-1]
    • Km: Michaelis-Menten-Konstante [mol l-1]
    • [S]: Substratkonzentration [mol l-1]
  • Durch die Bestimmung der Anfangskatalyse-Rate (VAnf.) - für Proteasen der Anfangshydrolyse-Rate - bei verschiedenen Substratkonzentrationen [S] und Einpassung der experimentellen Daten in nachstehende Gleichung 1 wird die Inhibitionskonstante Ki erhalten. v Anf . = k cat x S x E 0 / K m x 1 + l / K i + S
    Figure imgb0023
  • Hierin steht [l] wiederum für die Inhibitor-Konzentration.
  • Alternativ kann Kl unter Verwendung der Cheng-Prusoff-Gleichung (Gleichung 2, Cheng Y., Prusoff W.H. (1973) Biochem.Pharmacol. 22, 3099-3108) über den IC50-Wert bestimmt werden. Die Bestimmung des IC50-Werts erfolgt über die Bestimmung der katalytischen Aktivität an einem Substrat in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen des Inhibitors und der Anpassung der experimentellen Daten an eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Gleichung mit variabler Steigung (Pseudo-Hill-Steigungen). Es handelt sich dabei um die Inhibitor-Konzentration, die nötig ist, um eine 50%ige Inhibition zu erreichen.
  • Ki ergibt sich damit aus folgender Gleichung 2: K i = IC 50 / 1 + S / K d
    Figure imgb0024
  • Darin bedeuten [S] die Substratkonzentration im Test und Kd die Dissoziationskonstante für das Substrat, die bei der IC50-Konzentration des Inhibitors als identisch mit Km für das Substrat gesetzt werden kann.
  • Die auf diese Weise bestimmbaren Kl-Werte kennzeichnen die Verbindung in Bezug auf das eingesetzte Enzym. In Beispiel 1 wurde die Restaktivität einer Protease, nämlich die Bacillus lentus-Alkalische Protease F49 (gemäß WO 95/23221 A1 ) in Gegenwart eines Inhibitors bestimmt. Da es sich dabei um eine typische Subtilisin-Protease handelt, sind die mit diesem Enzym erhaltenen Werte auch für andere Serin-Proteasen, insbesondere andere Subtilisin-Proteasen typisch. Der exakte Wert für eine interessierende Protease muß im Zweifel anhand der jeweils konkreten Protease ermittelt werden.
  • In erfindungsgemäßen Waschmitteln, die in einer bevorzugten Ausführung in überwiegend fester Form vorliegen und in einer zweiten Ausführung in überwiegend flüssiger, pastöser oder Gelform vorliegen, ist die Protease insbesondere in einem Gehalt von 2 µg bis 20 mg pro g des Mittels, vorzugsweise von 5 µg bis 17,5 mg pro g des Mittels, besonders bevorzugt von 20 µg bis 15 mg pro g des Mittels, ganz besonders bevorzugt von 50 µg bis 10 µg des Mittels enthalten.
  • Der Stabilisator ist in erfindungsgemäßen Mitteln insbesondere in einem Gehalt bis zu 50 mg pro g des Mittels, vorzugsweise bis zu 10 mg besonders bevorzugt bis zu 7 mg ganz besonders bevorzugt bis zu 5 mg pro g des Mittels enthalten. Weiterhin ist bevorzugt, dass der Stabilisator in einem Gehalt von 0,01 bis 100 x Ki (bezogen auf die enthaltene Protease), vorzugsweise 0,1 bis 10 x Kl besonders bevorzugt 1 bis 5 x Ki enthalten ist.
  • Vorzugsweise liegt das molare Verhältnis von Stabilisator zur Protease im Bereich von 1:1 bis 1.000:1, insbesondere von 1:1 bis 500:1, besonders bevorzugt von 1:1 bis 100:1, ganz besonders bevorzugt von 1:1 bis 20:1.
  • Neben dem Stabilisator gemäß der oben angegebenen allgemeinen Formel kann ein erfindungsgemäßes Mittel mindestens einen weiteren Stabilisator enthalten. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Waschmittel somit dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen weiteren Stabilisator enthält. In einem solchen Mittel sind daher mindestens zwei Verbindungen vorhanden, die eine Stabilisierung eines enthaltenen Enzyms, vorzugsweise einer Protease, bewirken. Bevorzugt wirken diese Verbindungen synergistisch, d.h. die durch beide Verbindungen erreichte Stabilisierungswirkung übersteigt die Summe der beiden einzelnen Stabilisierungswirkungen. In einer bevozugten Ausführungsform handelt es sich bei dem/den Stabilisator(en) um ein oder mehrere Polyole, insbesondere um Glycerin oder 1,2-Ethylenglycol, um ein Antioxidans, um Lactat oder ein oder mehrere Lactatderivate oder Kombinationen hiervon. Ebenfalls bevorzugt handelt es sich um eine oder mehrere derjenigen enzymstabilisierenden bzw. -inhibierenden Verbindungen, die in den internationalen Patentanmeldungen WO 07/113241 A1 oder WO 02/008398 offenbart sind.
  • Bei der erfindungsgemäß stabilisierten beziehungsweise reversibel inhibierten Protease handelt es sich vorzugsweise um eine Serin-Protease, insbesondere um eine Subtilase, besonders bevorzugt um ein Subtilisin.
  • Beispiele für solche Proteasen sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase® von der Firma Novozymes A/S, Bagsværd, Dänemark, erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase®, beziehungsweise Savinase® von der Firma Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP® geführten Protease-Varianten ab.
  • Weitere Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozymes® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP und Properase® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.
  • Überraschenderweise wurde festgestellt, dass solche Proteasen besonders gut durch die erläuterten Verbindungen stabilisiert bzw. reversibel inhibiert werden. Zudem werden auch bestimmte Varianten von Proteasen, d.h. auch Varianten der genannten Proteasen, durch diese Verbindungen besonders vorteilhaft stabilisiert. Solche Protease-Varianten sind Teil der nachfolgend beschriebenen Erfindungsgegenstände.
  • Eine erfindungsgemäß stabilisierte beziehungsweise reversibel inhibierte Protease kann ein Wildtypenzym oder eine Protease-Variante sein. Unter Wildtypenzym ist zu verstehen, dass das Enzym in einem natürlich vorkommenden Organismus bzw. in einem natürlichen Habitat vorhanden ist aus diesem isoliert werden kann. Enzyme sind jedoch veränderbar und werden zum Teil gezielt verändert, insbesondere um ihre Eigenschaften den vorgesehenen Einsatzzwecken anzupassen oder um ihre katalytische Aktivität zu beeinflussen. Diese Veränderungen erfolgen durch oftmals durch Änderung der Aminosäuresequenz des Enzyms. Solche Veränderungen können dabei gezielt und somit ortsgerichtet oder zufällig, beispielsweise durch Zufallsmutageneseverfahren, erfolgen. Unter einer Enzym-Variante werden Enzyme verstanden, die aus einem Ausgangsenzym, beispielsweise einem Wildtyp-Enzym, durch Veränderung der Aminosäuresequenz erzeugt wurden. Die Veränderung der Aminosäuresequenz erfolgt vorzugsweise durch Mutationen, wobei Aminosäure-Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Kombinationen hiervon vorgenommen sein können. Das Einbringen solcher Mutationen in Proteine ist Stand der Technik und dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie hinlänglich bekannt. Grundsätzlich können alle Enzyme derartig verändert sein. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Protease-Varianten. Diese wurden aus einer Ausgangsprotease, beispielsweise einer Wildtyp-Protease, durch Veränderung der Aminosäuresequenz erzeugt, wobei bevorzugt Aminosäure-Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Kombinationen hiervon vorgenommen wurden. Die Ausgangsprotease muss jedoch nicht zwingend eine natürlich vorkommende Wildtyp-Protease sein, auch eine aus dem Stand der Technik bekannte Protease, an der bereits Veränderungen vorgenommen wurden, kann weiterentwickelt werden und daher erneut als Ausgangsprotease zur Erzeugung weiter Protease-Varianten dienen. Somit können beispielsweise alle der vorstehend beschriebenen Proteasen unverändert in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt sein und durch die beschriebenen Verbindungen stabilisert sein. Sie können aber auch das Ausgangsenzym für eine Variante darstellen, welche dann in einem erfindungsgemäßen Mittel enthalten und durch die beschriebenen Verbindungen stabilisiert ist.
  • Unter allen beschriebenen Proteasen bzw. Varianten weiter bevorzugt ist das Wildtypenzym bzw. das Ausgangsenzym der Variante:
    • Die Alkalische Protease aus Bacillus amyloliquefaciens (BPN'),
    • Die Alkalische Protease aus Bacillus licheniformis (Subtilisin Carlsberg),
    • Die Alkalische Protease PB92,
    • Subtilisin 147 und/oder Subtilisin 309 (Savinase)
    • Die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, vorzugsweise aus Bacillus lentus DSM 5483,
    • Die Alkalische Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233),
    • die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14391) oder eine hierzu mindestens zu 70% identische Alkalische Protease,
    • die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) oder eine hierzu mindestens zu 98,5% identische Alkalische Protease,
    • die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392) oder eine hierzu mindestens zu 98,1% identische Alkalische Protease,
    • die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14393) oder eine hierzu mindestens zu 70% identische Alkalische Protease.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Waschmittel daher dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, wobei die Veränderung eine Substitution, Insertion oder Deletion einer Aminosäure ist, und sie zu der Ausgangsprotease auf Aminosäureebene zu mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 92,5%, besonders bevorzugt mindestens 95% und ganz besonders bevorzugt mindestens 97,5% identisch ist.
  • Verfahren zur Durchführung und Erstellung von Sequenzvergleichen, sogenannte Alignments, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt. Durch solche Sequenzvergleiche werden für zu vergleichende Sequenzen beispielsweise die Identitäts- oder Homologiewerte ermittelt. Solch ein Vergleich geschieht dadurch, dass ähnliche Abfolgen in den Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen der betrachteten Proteine einander zugeordnet werden. Dies nennt man Homologisierung. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Bei der Analyse von Nukleotidsequenzen sind wiederum beide komplementären Stränge und jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen; ebenso die Degeneriertheit des genetischen Codes und die organismenspezifische Verwendung der Codons (Codon-Usage). Inzwischen werden Alignments über Computerprogramme erstellt, wie beispielsweise durch die Algorithmen FASTA oder BLAST; dieses Vorgehen wird beispielsweise von D. J. Lipman und W. R. Pearson (1985) in Science, Band 227, S. 1435-1441 beschrieben.
  • Eine Zusammenstellung aller in den verglichenen Sequenzen übereinstimmenden Positionen wird als Konsensus-Sequenz bezeichnet.
  • Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit oder Homologie der verglichenen Sequenzen zueinander. Diese wird in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen wiedergegeben. Ein weiter gefasster Homologiebegriff bezieht die konservierten Aminosäure-Austausche in diesen Wert mit ein. Es ist dann von Prozent Ähnlichkeit die Rede. Solche Aussagen können über ganze Proteine oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden.
  • Homologe Bereiche von verschiedenen Proteinen sind durch Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz definiert. Diese können auch durch identische Funktion gekennzeichnet sein. Sie geht bis zu völligen Identitäten in kleinsten Bereichen, sogenannten Boxen, die nur wenige Aminosäuren umfassen und meist für die Gesamtaktivität essentielle Funktionen ausüben. Unter den Funktionen der homologen Bereiche sind kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes.
  • Insbesondere dienen solche Sequenzvergleiche bzw. Alignments auch zur Ermittlung von einander entsprechenden Positionen in unterschiedlichen Molekülen. So kann beispielsweise in einem Alignment von unterschiedlichen Enzymen festgestellt werden, welche Positionen in der jeweiligen Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz einander entsprechen, auch wenn die jeweiligen Sequenzen beispielsweise unterschiedliche Gesamtlängen oder unterschiedliche Domänen bzw. Teilsequenzen aufweisen oder wenn innerhalb einer Sequenz zusätzliche Aminosäuren bzw. Nukleotide vorhanden sind. Einer bestimmten Position in einer ersten Sequenz kann daher eine entsprechende Position in einer zweiten Sequenz konkret zugeordnet werden, wobei es durchaus möglich ist, dass sich die einander entsprechenden Positionen an unterschiedlichen Stellen im Molekül befinden. Ferner können an den entsprechenden Positionen unterschiedliche Aminosäurereste vorhanden sein. Daher wird für solche Sequenzvergleiche bzw. zur Bestimmung einer Position konkret angegeben, um welche Position es sich handelt und von welchem Enzym ausgegangen wird, d.h. welche Zählweise der Positionsbestimmung zu Grunde zu legen ist.
  • Für die nachfolgenden Erfindungsgegenstände wird zur Positionsbestimmung die Aminosäuresequenz des reifen (mature) Proteins der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 verwendet, die in der internationalen Offenlegungsschrift WO 91/02792 A1 offenbart ist und eine Länge von 269 Aminosäureresten aufweist (in der vorliegenden Anmeldung bezeichnet als Alkalischen Protease aus Bacillus lentus).
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Waschmittel dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, wobei die Veränderung eine Substitution oder Insertion einer Aminosäure in demjenigen Bereich der Aminosäuresequenz ist, der den Positionen 95 bis 103 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet ist.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich bei einer solchen Protease-Variante um eine Variante mit einer Insertion einer einzelnen Aminosäure nach einer oder mehrerer der Positionen 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 und/oder 103 und ganz besonders bevorzugt zwischen den Positionen 97 und 98 und/oder den Positionen 99 und 100.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Waschmittel dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 und 268 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet sind, wobei die Veränderung eine Substitution, Insertion oder Deletion einer Aminosäure ist.
  • Besonders bevorzugt erfolgt eine Aminosäureänderung gegenüber dem Ausgangsmotekül in einer oder mehreren der folgenden Positionen: 3, 4, 43, 61, 188, 193, 199, 211, 224, 250 und 253 (Zählung gemäß der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus), besonders bevorzugt mit einem oder mehreren der Aminosäureaustausche X3T, X4I, X43V, X61A, X188P, X193M, X199I, X211L, X211D, X211E, X211G, X211N oder X211Q, X224V, X250G und/oder X253N. Insbesondere handelt es sich bei der Protease um eine Variante mit einer Punktmutation in Position 211, vorzugsweise mit einer Substitution einer einzelnen Aminosäure in dieser Position, besonders bevorzugt mit der Aminosäuresubstitution X211 L. Die vorstehenden Positionsangaben beziehen sich wiederum auf diejenigen Aminosäurereste, die den genannten Positionen der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet sind.
  • Erfindungsgemäße Mittel können neben der Protease ein oder mehrere weitere Enzyme enthalten, insbesondere aus folgender Gruppe: eine oder mehrere weitere Proteasen, Amylasen, Hemicellulasen, Cellulasen, Lipasen und Oxidoreduktasen. Bei der Amylase handelt es sich vorzugsweise um eine α-Amylase. Bei der Hemicellulase handelt es sich vorzugsweise um eine β-Glucanase, eine Pektinase, eine Pullulanase und/oder eine Mannanase. Bei der Cellulase handelt es sich vorzugsweise um ein Cellulase-Gemisch oder eine Einkomponentencellulase, vorzugsweise bzw. überwiegend um eine Endoglucanase und/oder eine Cellobiohydrolase. Bei der Oxidoreduktase handelt es sich vorzugsweise um eine Oxidase, insbesondere eine Cholin-Oxidase, oder um eine Perhydrolase.
  • Erfindungsgemäße Mittel enthalten vorzugsweise mindestens einen Komplexbildner und/oder Buildersubstanzen, wobei es sich bei dem Builder insbesondere um einen Zeolith-Builder handelt, und/oder ein nichtionisches Tensid, wobei es sich bei dem nichtionischen Tensid vorzugsweise um einen Hydroxymischether handelt, und/oder optischen Aufheller, wobei es sich bei dem optischen Aufheller um Diphenylverbindungen, insbesondere um Distyryl-Biphenylderivate, und/oder um Stilbentriazin-Derivate handelt.
    • Beispiele Beispiel 1 Untersuchung der Protease-Restaktivität in Gegenwart eines Inhibitors
  • Zum Nachweis, dass die unten aufgeführten Verbindungen eine die Protease-Aktivität inhibierende Wirkung ausüben, wurde die proteolytische Restaktivität der Bacillus lentus-Alkalische Protease F49 (gemäß WO 95/23221 A1 ) in Anwesenheit dieser Verbindungen ermittelt.
  • In parallelen Reaktionsansätzen wurden in 100 mM Tris-Puffer, pH 6,8, 0,1% (w/v) BrijTM35 das Substrat Succinyl Alanin-Alanin-Prolin-Phenylalanin-para-Nitroanilid (AAPFpNA; Bachem L-1400) und 5 x 10-9 bzw. 1 x 10-8 M der Protease vorgelegt. Hinzu kamen die in Tabelle 1 aufgeführten zu testenden Verbindungen in einer Endkonzentration von 10 mM. Sie waren jeweils in wasserfreiem DMSO gelöst, wobei Effekte von DMSO auf die enzymatische Aktivität über die entsprechende Referenz mit derselben Menge DMSO, aber ohne die betreffende Verbindung korrigiert wurden. Die Inkubation erfolgte für 5 min bei pH 8,6 und 25°C. Dabei entspricht 1 U 1µmol gespaltenem Substrat pro Minute.
  • Auf diese Weise wurden folgende Verbindungen untersucht:
    • V1: 2-[[(3-carboxyphenyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure
    • V2: 2-[(2-carboxybenzoyl)amino]-Benzoesäure
    • V3: 2-[[(4-carboxyphenyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure
    • V4: 2-(4-carboxybenzoyl)-Benzoesäure
    • V5: 4-(2-carboxybenzoyl)-1,2-Benzoldicarboxylsäure
  • Sie führten alle zu einer Restaktivität der Protease von 50% oder weniger. Hierunter ist V1 der stärkste und damit am besten geeigente Protease-Inhibitor bzw. Stabilisator, gefolgt von V2, V3, V4 (praktisch genauso gut wie V3) und V5.
  • Aufgrund dieser Ergebnisse sind diese Verbindungen auch dazu geeignet, die enzymatischen Aktivitäten in Protease enthaltenden Wasch- und Reinigungsmitteln während der Lagerung zu stabilisieren.
    • Beispiel 2
  • Untersuchung der Lagerstabilität proteasehaltiger Wasch- und Reinigungsmittel in Gegenwart von Protease-Inhibitoren
  • Als Basisrezeptur wurde ein Flüssigwaschmittel mit folgender Zusammensetzung angesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3-0,5% Xanthan Gum, 0,2-0,4% Anti-Schaummittel, 6-7% Glycerin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS, 24-28% Nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1-2% Natriumcitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP, 0-0,4% PVP, 0-0,05% optischer Aufheller, 0-0,001% Farbstoff, Rest: demineralisiertes Wasser.
  • Diese Rezeptur wurde mit den zu testenden, inhibierenden Verbindungen und 1.275.000 HPE/I B. lentus-Alkalische Protease F 49 versetzt. Die in HPE angegebene Protease-Aktivität (Henkel-Protease-Einheiten) wurde nach van Raay, Saran und Verbeek, gemäß der Veröffenlichung "Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spül- und Reinigungsmitteln" in Tenside (1970), Band 7, S. 125- 132, bestimmt.
  • Die Lagerung erfolgte über verschieden lange Zeiträume in luftdicht verschlossenen Gefäßen bei 30°C.
  • Zur Auswertung wurden die Anfangswerte für die proteolytische Aktivität des betreffenden Mittels mit den nach der Lagerung bestimmten Werten verglichen. Je höher die nach der Lagerung verbleibende Aktivität war, desto besser war die enthaltene Protease während der Lagerung inaktiviert und desto besser eignet sich die betreffende Verbindung als erfindungsgemäßer Stabilisator.
  • Alle untersuchten Verbindungen zeigten eine eindeutig stabilisierende Wirkung.

Claims (15)

  1. Waschmittel, enthaltend eine Protease und eine Verbindung der allgemeinen Strukturformel:
    Figure imgb0025
     in der
    (a) X für eine Carbonylgruppe (C=O) oder eine Säureamidgruppe (NHCO) steht,
    (b) R1, R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt,
    (c) R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt, und
    (d) optional zwei der Reste R1 bis R10 (A) und (B), die zueinander orthoständig sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte obligatorische oder gegebenenfalls weitere Carboxylgruppe (COOH) und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind, die als solche Gruppen oder optional als Gruppierung -CH2-O-CO- vorliegen und somit zusammen mit den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges Lacton darstellen.
  2. Waschmittel nach Anspruch 1, wobei die stabilisierende Verbindung in jedem der beiden aromatischen Ringe 1 bis 3, vorzugsweise 1 oder 2, ganz besonders bevorzugt in beiden Ringen zusammen 2 oder 3 Carboxylgruppen trägt, wobei eine gemäß (d) in ein Lacton eingebundene Carboxylgruppe mitgerechnet wird.
  3. Waschmittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei die stabilisierende Verbindung bezüglich der enthaltenen Protease eine Inhibitionskonstante (Ki) von 0,01 bis 10 mM, vorzugsweise 0,1 bis 5, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 aufweist.
  4. Waschmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die stabilisierende Verbindung aus einem der folgenden Stabilisatoren ausgewählt ist: Strukturformel Name a)
    Figure imgb0026
         2-(4-Carboxybenzoyl)-Benzoesäure     b)
    Figure imgb0027
         3,3'-Carbonylbis-Benzoesäure     c)
    Figure imgb0028
         2-(3-Carboxybenzoyl)-Benzoesäure     d)
    Figure imgb0029
         4,4'-Carbonylbis-Benzoesäure     e)
    Figure imgb0030
         2,2'-Carbonylbis-Benzoesäure     f)
    Figure imgb0031
         3-(4-Carboxybenzoyl)-Benzoesäure     g)
    Figure imgb0032
         2-[[(3-Carboxyphenyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure     h)
    Figure imgb0033
         2-[[(4-Carboxyphenyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure     i)
    Figure imgb0034
         2-[(2-Carboxybenzoyl)amino]-Benzoesäure     j)
    Figure imgb0035
         2-Amino-2',4-carbonylbis-Benzoesäure     k)
    Figure imgb0036
         3-[[(4-Carboxyphenyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure     l)
    Figure imgb0037
         4-[(4-Carboxybenzoyl)amino]-Benzoesäure     m)
    Figure imgb0038
         4-(2-Carboxybenzoyl)-1,2-Benzoldicarboxylsäure     n)
    Figure imgb0039
         2-(2-Carboxybenzoyl)-1,4-Benzoldicarboxylsäure     o)
    Figure imgb0040
         2-(4-Carboxybenzoyl)-1,4-Benzoldicarboxylsäure     p)
    Figure imgb0041
         4-(3-Carboxybenzoyl)-1,2-Benzoldicarboxylsäure     r)
    Figure imgb0042
         2-[[(1,3-Dihydro-3-oxo-5-isobenzofuranyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure     s)
    Figure imgb0043
         2-[[(1,3-Dihydro-1-oxo-5-isobenzofuranyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure
  5. Waschmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in überwiegend fester Form.
  6. Waschmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in überwiegend flüssiger, pastöser oder Gelform.
  7. Waschmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Protease in einem Gehalt von 2 µg bis 20 mg pro g des Mittels, vorzugsweise von 5 µg bis 17,5 mg pro g des Mittels, besonders bevorzugt von 20 µg bis 15 mg pro g des Mittels, ganz besonders bevorzugt von 50 µg bis 10 µg des Mittels enthalten ist.
  8. Waschmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Stabilisator in einem Gehalt bis zu 50 mg pro g des Mittels, vorzugsweise bis zu 10 mg besonders bevorzugt bis zu 7 mg ganz besonders bevorzugt bis zu 5 mg pro g des Mittels enthalten ist.
  9. Waschmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das molare Verhältnis von Stabilisator zur Protease im Bereich von 1:1 bis 1.000:1, insbesondere von 1:1 bis 500:1, besonders bevorzugt von 1:1 bis 100:1, ganz besonders bevorzugt von 1:1 bis 20:1 liegt.
  10. Waschmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Stabilisator in einem Gehalt von 0,01 bis 100 x Ki (bezogen auf die enthaltene Protease), vorzugsweise 0,1 bis 10 x Ki besonders bevorzugt 1 bis 5 x Ki enthalten ist.
  11. Waschmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei der Protease um eine Serin-Protease, vorzugsweise um eine Subtilase, besonders bevorzugt um ein Subtilisin handelt.
  12. Waschmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass
    (a) die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, wobei die Veränderung eine Substitution, Insertion oder Deletion einer Aminosäure ist, und sie zu der Ausgangsprotease auf Aminosäureebene zu mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 92,5%, besonders bevorzugt mindestens 95% und ganz besonders bevorzugt mindestens 97,5% identisch ist, und/oder
    (b) die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, wobei die Veränderung eine Substitution oder Insertion einer Aminosäure in demjenigen Bereich der Aminosäuresequenz ist, der den Positionen 95 bis 103 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet ist, und/oder
    (c) die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 und 268 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet sind, wobei die Veränderung eine Substitution, Insertion oder Deletion einer Aminosäure ist.
  13. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Strukturformel:
    Figure imgb0044
     in der
    (a) X für eine Carbonylgruppe (C=O) oder eine Säureamidgruppe (NHCO) steht,
    (b) R1, R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt,
    (c) R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt, und
    (d) optional zwei der Reste R1 bis R10 (A) und (B), die zueinander orthoständig sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte obligatorische oder gegebenenfalls weitere Carboxylgruppe (COOH) und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind, die als solche Gruppen oder optional als Gruppierung -CH2-O-CO- vorliegen und somit zusammen mit den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges Lacton darstellen,
    als reversibler Inhibitor einer Protease im Rahmen einer Waschmittelrezeptur.
  14. Verwendung eines Waschmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zum Waschen und/oder Reinigen von Textilien.
  15. Verwendung einer Protease und einer Verbindung der allgemeinen Strukturformel:
    Figure imgb0045
     in der
    (a) X für eine Carbonylgruppe (C=O) oder eine Säureamidgruppe (NHCO) steht,
    (b) R1, R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt,
    (c) R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt, und
    (d) optional zwei der Reste R1 bis R10 (A) und (B), die zueinander orthoständig sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte obligatorische oder gegebenenfalls weitere Carboxylgruppe (COOH) und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind, die als solche Gruppen oder optional als Gruppierung -CH2-O-CO- vorliegen und somit zusammen mit den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges Lacton darstellen.
    zur Herstellung eines Waschmittels.
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