-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, vorzugsweise unter Verwendung eines Laser-Raster-Fluoreszenzmikroskops, wobei die zu untersuchende Probe eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Mittels eines Schaltsignals wird die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich in den ersten Zustand gebracht,
- b) mittels eines optischen Signals wird der zweite Zustand induziert, wobei innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden,
- c) mittels eines Testsignals werden die verbliebenen ersten Zustände ausgelesen, und
- d) die Schritte a) bis c) werden wiederholt, wobei das optische Signal zur Rasterung der Probe bei jeder Wiederholung verschoben wird.
-
Verfahren der eingangs genannten Art sind aus der Praxis bekannt. Grundsätzlich ist gemäß dem Abbe'schen Gesetz der räumlichen Auflösung abbildender optischer Verfahren durch die Beugungsgrenze eine theoretische Grenze gesetzt, wobei die Beugungsgrenze von der Wellenlänge des verwendeten Lichts abhängt. Mit den hier in Rede stehenden Verfahren lassen sich allerdings räumliche Auflösungen erzielen, die über die nach Abbe bekannte theoretische Beugungsgrenze hinaus verbessert sind.
-
Bei den bekannten Verfahren werden hierzu in zu untersuchenden Proben Substanzen bereitgestellt, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar sind, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen Eigenschaft voneinander unterscheiden. Bei den meisten bekannten Verfahren handelt es sich bei dem ersten Zustand um einen fluoreszenzfähigen Zustand (im Folgenden Zustand A genannt) und bei dem zweiten Zustand um einen nicht fluoreszenzfähigen Zustand (im Folgenden Zustand B). Nachdem die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich mittels eines Schaltsignals in den fluoreszenzfähigen Zustand A gebracht worden ist, wird mittels eines optischen Signals in räumlich begrenzten Teilbereichen des zu erfassenden Probenbereichs Zustand B induziert und somit eine Unterdrückung der Fluoreszenz von Fluoreszenzmolekülen erzeugt. Der physikalische Prozess der Fluoreszenzunterdrückung kann dabei sehr unterschiedlicher Natur sein. So ist bspw. die stimulierte Emission aus dem zuvor angeregten Zustand oder eine optisch induzierte Strukturänderung der Fluoreszenzmoleküle bekannt.
-
Entscheidend ist, dass der durch ein optisches Signal induzierte Übergang von dem ersten in den zweiten Zustand im Probenvolumen in großen Bereichen gesättigt, d.h. vollständig, stattfindet, und in mindestens einem Teilbereich des Probenvolumens gerade nicht stattfindet, indem dort das optische Schaltsignal gezielt nicht eingestrahlt wird. Dieser Effekt kann durch das Erzeugen einer Intensitätsnullstelle des optischen Signals erreicht werden. An der Nullstelle und in deren unmittelbarer Umgebung findet kein Übergang in den zweiten Zustand (im Allgemeinen der nicht fluoreszierende Zustand B) statt, so dass der erste Zustand (im Allgemeinen der fluoreszierende Zustand A) erhalten bleibt. Eine Sättigung des Übergangs A -> B durch das optische Signal führt in den beleuchteten Bereichen des zu erfassenden Probenbereichs bereits in naher Umgebung der Intensitäts-Nullstellen zu einem (nahezu) vollständigen Transfer in den Zustand B. Je stärker der Prozess in die Sättigung getrieben wird, d.h. je mehr Energie durch das optische Signal in die Bereiche um die Nullstelle herum eingebracht wird, desto kleiner wird der Bereich mit Fluoreszenzmolekülen im fluoreszenzfähigen Zustand A bzw. allgemein in einem „leuchtfähigen“ Zustand. In Abhängigkeit vom Sättigungsgrad in der unmittelbaren Nullstellen-Umgebung kann dieser Bereich prinzipiell beliebig klein gemacht werden. Folglich lassen sich Regionen des Zustands A markieren, die beliebig viel kleiner sind als die kleinsten aufgrund der Beugungsgrenze möglichen Regionen eines aufgebrachten optischen Signals. Wird der Bereich des Zustands A anschließend ausgelesen, z.B. durch Einstrahlen eines Testsignals, so stammt das (Fluoreszenz-)Messsignal aus einem definierten Bereich, der kleiner sein kann als es die Beugungsgrenze zulässt. Wird die Probe auf die beschriebene Art Punkt für Punkt abgerastert, so entsteht ein Bild mit einer Auflösung die besser ist, als es die Beugungstheorie erlaubt.
-
Verfahren, der hier beschriebenen Art, bei denen als Unterschied zwischen zwei Zuständen die optische Eigenschaft fluoreszenzfähig/nicht fluoreszenzfähig ausgenutzt wird, sind bspw. aus der
DE 103 25 459 A1 , der
DE 103 25 460 A1 und der
US 2006/0038993 A1 bekannt. Bei diesen Verfahren werden Fluoreszenzmoleküle mit Hilfe eines optischen Signals von einem Zustand
A (fluoreszenzfähig) in einen Zustand B (nicht fluoreszenzfähig) gebracht, wobei bei dem Übergang A -> B die Sättigung erreicht wird. Die in dem fluoreszenzfähigen Zustand A verbleibenden Bereiche der Probe resultieren jeweils aus einem eine Nullstelle aufweisenden Intensitätsminimum des eingestrahlten optischen Signals. Die Intensitätsminima sind Teil eines Interferenzmusters. Das Abrastern der Probe erfolgt durch Verschiebung der Intensitätsminima des optischen Signals, wobei die Verschiebung durch Phasenverschiebung der interferierenden Strahlen bewirkt wird.
-
Bei den bekannten Verfahren ist nachteilig, dass ein Übersprechen, bspw. zwischen dem Testsignal und dem optischen Signal oder zwischen dem Testsignal und dem Schaltsignal, eine signifikante Reduktion der Auflösung zur Folge haben kann. So kann durch ein Übersprechen insbesondere eine Intensitätsreduktion des Fluoreszenzmesssignals bewirkt werden, oder es kann zu einer Signaldetektion kommen, die keinem tatsächlichen Messsignal entspricht. Darüber hinaus ist bei den bekannten Verfahren die Einstrahlzeit für die einzelnen Signale während eines Zyklus limitiert, falls mit dem optischen Schaltsignal oder dem Testsignal ein spontaner Übergang konkurriert.
-
Aus den Veröffentlichungen
EP 1 584 918 A2 ,
US 2002/0141052 A1 und
US 2002/0167724 A1 sind jeweils hochauflösende Mikroskopieverfahren bzw. entsprechende Mikroskopsysteme bekannt.
-
Der vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art anzugeben, wonach mit einfachen und kostengünstigen Mitteln die negativen Folgen von Übersprechern weitestgehend vermieden sind und wonach eine dauerhaft hohe Auflösung erreicht ist.
-
Erfindungsgemäß ist die voranstehende Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
-
In erfindungsgemäßer Weise ist zunächst erkannt worden, dass sich das Auftreten von Übersprechern äußerst nachteilig auf die maximal zu erreichende Auflösung auswirken kann. In einem nächsten Schritt ist erkannt worden, dass die Übersprecher aufgrund einer gegenseitigen Beeinflussung der zyklisch eingestrahlten Signale zur Folge haben können, dass die Zustände der Substanz innerhalb der Probe zur Erzielung einer maximalen Auflösung nicht optimal eingestellt sind. Schließlich ist erfindungsgemäß erkannt worden, dass die beschriebenen Probleme in einfacher Weise dadurch vermieden werden können, dass die einzelnen Schritte a) bis d) anstelle einer starren zyklischen Abfolge in einer an die jeweilige Messsituation angepassten Reihenfolge durchgeführt werden.
-
Innerhalb des Gesamtzyklus, der die Schritte a) bis d) umfasst, wird ein Teilzyklus wiederholt ausgeführt, wobei der Teilzyklus lediglich eine Teilmenge der Schritte a) bis d) umfasst. So kann bspw. ein Teilzyklus umfassend die Schritte b) und c) wiederholt ausgeführt werden. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn das Testsignal nicht nur zur Aussendung eines Messsignals, sondern auch zu einem Umschalten von zweiten Zuständen in erste Zustände führt. Durch eine wiederholte Ausführung der Schritte b) und c) kann dann sichergestellt werden, dass sich die Probe in einem ausreichenden Maß im zweiten Zustand befindet. Die Schrittabfolge findet demnach wie folgt statt: a), b), c), b), c), b), c), ... d).
-
In einer anderen Messsituation wird bevorzugt ein Teilzyklus umfassend die Schritte a), b) und c) wiederholt ausgeführt. Eine derartige Wiederholung erweist sich als vorteilhaft, wenn das Testsignal nicht nur zur Aussendung eines Messsignals, sondern auch zu einem Umschalten von ersten Zuständen in zweite Zustände führt. Durch die wiederholte Ausführung eines Teilzyklus mit den Schritten a), b), c) kann dann sichergestellt werden, dass sich die Probe ausreichend im ersten Zustand befindet. Die zu durchlaufende Schrittabfolge lautet dementsprechend wie folgt: a), b), c), a), b), c), a), b), c), ... d).
-
In weiter vorteilhafter Weise kann eine Anpassung derart erfolgen, dass eine Detektion von Messsignalen, die aus dem Auslesen von ersten Zuständen resultieren, jeweils nur während oder kurz nach Aussendung eines Testsignals durchgeführt wird. Hierdurch kann berücksichtigt werden, dass auch das Schaltsignal und/oder das optische Signal zur Aussendung eines Messsignals führen können. Eine Detektion des Messsignals, das durch das Schaltsignal und/oder das optische Signal ausgelöst wurde, ist jedoch unerwünscht, da es nicht aus den räumlich eng begrenzten Bereichen stammt, die nach Einstrahlen des optischen Signals im ersten Zustand verblieben sind. Ein solches Messsignal weist demzufolge nicht die gewünschte räumlich hochaufgelöste Information auf. Durch eine Detektion von Messsignalen ausschließlich während/oder kurz nach Aussenden des Testsignals kann eine Detektion der genannten unerwünschten Messsignale wirksam unterdrückt werden.
-
Alternativ oder zusätzlich kann ein zum Nachweis der Messsignale eingesetzter Detektor mit der jeweiligen Abfolge der Schritte synchronisiert werden. Ebenfalls alternativ oder zusätzlich kann vor dem Detektor ein Verschluss angeordnet werden, wobei der Verschluss mit der jeweiligen Abfolge der Schritte synchronisiert werden könnte. Der Verschluss kann dabei bspw. als mechanischer oder elektronischer Shutter ausgeführt sein. Ebenso ist der Einsatz von akusto-optischen Shuttern denkbar.
-
Der Detektor kann als Kamera ausgeführt sein, wobei es sich insbesondere um eine CCD- oder eine EMCCD-Kamera handeln kann. Der Detektor kann auch ein Photomultiplier oder eine APD (Avalanche-Photodiode) sein. Eine Ausführung des Detektors als Detektor-Array, insbesondere in Form eines APD-Arrays, ist ebenfalls möglich.
-
Zur Erzielung einer möglichst hohen Auflösung kann es in bestimmten Messsituationen sinnvoll sein, die Schritte a), d.h. das Einstrahlen des Schaltsignals, und b), d.h. das Einstrahlen des optischen Signals, gleichzeitig oder zumindest teilweise zeitlich überlappend auszuführen. Für eine hohe Auflösung ist es nämlich wichtig, dass durch Einstrahlung des optischen Signals möglichst kleine Bereiche innerhalb der Probe entstehen, in denen die Substanz in dem ersten Zustand verbleibt. Dies soll möglichst vollständig geschehen, d.h. innerhalb der Bereiche soll die Substanz möglichst vollständig im ersten Zustand verbleiben. Wenn das optische Signal keine perfekten Intensitätsnullstellen besitzt, sondern lediglich mehr oder weniger stark ausgeprägte Intensitätsminima aufweist, dann führt die Einwirkung des optischen Signals auch in den Bereichen der Intensitätsminima zu einem - ungewollten - Umschalten der ersten Zustände in den zweiten Zustand. Bei einem gleichzeitigen Einwirken des optischen Signals und des Schaltsignals ist das Verhältnis Schaltsignal/optisches Signal an den Intensitätsminima des optischen Signals groß. Demzufolge verbleiben diese Bereiche auch im Fall relativ schlecht ausgebildeter Intensitätsminima des optischen Signals vorwiegend im ersten Zustand, wodurch die Auflösung verbessert wird.
-
Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform wird auch die jeweilige Abfolge der Schritte mit dem Pixeltakt und/oder den Vortrieben der Bildaufnahme synchronisiert. Mit anderen Worten kann sowohl die Abfolge der Schritte in der Reihenfolge a), b), c), d) bzw. eine Abfolge in einer modifizierten Reihenfolge als auch die Messsignaldetektion und/oder die gleichzeitige Einstrahlung des Schaltsignals und des optischen Signals mit dem Pixeltakt und/oder den Vortrieben der Bildaufnahme synchronisiert werden. Insbesondere kann eine Synchronisation mit den Vortrieben in den drei Raumrichtungen (x-, y-, z-Bildvortrieb) vorgenommen werden. Die Vortriebe der Bildaufnahme können dabei bspw. mittels eines Galvanometerscanners, eines akusto-optischen-Deflektors, eines mikro-elektromechanischen Systems (MEMS) oder mittels piezomechanischer Elemente realisiert werden. Die Synchronisation kann vorzugsweise mittels AOTFs (Acusto-Optical-Tunable-Filter), AOMs (Acusto-Optical-Modulator) und/oder elektronisch und/oder mittels mechanischer Shutter realisiert werden.
-
In weiter vorteilhafter Weise wird zwischen den einzelnen Schritten eine vorgebbare Verzögerung eingestellt. Diese kann fest, aber frei wählbar sein oder kann während des Messvorgangs dynamisch an die jeweilige Messsituation angepasst werden. Insbesondere ist es denkbar, dass die Verzögerungen zwischen einzelnen Schritten unterschiedlich lang eingestellt werden. Auch eine unterschiedlich lange Dauer der einzelnen Schritte selbst, d.h. die Einstrahldauern der jeweiligen Signale, können unterschiedlich sein. Vorzugsweise können sowohl die Verzögerungen als auch die einzelnen Schrittdauern, d.h. konkret die Signaleinstrahlzeiten bzw. Detektorauslesezeiten, vorzugsweise so gewählt werden, dass sie für alle Probenstellen gleich sind. Dies ist insbesondere im Hinblick auf eine einfache Bildauswertung vorteilhaft, da Umrechnungen und unterschiedliche Gewichtungen einzelner Bildbereiche entfallen.
-
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben zu verweisen. In Verbindung mit Erläuterungen des bevorzugten Ausführungsbeispiels anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt die einzige
- Fig. in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines Verfahrens zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben.
-
Die einzige Fig. zeigt schematisch die Schritte a) bis c) eines Verfahrens, wie es zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben jenseits der beugungslimitierten Auflösungsgrenze eingesetzt wird. Gemäß Teil a) der Fig. wird zunächst im gesamten zu erfassenden Probenraum P eine in der Probe 1 bereitgestellte Substanz, die wiederholt von einem ersten Zustand Z1 in einen zweiten Zustand Z2 überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände Z1, Z2 in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, mittels eines Schaltsignals 2 in den ersten Zustand Z1 gebracht. Im konkret dargestellten Ausführungsbeispiel handelt es bei dem ersten Zustand Z1 um einen fluoreszierenden Zustand A und bei dem zweiten Zustand Z2 um einen nicht fluoreszierenden Zustand B. Bei der in der Probe 1 bereitgestellten Substanz handelt es sich in dem konkret dargestellten Beispiel um eine photochrome Substanz, deren Moleküle durch Bestrahlung mit Licht einer ersten Wellenlänge, dem Schaltsignal 2, in den fluoreszenzfähigen Zustand A gebracht werden. Dies geschieht in idealer Weise, indem die Probe 1 im gesamten Probenraum P durch Beleuchtung durch ein Objektiv 3 mit dem Schaltsignal 2 bestrahlt wird (Schritt a)).
-
Im Falle der Grundzustands-Entvölkerung (Ground State Depletion, GSD) findet der Übergang in den fluoreszenzfähigen (Singlet)-Zustand üblicherweise spontan statt. Das Einstrahlen optischer Schaltsignale erübrigt sich somit in diesem Fall, es müssen lediglich Wartezeiten von typischerweise 1 bis 100 µs (teilweise auch ein wenig länger) berücksichtigt werden.
-
In einem nächsten Schritt - Schritt b), dargestellt in Teil b) der Fig. - wird Licht einer anderen Wellenlänge, das so genannte optische Signal 4, auf den zu erfassenden Probenbereich P aufgebracht. Dies geschieht in Form einer Lichtstruktur mit definierten Intensitäts-Nullstellen 5. Das optische Signal 4 induziert gesättigt den Übergang A -> B in allen mit Licht des optischen Signals 4 beleuchteten Bereichen 6. Mit anderen Worten verbleiben lediglich in unmittelbarer Umgebung der Intensitäts-Nullstellen 5 eng definierte Bereiche der Substanz im Zustand A. Die verbleibenden Bereiche A1 , A2 , A3 , ... der Substanz in Zustand A können viel kleiner sein als die Dimensionen der Lichtstruktur des optischen Signals 4 selbst, d.h. konkret viel kleiner als beugungslimitierte Strukturen. Die Größe der im Zustand A verbleibenden Bereiche A1 , A2 , A3 , ... der Substanz hängt ganz maßgeblich von der Qualität der Intensitätsminima 5 und damit vom erreichten Sättigungsgrad des Übergangs A→ B ab.
-
In Teil c) der Fig. ist schematisch der Auslesevorgang des Zustands A dargestellt. Dazu wird ein optisches Testsignal 7 so in den zu erfassenden Probebereich P eingestrahlt, dass diejenigen gemäß Teil b) der Fig. in Schritt b) präparierten Bereiche, in denen die Substanz in Zustand A verblieben ist, erfasst werden. Eventuell noch existierende Bereiche der Substanz im Zustand A, die außerhalb des zu erfassenden Probenbereichs P liegen, dürfen dabei nicht erfasst werden. Das von der Substanz im Zustand A ausgehende Fluoreszenzlicht wird als Messsignal 8 von einem Detektor (nicht gezeigt) erfasst, wobei eine eindeutige Zuordnung der detektierten Messsignale 8 zu den Einzelbereichen A1 , A2 , A3 , ... vorgenommen wird.
-
Die in der Fig. dargestellten Schritte a) bis c) werden wiederholt, wobei das optische Signal 4 zur Rasterung der Probe 1 bei jeder Wiederholung verschoben wird (Schritt d)). Erfindungsgemäß werden die einzelnen Schritte a) bis d) nicht in einem starren Zyklus mit fest vorgegebener Reihenfolge durchlaufen, sondern vielmehr in einer an die jeweilige Messsituation angepassten Reihenfolge durchgeführt.
-
Hinsichtlich weiter vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.