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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Mikroskopievorrichtung, insbesondere eine Mikroskopievorrichtung zur bildgebenden Erfassung von Fluoreszenzlicht.
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Im Bereich der Mikroskopie ist es bekannt, Fluoreszenzlicht bei der Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Abbildungen eines Untersuchungsobjekts, z.B. einer biologischen Probe, einzusetzen. Insbesondere kann dabei die Fluoreszenzintensität erfasst werden. Darüber hinaus ist es möglich, die individuelle Fluoreszenzlebensdauer von Fluorophoren zur Erzeugung von Kontrasten einzusetzen. Die letztgenannte Vorgehensweise wird mit FLIM bezeichnet (FLIM: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, Bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopie). Die Fluoreszenzlebensdauer eines Fluorophors, welcher gezielt in ein Untersuchungsobjekt eingebracht werden kann oder natürlicher Bestandteil des Untersuchungsobjekts ist, hängt stark ab von der molekularen Umgebung des Fluorophors und kann daher herangezogen werden, um die Umgebungsparameter eines Fluorophors im Rahmen eines bildgebenden Verfahrens darzustellen. Bei diesen Umgebungsparametern kann es sich beispielsweise um die Fluorophorkonzentration, den pH-Wert, die Temperatur oder die Viskosität handeln. Weiterhin kann die Erfassung von Fluoreszenzlicht eingesetzt werden bei der Analyse von Energietransferprozessen, z.B. über einen FRET-Mechanismus (FRET: Fluorescent Resonance Energy Transfer, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer), wodurch beispielsweise Aussagen über Bindungs- oder Faltungseigenschaften von Proteinen möglich sind.
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Für bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren sind grundsätzlich zwei verschiedene Verfahren bekannt. Ein erster Verfahrenstyp arbeitet in der Frequenzdomäne. Es wird in diesem Fall eine Anregungslichtquelle eingesetzt, welche mit einer Frequenz im Kilohertzbereich bis Gigahertzbereich zeitlich moduliert ist. Das von dem Untersuchungsobjekt in Reaktion auf das Anregungslicht abgegebene Fluoreszenzlicht wird phasensensitiv erfasst, so dass z.B. aus der Phasenverschiebung des erfassten Fluoreszenzlichts eine mittlere Fluoreszenzlebensdauer abgeleitet werden kann. Ein zweiter Verfahrenstyp arbeitet in der Zeitdomäne. In diesem Fall wird zur Erzeugung des Anregungslichts ein gepulster Laser mit Pulsdauern im Femtosekundenbereich bis Pikosekundenbereich eingesetzt, und es wird die Fluoreszenzabklingkurve an jedem Bildpunkt erfasst. Hierbei kann beispielsweise eine zeitkorrelierte Photonenzählung zum Einsatz kommen.
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Mikroskopievorrichtungen, welche geeignet sind für in der Frequenzdomäne arbeitende bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren, sind bekannt sowohl für Raster- bzw. Scanning-Mikroskopieverfahren, d.h. mit einem einkanaligen Detektor, als auch für Weitfeldmikroskopieverfahren, d.h. in Verbindung mit Kameras. Bei den Rasterverfahren besteht jedoch allgemein ein Problem dahingehend, dass sie relativ zeitaufwändig sind, wobei typische Bildaufnahmezeiten im Sekundenbereich liegen. Bei den Weitfeldverfahren kommen typischerweise zeitfenstergesteuerte Bildverstärker zu Einsatz, so genannte „Gated-Image Intensifiers“, bei welchen vor einer CCD-Kamera (CCD: Charge Coupled Device) eine Multikanalplatte (MCP, Multichannel Plate, Multikanalplatte), angeordnet ist, deren Spannung moduliert werden kann . Auf dies Weise können Zeitauflösungen im Bereich von 100 ps erreicht werden, was für viele Anwendungen ausreichend ist. Typischerweise sind mindestens drei Bildaufnahmen erforderlich, um die Phasenverschiebung zu ermitteln. Bei multiexponentiellen Abklingvorgängen erhöht sich die Anzahl von erforderlichen Bildaufnahmen weiter. Hierdurch ergeben sich Probleme hinsichtlich des Zeitaufwands für die Messungen. Weiterhin können Probleme hinsichtlich möglicher Bleichprozesse in den Fluorophoren auftreten. Auch besteht bei den bekannten Verfahren, welche in der Frequenzdomäne arbeiten, ein Problem dahingehend, dass eine effiziente Diskriminierung des Anregungslichts oder Autofluoreszenzlichts des Untersuchungsobjekts bezüglich der interessierenden Fluoreszenzstrahlung nicht möglich ist. Signalanteile von Anregungslicht oder Autofluoreszenzlicht in der erfassten Emissionsstrahlung führen typischerweise zu einer Verfälschung der ermittelten mittleren Fluoreszenzlebensdauer und sollten daher möglichst vermieden werden.
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Mikroskopievorrichtungen für bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren, die in der Zeitdomäne arbeiten, basieren beispielsweise auf der Kombination von konfokalen oder Mehrphotonen-Laser-Rastermikroskopen mit einer Einzelphotonenzählung und können in diesem Fall auch die Möglichkeit zur Erzeugung optischer Schnitte bieten. Dabei wird durch eine schnelle TDC-Elektronik (TDC: Time to Digital Converter, Zeit-Digital-Wandler) die Ankunftszeit einzelner Fluoreszenzphotonen relativ zu einem Puls des Anregungslichts gemessen. Hierbei kommen Lichtquellen mit Pulsdauern im Femtosekundenbereich bis Pikosekundenbereich zum Einsatz. Die erreichbaren Zeitauflösungen liegen im Bereich weniger Pikosekunden. Weiterhin sind Mikroskopievorrichtungen für bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren in der Zeitdomäne bekannt, welche eine Weitfelddetektion einsetzen und die Möglichkeit zur Erzeugung optischer Schnitte bieten. Eine solche Mikroskopievorrichtung ist beispielsweise beschrieben in „High speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits study of life cell signaling events“ D. M. Grant et al., Optics Express Vol. 15, No. 24, 15656 (2007). Die Untersuchungsobjekte werden hier sowohl fokal als auch außerfokal angeregt, obwohl nur die fokale Anregung tatsächlich genutzt wird, so dass ein Problem bezüglich übermäßiger Bleichung der Fluorophore besteht.
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Weiterhin ist im Zusammenhang mit Fluoreszenzmikroskopieverfahren die Verwendung der sogenannten SPIM-Technik (SPIM: Selective Plane Illumination Microscopy, Mikroskopie mit selektiver Beleuchtung einer Ebene) bekannt. Diese Technik ist beispielsweise beschrieben in „Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy“, H. K. Stelzer et al., Science VOL 305, 1007 (2004), in „Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM)“, H. K. Stelzer et al., Optics Letters Vol. 31, No. 10, 1477 (2006), in der
DE 10 257 423 A1 und in der
WO 2004/053558 A1 .
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Ähnlich wie die konfokale Laser-Rastermikroskopie erlaubt die SPIM-Technik die dreidimensionale Aufnahme von Objekten in Form optischer Schnitte, allerdings im Rahmen einer Weitfeldtechnik. Im Unterschied zu der Fluoreszenzmikroskopie im Auf- oder Durchlichtverfahren werden die Fluorophore hier im Untersuchungsobjekt mit Laserlicht in Form eines Lichtblattes angeregt. Der Einsatz der SPIM-Technik bei bildgebenden Fluoreszenzlebensdauermessungen ist beschrieben in „4D Fluorescence Lifetime Imaging using Selective Plane Illumination Microscopy“, K. Greger et al., Abstract Book, Focus on Microscopy (Jena, 2005), S. 225. In diesem Fall kommt als Lichtquelle ein CW-Laser (CW: Continuous Wave) in Form eines Arlonen-Lasers zum Einsatz, dessen Ausgangsstrahlung durch einen nachgeschalteten akusto-optischen Modulator moduliert wird.
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Die
US 2006/0061680 A1 beschreibt ein System und Verfahren zur Aufnahme von Bildsequenzen mit hohen Bildwiederholungsraten. Hierbei kann eine Beleuchtung mit einem durch mehrere Laser und Wellenlängenschieber erzeugten Lichtblatt erfolgen.
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Die
DE 10 2006 039 083 A1 beschreibt eine durchstimmbare Beleuchtungsquelle, welche eine spektral variable und räumlich kohärente Strahlung liefert. Die Beleuchtungsquelle kann beispielsweise im Rahmen einer FLIM-Technik oder einer SPIM-Technik genutzt werden.
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Die
DE 10 2004 039 035 A1 beschreibt ein Verfahren zur Fluoreszenzlebensdauer-Imaging-Nanoskopie (FLIN). Bei der genutzten FLIN-Anordnung kann für eine FLIM-Anwendung eine Nanoskopie-Einheit durch ein Standard-Fluoreszenzmikroskop ersetzt werden. Optional kann in einem Beleuchtungsstrahlengang der FLIN-Anordnung eine Scan-Einheit aus beweglichen Spiegeln vorgesehen sein.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine verbesserte Mikroskopievorrichtung bereitzustellen für bildgebende Untersuchungen an biologischen oder nicht biologischen Untersuchungsobjekten, insbesondere auf Basis von Fluoreszenzlicht, bei welcher durch Verwendung der SPIM-Technik mit geringer Bildaufnahmezeit und geringer Probenbelastung optische Schnitte erzeugt werden können.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Mikroskopievorrichtung gemäß Anspruch 1. Die abhängigen Patentansprüche definieren bevorzugte und vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung.
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Die erfindungsgemäße Mikroskopievorrichtung umfasst Beleuchtungsmittel zur Erzeugung einer Beleuchtungsstrahlung, einen bildgebenden Detektor zur ortsaufgelösten Erfassung einer von einem Untersuchungsobjekt abgegebenen Emissionsstrahlung, einen Beleuchtungsstrahlengang zwischen den Beleuchtungsmitteln und dem Untersuchungsobjekt und einen Detektionsstrahlengang zwischen dem Untersuchungsobjekt und dem Detektor. Der Beleuchtungsstrahlengang umfasst eine Beleuchtungsoptik, welche zur Erzeugung eines Lichtblattes der Beleuchtungsstrahlung ausgestaltet ist, welches sich quer zu der Achse des Beleuchtungsstrahlengangs erstreckt, wobei die Achse des Detektionsstrahlengangs in einem von 0° abweichenden Winkel, insbesondere im Wesentlichen senkrecht zu einer Schnittebene des Lichtblattes und des Untersuchungsobjekts ausgerichtet ist. Der Aufbau der Mikroskopievorrichtung entspricht somit im Wesentlichen der SPIM-Technik und ermöglicht somit die Aufnahme von optischen Schnitten des Untersuchungsobjekts mit einer hohen Geschwindigkeit und einem geringen Ausbleichen der Probe. Der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang sind vollständig voneinander getrennt.
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Die Beleuchtungsmittel umfassen erfindungsgemäß einen gepulsten Laser. Auf diese Weise kann die Beleuchtungsstrahlung über eine große Bandbreite von Wellenlängen bereitgestellt werden und es wird eine hohe Effizienz der Anregung beispielsweise von Fluoreszenz in dem Untersuchungsobjekt durch die Beleuchtungsstrahlung ermöglicht. In diesem Zusammenhang ist es besonders vorteilhaft, wenn mit der Beleuchtungsstrahlung eine Bandbreite von wenigstens 200 nm abgedeckt werden kann. Die von dem gepulsten Laser bereitgestellte Pulsdauer beträgt vorzugsweise weniger als 1 ns, insbesondere weniger als 100 ps. Insbesondere kann ein Laser verwendet werden, welcher über einen Wellenlängenbereich von 400 nm bis 750 nm Lichtpulse mit einer Länge von 10 bis 40 ps mit einer Wiederholrate im Bereich von 20 bis 50 MHz erzeugt. Auch der Einsatz eines Lasers mit Pulslängen im Femtosekundenbereich ist möglich.
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Erfindungsgemäß ist der Detektor zur zeitaufgelösten Erfassung von Photonen der Emissionsstrahlung ausgestaltet. Insbesondere kann der ortsaufgelöste Detektor als zeitfensterbasierter Bildverstärker (d.h. als so genannter „Time-Gated Image Intensifier“) oder als zeitaufgelöster Einzelphotonenzähler ausgestaltet sein. Geeignete orts- und zeitaufgelöste Einzelphotonenzähler sind beschrieben in „A space- and time-resolved single-photon counting detector for fluorescence microscopy and spectroscopy“, X. Michalet et al., Proc. of SPIE Vol. 6092, 60920M (2006) und in „Position- and time-sensitive single photone detector with delay-line readout“, A. Czasch et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A 580 (2007), 1066-1070.
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Durch Verwendung dieser zeitaufgelösten Detektoren ist die Mikroskopievorrichtung einsetzbar für bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren, insbesondere in der Zeitdomäne, wobei beispielsweise der Detektor als Ergebnis der Messung für jeden Bildpunkt eine Fluoreszenzabklingkurve liefern kann. Darüber hinaus wird durch die Zeitauflösung ermöglicht, zwischen verschiedenen Signalanteilen der von dem Untersuchungsobjekt abgegebenen Emissionsstrahlung zu diskriminieren, insbesondere zwischen Autofluoreszenzstrahlung von in dem Untersuchungsobjekt natürlich enthaltenen Materialien und Fluoreszenzstrahlung von gezielt in das Untersuchungsobjekt eingebrachten Fluoreszenzfarbstoffen, sowie zwischen Fluoreszenzstrahlung und reflektierter oder gestreuter Beleuchtungsstrahlung. Die auf diese Weise diskriminierten verschiedenen Signalanteile können zur Unterdrückung bestimmter Signalanteile, z.B. Autofluoreszenz, oder zur parallelen bildgebenden Auswertung der verschiedenen Signalanteile herangezogen werden. In jedem Fall wird eine äußerst effiziente Bildaufnahme und Auswertung gewährleistet.
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Zur Bereitstellung der Ortsauflösung umfasst der Detektor typischerweise eine Vielzahl von Detektorelementen, welche angeordnet sein können in Form eines regelmäßigen Gitters oder einer Matrix, oder aber auch in Form einer im Wesentlichen linienartigen Anordnung, um einen Zeilendetektor zu realisieren. Jedes der Detektorelemente ist dazu ausgestaltet, ein von einem Erfassungszeitpunkt wenigstens eines Photons relativ zu einem Puls der Beleuchtungsstrahlung abhängiges Zeitsignal auszugeben und/oder die Erfassung von Photonen abhängig von einem relativ zu dem Puls der Beleuchtungsstrahlung erzeugten Zeitsignal zu steuern. In jedem Fall ist somit über das Zeitsignal eine Zeitinformation verfügbar, welche im Wesentlichen der Zeitdifferenz zwischen einem Puls der Beleuchtungsstrahlung und dem Zeitpunkt des Erfassens eines Photons der Emissionsstrahlung entspricht. Durch Erfassen mehrerer Photonen kann somit beispielsweise die Abklingkurve der Fluoreszenzstrahlung eines Fluorophors in dem Untersuchungsobjekt erfasst werden.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
- 1 zeigt schematisch eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
- 2 zeigt schematisch eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung.
- 3 veranschaulicht eine Folge von Pulsen der Beleuchtungsstrahlung in einer Mikroskopievorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
- 4 zeigt eine beispielhafte Fluoreszenzabklingkurve, welche durch eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung erfassbar ist.
- 5 veranschaulicht die Verwendung eines Zeitfensters zur Diskriminierung von Signalanteilen einer Emissionsstrahlung in einer Mikroskopievorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
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1 zeigt schematisch eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die Mikroskopievorrichtung ist zur Verwendung bei bildgebenden Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren in der Zeitdomäne ausgestaltet, wobei die Erzeugung optischer Schnitte gemäß der SPIM-Technik vorgesehen ist.
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Die Mikroskopievorrichtung umfasst Beleuchtungsmittel, welche einen breitbandigen Laser 1, ein akusto-optisches einstellbares Filter 3 zur externen Wellenlängenselektion und eine breitbandige Lichtleitfaser 4. Beispielsweise kann der Laser 1 in einem Wellenlängenbereich von 450 bis 700 nm Pulse der Beleuchtungsstrahlung mit einer Länge von 20 ps erzeugen. Die Wiederholrate der Pulse liegt beispielsweise bei 40 MHz. Bei der Ausgangsstrahlung des Lasers 1 kann es sich um ein Weisslichtkontinuum handeln, aus dem dann die in der Beleuchtungsstrahlung verwendeten Wellenlängen extern herausgefiltert werden, z.B. durch das akusto-optische einstellbare Filter 3, oder der Laser 1 kann selbst ein geeignetes Mittel zur Wellenlängenselektion beinhalten, wie z.B. ein internes akusto-optisches einstellbares Filter oder eine Frequenzkonversionseinheit. Bei dem Laser 1 kann es sich um einen faserbasierten Superkontinuum-Laser handeln. In dem Fall, dass der Laser 1 selbst Mittel zur Wellenlängenselektion beinhaltet, kann gegebenenfalls auf das akusto-optische einstellbare Filter 3 verzichtet werden. Ein geeigneter Laser ist beispielsweise über die Firma Fianium Ltd. kommerziell verfügbar.
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Die Mikroskopievorrichtung umfasst weiterhin einen Beleuchtungsstrahlengang 2, in welchem die von dem Laser 1 erzeugte Beleuchtungsstrahlung über die optische Faser 4 eingekoppelt wird. In dem Beleuchtungsstrahlengang 2 sind eine Zylinderoptik 5 sowie Abbildungsoptiken 6 angeordnet, welche eine Formung der Beleuchtungsstrahlung zu einem Lichtblatt 7 bewerkstelligen. Das Lichtblatt 7 ist auf ein Untersuchungsobjekt 8 gerichtet und schneidet dieses in einer Fokusebene des Beleuchtungsstrahlengangs 2. Bei dem Untersuchungsobjekt kann es sich insbesondere um eine biologische Probe handeln, welche beispielsweise in ein transparentes Gel eingebettet ist.
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Die Mikroskopievorrichtung umfasst weiterhin einen Detektionsstrahlengang 10, in welchem ein Detektionsobjektiv 9 angeordnet ist, über welches von dem Untersuchungsobjekt 8 abgegebene Emissionsstrahlung aufgenommen wird. Die Achse des Detektionsstrahlengangs 10 steht im Wesentlichen senkrecht auf der Achse des Beleuchtungsstrahlengangs 2 und insbesondere im Wesentlichen senkrecht auf der Schnittebene des Lichtblatts 7 mit dem Untersuchungsobjekt 8. Das Untersuchungsobjekt 8 wird folglich nur in einer Ebene beleuchtet. Das Detektionsobjektiv 9 dient der Fokussierung in einer Fokusebene des Detektionsstrahlengangs 10. Der Beleuchtungsstrahlengang 2 und der Detektionsstrahlengang sind vollständig voneinander getrennt und treffen sich lediglich in der jeweiligen Fokusebene. Es sind auch Anordnungen denkbar mit einem Winkel zwischen Detektionsstrahlengang und Beleuchtungsstrahlengang der zwischen 0° und 90° liegt. Entscheidend ist, dass der Beleuchtungsstrahlengang 2 und der Detektionsstrahlengang nicht parallel ausgerichtet sind.
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Die Mikroskopievorrichtung umfasst weiterhin eine Vorrichtung (nicht dargestellt) zur Positionierung des Untersuchungsobjekts 8 relativ zu dem Lichtblatt 7, so dass durch eine Relativbewegung des Untersuchungsobjekts 8 entlang der Achse des Detektionsstrahlengangs 10 und/oder relativ zu dem Beleuchtungsstrahlengang 2 verschiedene optische Schnitte des Untersuchungsobjekts 8 aufgenommen werden können, welche als Grundlage für dreidimensionale Bilddatensätze dienen können. Die Relativbewegung kann auch eine Rotation des Untersuchungsobjekts 8 umfassen.
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Der Detektionsstrahlengang 10 umfasst weiterhin eine Tubuslinse 12, über welche die von dem Detektionsobjektiv 9 erfasste Emissionsstrahlung einem Detektor 14 zugeführt ist. Weiterhin kann in dem Detektionsstrahlengang 10 ein Farbteiler 11 vorgesehen sein, welcher beispielsweise die Anbindung von Auflichti Fluoreszenzanregungseinheiten, z.B. ein konfokales Laser-Rastermikroskop oder ein Epi-Fluoreszenzmikroskop, ermöglicht. Weiterhin kann in dem Detektionsstrahlengang 10 ein Emissionsfilter 13 vorgesehen sein, welches über das Untersuchungsobjekt 8 in den Detektionsstrahlengang 10 reflektierte oder gestreute Beleuchtungsstrahlung blockiert. Das Emissionsfilter 13 ist jedoch nicht für alle Betriebsweisen der ) Mikroskopievorrichtung erforderlich und ist daher bevorzugt herausnehmbar. Bei einigen Betriebsweisen kann die Erfassung von reflektierter oder gestreuter Beleuchtungsstrahlung über den Detektor 14 sogar wünschenswert sein.
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Bei der Mikroskopievorrichtung können alle in der von dem Laser 1 bereitgestellten Bandbreite der Beleuchtungsstrahlung verfügbaren Anregungslinien zur Fluoreszenzanregung oder für eine anderweitige Beleuchtung des Untersuchungsobjekts 8 verwendet werden. Hierdurch ist es insbesondere möglich, die vollständige Bandbreite an Fluoreszenzfarbstoffen abzudecken und sogar optimiert anzuregen, wenn beispielsweise die Wellenlänge des Absorptionsmaximums eines Fluoreszenzfarbstoffs für die Anregung ausgewählt wird. Weiterhin ist es möglich, das Untersuchungsobjekt 8 mit einem breiten spektralen Band der Beleuchtungsstrahlung anzuregen, um beispielsweise eine erhöhte Leistung für die Anregung zur Verfügung zu stellen. Es ist auch möglich, strukturierte spektrale Bänder der Beleuchtungsstrahlung zur Anregung einzusetzen. Letzteres kann bei einigen Fluoreszenzfarbstoffen von Vorteil sein, wenn z.B. gezielt Bleichkanäle unterdrückt werden sollen.
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Die Mikroskopievorrichtung umfasst weiterhin den Detektor 14 sowie eine Auswerte- und Steuerelektronik 15. Im Zusammenhang mit der Auswerte- und Steuerelektronik 15 ist der Detektor 14 in der Lage, das Auftreffen von Photonen der von dem Untersuchungsobjekt 8 ausgesendeten Emissionsstrahlung räumlich und zeitlich aufzulösen. Der Detektor 14 kann insbesondere einen zeitfensterbasierten Bildverstärker umfassen, wie er beispielsweise über die Firma Kentech Ltd. kommerziell verfügbar ist. Die Auswerte- und Steuerelektronik 15 ist über Signalleitungen 17 und 18 mit dem Detektor 14 verbunden. Darüber hinaus ist die Auswerte- und Steuereinheit 15 über eine Signalleitung 16 mit dem Laser 1 verbunden. Der Laser 1 übermittelt über die Signalleitung 16 ein Triggersignal an die Auswerte- und Steuerelektronik 15. Das Triggersignal umfasst Triggerpulse, welche im Wesentlichen zeitgleich zu den erzeugten Pulsen der Beleuchtungsstrahlung sind oder einen bekannten Zeitversatz zu diesen aufweisen. Die Auswerte- und Steuerelektronik 15 erzeugt basierend auf diesem Trigger-Signal Zeitfenstersteuerungssignale, welche über die Signalleitung 17 an den Detektor 14 übermittelt werden. Der Detektor 14 übermittelt wiederum über die Signalleitung 18 eine Information bezüglich der Erfassung eines Photons sowie eine Information, an welchem Ort dieses Photon erfasst wurde.
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Alternativ kann der Detektor 14 auch einen orts- und zeitaufgelösten Einzelphotonenzähler umfassen, wie er beispielsweise beschrieben ist in „A space- and time-resolved single-photon counting detector for fluorescence microscopy and spectroscopy“, X. Michalet et al., Proc. of SPIE Vol. 6092, 609220M (2006) oder in „Positionand time-sensitive single photon detector with delay-line readout“, A. Czasch et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A 580 (2007), 1066-1070. Der Detektor 14 umfasst somit beispielsweise eine Multialkali-Fotokathode, einen MCP-Stapel (MCP: Micro Channel Plate, Mikrokanalplatte) und eine gekreuzte Verzögerungsdraht-Anode. Photonen, die auf die Kathode treffen, werden über den MCP-Stapel in ihrer Wirkung verstärkt und erzeugen auf der Anode einen Signalimpuls, aus dessen Laufzeit zur Detektionselektronik Aussagen über den Photonenauftreffpunkt abgeleitet werden können. Anstelle der Verzögerungsdraht-Anode kann auch einen segmentierte Anode verwendet werden. In diesem Fall dient die Signalleitung 17 im Wesentlichen der Initialisierung des Detektors 14. Über die Signalleitung 18 werden bevorzugt die folgenden Informationen übermittelt: die Ankunftszeit eines Photons der Emissionsstrahlung relativ zum Initialisierungssignal, ein verzögertes Signal für eine erste Raumrichtung, z.B. eine x-Position, und ein verzögertes Signal für eine zweite Raumrichtung, z.B. eine y-Position. Aus diesen drei Informationen kann Ort und Zeitpunkt der Erfassung des Photons bestimmt werden. Da bei dem Detektor 14 im Wesentlichen ein Photonenzählverfahren zum Einsatz kommt, umfasst der Detektor 14 vorzugsweise auch einen Diskriminator zur Unterdrückung von elektronischen Rauschanteilen. Auf diese Weise kann Ausleserauschen vermieden werden.
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Durch Einsatz eines solchen ortsaufgelösten und zeitaufgelösten Einzelphotonenzählers besteht keine Beschränkung auf Zeitfenster bei der Erfassung der Photonen. So kann vermieden werden, dass Verluste für Photonen der Emissionsstrahlung auftreten, welche außerhalb der gesetzten Zeitfenster auf den Detektor 14 treffen. Durch Verwendung von ortsaufgelösten und zeitaufgelösten Einzelphotonenzählern als Detektoren können Ortsauflösungen von wenigstens 150 × 150 Bildpunkten, z.B. 1000 × 1000 Bildpunkte, und zeitliche Auflösungen von etwa 100 ps erreicht werden.
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Die Mikroskopievorrichtung umfasst darüber hinaus einen Analyserechner 20, welcher über eine Signalleitung 19 mit der Auswerte- und Steuerelektronik 15 verbunden ist. Über die Signalleitung 19 werden dem Analyserechner 20 von der Auswerte- und Steuerelektronik 15 ermittelte Messresultate zugeführt. Mittels des Analyserechners 20 können beispielsweise zeitliche Fluoreszenzabklingkurven optisch dargestellt und gespeichert werden oder mit der Mikroskopievorrichtung erfasste zweidimensionale oder dreidimensionale Bilddaten dargestellt, gespeichert und weiterverarbeitet werden. Es versteht sich, dass die Auswerte- und Steuerelektronik 15 und der Analyserechner 20 in einem einzigen mikroprozessorbasierten System implementiert sein können, welches auch gleichzeitig der Steuerung der wesentlichen Funktionen der Mikroskopievorrichtung dienen kann, z.B. über eine graphische Benutzeroberfläche.
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2 zeigt eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die Mikroskopievorrichtung von 2 entspricht im Wesentlichen derjenigen von 1, und ähnliche Komponenten wurden mit den gleichen Bezugszeichen gekennzeichnet. Auf die Erläuterung dieser Komponenten wird an dieser Stelle verzichtet. Vielmehr wird diesbezüglich auf die entsprechenden Ausführungen im Zusammenhang mit 1 verwiesen. Nachfolgend sollten lediglich die wesentlichen Unterschiede der Mikroskopievorrichtung von 2 zu derjenigen von 1 erläutert werden.
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Während bei der Mikroskopievorrichtung von 1 das Lichtblatt 7 durch eine Zylinderoptik geformt wurde, wird es bei der Mikroskopievorrichtung von 2 durch einen die Fokusebene abrasternden annähernd linienförmigen Lichtstrahl aufgespannt. Die Mikroskopievorrichtung umfasst zu diesem Zweck eine erste Rastereinheit 21, welche eine entsprechende Ablenkung des von dem Laser 1 über die optische Faser 4 in den Beleuchtungsstrahlengang 2 eingekoppelten Lichtstrahls vornimmt. Weiterhin ist die in 1 dargestellte Zylinderoptik 5 durch ein weiteres Element der Abbildungsoptik 6 ersetzt.
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Weiterhin ist im Detektionsstrahlengang 10 eine zweite Rastereinheit 22 eingefügt, welche mit der ersten Rastereinheit 21 derart synchronisiert ist, dass die zum jeweiligen Aufnahmezeitpunkt in der Fokusebene beleuchtete Zeile auf eine zeilenartige Anordnung von Detektorelementen eines Detektors 24 abgebildet wird. Die Synchronisation erfolgt mittels einer Synchronisationssignals, welches über eine Signalleitung 23 zwischen den Rastereinheiten 21, 22 oder an die Rastereinheiten 21, 22 übermittelt wird. Der Detektor 24 ist folglich nicht als flächenhafter Detektor, sondern als Zeilendetektor ausgestaltet. Der Detektor 24 liefert folglich nur ein eindimensionales Positionssignal, wobei ein weiteres Positionssignal über die Ansteuerung der ersten und zweiten Rastereinheit 21, 22 verfügbar ist. Im Übrigen entsprechen die Eigenschaften des Detektors 24 denjenigen des Detektors 14 von 1. Es sind folglich insgesamt die gleichen räumlichen und zeitlichen Informationen für eine Auswertung in der Auswerte- und Steuerelektronik 15 verfügbar. Aufgrund eines technischen vereinfachten Aufbaus eines Zeilendetektors gegenüber einem flächigen Detektor können jedoch höhere räumliche und zeitliche Auflösungen erreicht werden. Weiterhin können Sättigungseffekte und so genannte Pile-Up-Effekte (Überlagerungseffekte) vermindert werden.
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3 zeigt eine beispielhafte Folge von Pulsen der Beleuchtungsstrahlung. In 3 ist die Intensität der Beleuchtungsstrahlung mit I bezeichnet. Die Zeitachse ist mit t bezeichnet. Es ist zu erkennen, dass die Beleuchtungsstrahlung scharf definierte Pulse umfasst, wobei bei dem dargestellten Beispiel die Pulslänge bei etwa 20 ps liegt. Der Abstand zweier Pulse liegt wiederum bei 25 ns, was einer Wiederholrate von 40 MHz entspricht. Wie bereits erwähnt, umfassen die Beleuchtungsmittel zur Erzeugung der gepulsten Beleuchtungsstrahlung einen geeignet ausgestalteten Laser. Bei dem Laser kann es sich insbesondere um einen Superkontinuum-Laser handeln, welcher einen Wellenlängenbereich von wenigstens 450-700 nm abdeckt.
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4 zeigt beispielhaft den Verlauf einer Fluoreszenzabklingkurve, wie sie als Resultat der zeitaufgelösten Auswertung der Emissionsstrahlung mittels des Detektors 14, 24 und der Auswerte- und Steuerelektronik 15 der Mikroskopievorrichtungen von 1 und 2 gewonnen werden kann. Die Signalstärke der Fluoreszenzstrahlung ist in 4 mit F bezeichnet. Die Zeitachse ist mit t bezeichnet. Die Detektoren 14, 24 liefern für jedes ihrer Detektorelemente, d.h. für jeden Bildpunkt, eine Abklingkurve des in 4 dargestellten Typs. Die Fluoreszenzabklingkurve kann im Wesentlichen über den gesamten Zeitraum zwischen zwei aufeinander folgenden Pulsen der Beleuchtungsstrahlung erfasst werden.
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Wenn in dem Detektor 14, 24 ein zeitfensterbasierter Bildverstärker verwendet wird, wird die Fluoreszenzabklingkurve erfasst, indem mehrere Messungen mit unterschiedlich gesetzten Zeitfenstern erfolgen. Aus der Lage des Zeitfensters ergibt sich dann die Position eines Punktes der Abklingkurve entlang der Zeitachse. Wenn in dem Detektor 14, 24 ein orts- und zeitaufgelöster Einzelphotonenzähler verwendet wird, kann die Zeitinformation direkt aus der Ausgabe des Detektors 14, 24 gewonnen werden. Der Wert F für einen bestimmten Punkt auf der Zeitachse ergibt sich aus der für den Bereich dieses Zeitpunkts gezählten Anzahl von Photonen, d.h. durch eine histogrammartige Auswertung der erfassten Photonen.
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Eine Fluoreszenzabklingkurve des in 4 dargestellten Typs kann bei bildgebenden Untersuchungen zur Kontrastgebung gemäß einem Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren genutzt werden. Beispielsweise können zwei unterschiedliche fluoreszierende Farbstoffe voneinander unterschieden werden, was in eine Kontrastinformation umgesetzt werden kann. Bei einer detaillierten Erfassung der Fluoreszenzabklingkurve kann auch die Fluoreszenzlebensdauer rechnerisch ermittelt werden.
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In dem Fall, dass lediglich zwischen zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen unterschieden werden soll, kann bei Verwendung eines zeitfensterbasierten Bildverstärkers darauf verzichtet werden, im Wesentlichen die gesamte Fluoreszenzabklingkurve aufzunehmen. Vielmehr kann es ausreichen, lediglich zwei geeignet gesetzte Zeitfenster zu verwenden. Allgemein ist es möglich, anhand einer Abklingkurve des in 4 dargestellten Typs, verschiedene Signalanteile der Emissionsstrahlung voneinander zu unterscheiden und diese zu diskriminieren, wenn diese ein unterschiedliches Abklingverhalten aufweisen. Dies kann bei den Mikroskopievorrichtungen von 1 und 2 einerseits genutzt werden, um unerwünschte Signalanteile, z.B. Autofluoreszenzstrahlung oder reflektierte oder gestreute Beleuchtungsstrahlung, zu unterdrücken. Es ist jedoch auch möglich, diese verschiedenen Signalanteile separat auszuwerten und in Kontrastinformationen für das Bildgebungsverfahren umzusetzen.
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5 veranschaulicht beispielhaft eine Situation, in welcher sich die erfasste Fluoreszenzabklingkurve aus mehreren Signalanteilen zusammensetzt. Die Signalstärke der Fluoreszenzstrahlung ist mit F bzeichnet. Die Zeitachse ist mit t bezeichnet. In 5 ist der Laserimpuls durch eine gestrichelte Linie dargestellt. Ein erster Signalanteil der erfassten Abklingkurve ist durch eine strichpunktierte Linie dargestellt. Diesem Signalanteil ist eine das Abklingverhalten charakterisierende Lebensdauer von τ=10 ns zugeordnet. Ein zweiter Signalanteil der erfassten Abklingkurve ist durch eine gepunktete Linie dargestellt. Diesem Signalanteil ist eine das Abklingverhalten charakterisierende Lebensdauer von τ=1 ns zugeordnet. Eine durchgezogene Linie veranschaulicht das Gesamtsignal, welches sich aus dem ersten Signalanteil und dem zweiten Signalanteil zusammensetzt. Ein für die Detektion verwendetes Zeitfenster ist in 5 durch die schraffierte Fläche G dargestellt. Beispielsweise kann der erste Signalanteil der Fluoreszenz eines gezielt in das Untersuchungsobjekt eingebrachten Fluoreszenzfarbstoffs entsprechen, während der zweite Signalanteil einer Autofluoreszenz von in dem Untersuchungsobjekt natürlich enthaltenem Material entspricht. Bei vielen Anwendungen führt ein solcher auf Autofluoreszenz basierender Signalanteil zu einer starken Kontrastminderung.
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Wie aus 5 ersichtlich, ist das Zeitfenster G derart gesetzt, dass innerhalb des Zeitfensters G der Verlauf der Gesamtabklingkurve im Wesentlichen demjenigen des ersten Signalanteils entspricht, da zu Beginn des Zeitfensters der Abklingvorgang des ersten Signalanteils bereits im Wesentlichen abgeschlossen ist. Dies wird erreicht, indem die Anfangszeit des Zeitfensters G relativ zu dem Puls der Beleuchtungsstrahlung derart gesetzt ist, dass er wesentlich größer ist als die Lebensdauer τ des zu unterdrückenden Signalanteils. Um die beiden Signalanteile separat auswerten zu können, könnte ein zweites Zeitfenster gesetzt werden, welches den Zeitraum vor Beginn des Zeitfensters G abdeckt.
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Die Unterdrückung von Autofluoreszenzstrahlung ist insbesondere von Vorteil im Zusammenhang mit auflösungssteigernden Verfahren, wie z.B. dargestellt in „Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution“, E. Betzig et al., Science 313, 1542 (2006). Hier wird aus mehreren Einzelmolekülanregungen der Schwerpunkt der Intensitätsverteilung auf einem ortsaufgelösten Detektor für ein einzelnes Molekül ermittelt, wodurch Auflösungen bis zu 20 nm erreicht werden können. Da wie oben dargestellt bei den Mikroskopievorrichtungen von 1 und 2 Autofluoreszenzstrahlung effektiv unterdrückt werden kann, ermöglichen diese, ein solches auflösungssteigerndes Verfahren auch bei der bildgebenden Untersuchung von optischen Schnitten mit der SPIM-Technik einzusetzen. Insbesondere kann auf das Anregungsvolumen begrenzende Verfahren, wie z.B. Fluoreszenzmikroskopie mit interner Totalreflexion oder TIRF-Mikroskopie (TIRF: Total Interal Reflection Fluorescence), verzichtet werden.
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Weiterhin ist aus 5 auch ersichtlich, dass die zeitaufgelöste Erfassung der Emissionsstrahlung geeignet ist, Signalanteile der Beleuchtungsstrahlung, insbesondere reflektierte Beleuchtungsstrahlung, von den anderen Signalanteilen abzutrennen.
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Dies kann wiederum eingesetzt werden, um den Signalanteil reflektierter Beleuchtungsstrahlung in der erfassten Emissionsstrahlung zu unterdrücken, ohne dass hierfür das Emissionsfilter 13 erforderlich ist, oder um basierend auf der reflektierten Beleuchtungsstrahlung parallel eine separate bildgebende Auswertung vorzunehmen. Im letzteren Fall wird das Emissionsfilter 13 bevorzugt aus dem Detektionsstrahlengang entfernt. Hierbei ergibt sich als besonderer Vorteil, dass bei der Erzeugung der Beleuchtungsstrahlung keine Einschränkung hinsichtlich möglicher Anregungswellenbereiche oder -kombinationen besteht. Es können z.B. auch solche Anregungswellenbereiche oder -kombinationen verwendet werden, für welche keine als Emissionsfilter geeigneten optischen Filter verfügbar sind oder für welche solche Filter nur mit hohen Kosten oder hohem technischen Aufwand bereitgestellt werden können.
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Es versteht sich, dass die vorangegangene Beschreibung lediglich einige Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung abdeckt und dass in diesen Ausführungsbeispielen verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne von den wesentlichen Konzepten der Erfindung abzuweichen. Beispielsweise können die Beleuchtungsmittel auch mehrere Laser umfassen, deren Ausgangsstrahlung gemeinsam in den Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt wird. Außerdem ist es auch möglich, das Lichtblatt durch zeilenartiges Abrastern in der Fokusebene des Beleuchtungsstrahlengangs zu erzeugen, wie im Zusammenhang mit 2 erläutert, jedoch zur Erfassung der Emissionsstrahlung einen flächigen Detektor einzusetzen, wie im Zusammenhang mit 1 erläutert. In diesem Fall kann auf die zweite Rastereinheit im Detektionsstrahlengang verzichtet werden. Darüber hinaus ist es auch möglich, einen orts- und zeitaufgelösten Einzelphotonenzähler mit Detektionszeitfenstern zu betreiben, wie in Zusammenhang mit 5 erläutert.