DE102011051086A1

DE102011051086A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Abbildung einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur in einer Probe

Info

Publication number: DE102011051086A1
Application number: DE102011051086A
Authority: DE
Inventors: Stefan W. Hell; Jale Schneider; Johann Engelhardt
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2011-06-15
Filing date: 2011-06-15
Publication date: 2012-12-20

Abstract

Zum Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur (33) in einer Probe wird die Probe in einem Abtastbereich (28) mit einer um einen Fokuspunkt (29) eines fokussierten Anregungslichtstrahls lokalisierten Lichtintensitätsverteilung wiederholt abgetastet. Dabei werden die Abtastbedingungen so gewählt, dass das Fluoreszenzlicht in Form einzeln detektierbarer Photonen aus dem Abtastbereich (28) emittiert wird. Wenn diese Photonen detektiert werden, wird ihnen jeweils der Ort (32) des Fokuspunkts (29) zu dem entsprechenden Zeitpunkt zugeordnet. Ein Bild der Struktur (33) wird aus den Orten (32) zusammengesetzt, die den detektierten Photonen während mehrerer Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs (28) zugeordnet wurden.

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur in einer Probe, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patenanspruchs 1 aufweist, sowie auf eine Vorrichtung zur Durchführung eines solchen Verfahrens mit den Merkmalen des nebengeordneten Patentanspruchs 9.
Die Erfindung fällt damit auf das Gebiet der Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die hochauflösende Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie, bei der Maßnahmen getroffen sind, die es erlauben, aus einem Abtastbereich einer Probe emittiertes Fluoreszenzlicht mit höherer Ortsauflösung als der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Anregungslichts einem Ort der Probe zuzuordnen. Dieser Ort der Probe, bei dem es sich tatsächlich um einen Bereich um den Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichtstrahls mit den Abmessungen der erreichten räumlichen Auflösung handelt, wird hier auch als Messbereich bezeichnet. Mit dem "Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichtstrahls" wird hierbei auf den geometrischen Fokuspunkt Bezug genommen.
Die genannten Maßnahmen sind in der Regel damit verbunden, dass die Probe mit einer Lichtintensitätsverteilung abgetastet wird, die sich über ein größeres Volumen erstreckt als es der Ortsauflösung bei der Zuordnung des Fluoreszenzlichts zu dem jeweiligen Ort der Probe entspricht. Dies hat zur Folge, dass beim Abtasten der Probe mit der Lichtintensitätsverteilung die Probe bereits erheblichen Lichtintensitäten ausgesetzt worden ist, bevor sie von dem Messbereich erreicht wird.
Bereits bei der konfokalen Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie können diese Lichtintensitäten, denen die Probe vor dem eigentlichen Messen, d. h. dem Ermitteln der lokalen Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe, ausgesetzt wird, unerwünschte Folgen haben, wie beispielsweise ein teilweises Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs. Bei der hochauflösenden Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie, bei der neben dem Anregungslichtstrahl ein weiterer Lichtstrahl, so wie ein Stimulationslichtstrahl in der STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie, eingesetzt wird, können die dem eigentlichen Messbereich vorlaufenden Lichtintensitäten und deren negative Auswirkungen sehr groß werden. Dies gilt insbesondere dann, wenn die räumliche Auflösung durch hohe Lichtintensitäten dieses zusätzlichen Lichtstrahls maximiert wird. Empfindliche Fluoreszenzfarbstoffe sind deshalb für die bisher bekannten Verfahren der hochauflösenden Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie nicht geeignet, da sie vor dem Erreichen mit dem Messbereich bereits mit so hohen Intensitäten des Anregungslichtstrahls und eines Stimulationslichtstrahls beaufschlagt werden, dass sie vollständig gebleicht sind.
STAND DER TECHNIK
Ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 9 sind aus der WO 2010/069987 A1 bekannt. Dieses Dokument befasst sich mit der konstruktiven Ausgestaltung eines Rasterscanners, der die miteinander kombinierten Anregungs- und Stimulationslichtstrahlen so gegenüber der Pupille einer gemeinsamen fokussierenden Optik dynamisch ausrichtet, dass eine Nullstelle der Intensitätsverteilung des Stimulationslichts am Fokuspunkt des Anregungslichts über den gesamten Abtastbereich erhalten bleibt.
Aus der DE 10 2005 027 896 A1 sind ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs des nebengeordneten Patentanspruchs 9 bekannt, bei denen durch Bereitstellen der Lichtintensitätsverteilung in Pulsen mit vergleichsweise großen zeitlichen Abständen und/oder durch vergleichsweise schnelles Abtasten der Probe mit der Lichtintensitätsverteilung dieselben Bereiche der Probe nur in einem optimierten zeitlichen Wiederholungsabstand der Lichtintensitätsverteilung ausgesetzt werden. Auf diese Weise wird die Intensität des von der Probe erhältlichen Fluoreszenzlichts erhöht, weil die Rate, mit der der jeweilige Fluoreszenzfarbstoff aus einem angeregten Zwischenzustand durch weitere Anregung in einen permanenten oder nur langsam abklingenden Dunkelzustand gelangt, erheblich reduziert wird. Anders gesagt wird mit einem relativ großen Wiederholungsabstand des Beaufschlagens jedes einzelnen Bereichs der Probe mit der Lichtintensitätsverteilung die in einem bestimmten Zeitraum von der gesamten Probe erhältliche Menge an Fluoreszenzlicht maximiert. Konkret wird dazu beispielsweise eine Wiederholungsfrequenz einer gepulsten Lichtintensitätsverteilung von 80 MHz auf 50 kHz abgesenkt. Diese bekannte Vorgehensweise reduziert auch eine Neigung des Fluoreszenzfarbstoffs, unter Einwirkung der Lichtintensitätsverteilung zu bleichen, weil eine stärkere Besetzung von angeregten Zuständen, aus denen heraus eine photochemische Zerstörung des Fluoreszenzfarbstoffs erfolgt, vermieden wird. Das photochemische Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs ist aber nicht die der DE 10 2005 027 896 A1 zugrunde liegende Problematik.
Wenn gemäß der DE 10 2005 027 896 A1 die Abtastgeschwindigkeit erhöht wird, mit der die jeweilige Probe abgetastet wird, werden die Photonen von den Probe vorzugsweise mit einem ein- oder zweidimensionalen Lichtsensorarray registriert, auf das zumindest ein Teil der Probe zeitlich invariant abgebildet wird. Der sich beim Abtasten der Probe gegenüber der Probe verschiebende Fokuspunkt des Fluoreszenzlichts wird so fortlaufend auf andere Lichtsensorarrays abgebildet, wobei jedoch derselbe Lichtsensor immer Photonen aus demselben Bereich der Probe registriert. So ist mit dem schnellen Abtasten der Probe kein Problem bei der Trennung von Photonen aus verschiedenen Bereichen der Probe verbunden. Das Lichtsensorarray kann eine Kamera, insbesondere eine elektronische Kamera, wie beispielsweise eine CCD- oder CMOS-Kamera sein. Wenn in diesem Zusammenhang in der DE 10 2005 027 896 A1 von Photonen die Rede ist, geht es nicht darum, mit dem Lichtsensorarray einzelne Photonen, sondern Lichtintensitäten des von der Probe kommenden Fluoreszenzlichts zu erfassen.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur einer Probe aufzuzeigen, die die Durchführung hochauflösender Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie auch mit gegenüber Bleichen höchstempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffen erlauben.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des nebengeordneten Patentanspruchs 9 gelöst.
Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind in den abhängigen Patentansprüchen definiert.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur einer Probe, bei dem die Probe in einem Abtastbereich mit einer um einen Fokuspunkt eines fokussierten Anregungslichtstrahls lokalisierten Lichtintensitätsverteilung wiederholt abgetastet wird und aus dem Abtastbereich emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und dem jeweiligen Ort des Fokuspunkts zugeordnet wird, werden die Abtastbedingung insgesamt so eingestellt, dass das Fluoreszenzlicht in Form einzeln detektierbarer Photonen aus dem Abtastbereich emittiert wird. Ein Bild der Struktur wird dann aus den Orten zusammengesetzt, die den detektierten Photonen während mehrerer Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs zugeordnet wurden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Rate, mit der Bilder der interessierenden Struktur erstellt werden, viel kleiner als die Rate, mit der der Abtastbereich abgetastet wird. Während jedes Abtastens des Abtastbereichs mit der um den Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichtstrahls lokalisierten Lichtintensitätsverteilung werden typischerweise nur wenige Photonen detektiert und einzeln dem jeweiligen Ort des Fokuspunkts zugeordnet. Erst aus einer größeren Zahl solcher Zuordnungen über mehrere Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs hinweg entsteht ein zunehmend vollständiger werdendes Bild der interessierenden Struktur.
Indem jedes detektierte Photon bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Berücksichtigung findet, findet ein jedes Molekül des Fluoreszenzfarbstoffs, mit dem die interessierende Struktur markiert ist, bei dem Bild der interessierenden Struktur Berücksichtigung, soweit es nur ein einzelnes Photon emittiert hat, das anschließend detektiert wurde. Allein deshalb ist das erfindungsgemäße Verfahren auch für hochempfindliche, d. h. stark zum Bleichen neigende Fluoreszenzfarbstoffe geeignet. Darüber hinaus bedeutet die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs zur Emission von Fluoreszenzlicht im Umfang nur weniger Photonen während jedes Abtastens des Abtastbereichs, dass der Fluoreszenzfarbstoff in dem gesamten Abtastbereich während jeder Wiederholung des Abtastens des Abtastbereichs mit einer nur sehr geringen Wahrscheinlichkeit gebleicht wird. Dieser Zusammenhang gilt immer, weil die Wahrscheinlichkeit des Bleichens mit der Wahrscheinlichkeit der Anregung von Fluoreszenzlicht positiv korreliert ist, gleich wie die Zusammenhänge im Einzelnen aussehen.
Dies bedeutet insbesondere, dass mit dem Messbereich, der sich innerhalb der lokalisierten Lichtintensitätsverteilung, mit der der Abtastbereich abgetastet wird, um den Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichtstrahls erstreckt, jeder Punkt des Abtastbereichs erreicht wird, bevor selbst ein hochempfindlicher, d. h. stark zum Bleichen neigender Fluoreszenzfarbstoff zu relevanten Teilen gebleicht ist. Dies gilt selbst dann, wenn die Lichtintensitätsverteilung neben dem Anregungslichtstrahl einen weiteren, zur Erhöhung der Ortsauflösung eingesetzten Lichtstrahl, so wie einen Stimulationslichtstrahl in der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie, umfasst, dessen Intensitätsverteilung an dem Fokuspunkt des Anregungslichtstrahls zwar eine Nullstelle aber im Umfeld des Fokuspunkts des Anregungslichtstrahls eine sehr hohe Intensität aufweist.
Die bleichende Wirkung eines solchen Stimulationslichtstrahls basiert üblicherweise auf der Wechselwirkung mit dem Anregungslichtstrahl. Wenn die Abtastbedingungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren so gewählt werden, dass nur einzelne, getrennt detektierbare Photonen aus dem Abtastbereich emittiert werden, ist dies gleichbedeutend damit, dass auch diese Wechselwirkung nur ein geringes Maß annimmt und damit nur mit geringer Wahrscheinlichkeit zum Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs führt.
Die Abtastbedingungen, mit denen erreicht wird, dass das Fluoreszenzlicht beim Abtasten in Form einzeln detektierbarer Photonen aus dem Abtastbereich emittiert wird, umfassen neben der Abtastgeschwindigkeit, mit der der Fokuspunkt gegenüber der Probe verschoben wird, und den Lichtintensitäten der Lichtintensitätsverteilung insbesondere die Eigenschaften und die Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Abtastbereich. Dabei kann zum Abstimmen der Abtastbedingungen auf den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff und die jeweilige Probe, wie schon erwähnt, die Lichtintensität des fokussierten Anregungslichtstrahls reduziert werden. Dies kann effektiv auch durch hochfrequentes Modulieren der Lichtintensität des fokussierten Anregungslichtstrahls realisiert werden.
Egal wie die Abtastbedingungen abgestimmt werden, um das erfindungsgemäße Kriterium der einzeln registrierbaren Photonen des Fluoreszenzlichts aus dem Abtastbereich einzuhalten, wird erreicht, dass die Belastung des Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe bei jedem Abtasten des Abtastbereichs so klein bleibt, dass die Wahrscheinlichkeit des Bleichens eines bestimmten Moleküls des Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe nur gering ist, bis es beim Abtasten in den Messbereich um den Fokuspunkt des Anregungslichtstrahls gelangt. Dass es in dem Messbereich zur Emission eines Photons durch Fluoreszenz angeregt wird, das auch detektiert wird, ist bei den Abtastbedingungen zwar ebenfalls nicht sehr wahrscheinlich. Diese Wahrscheinlichkeit ist aber viel höher als dann, wenn das betrachtete Molekül des Fluoreszenzfarbstoffs bereits vor dem ersten Gelangen in den Messbereich durch die dem Messbereich vorlaufenden Lichtintensitäten mit höchster Wahrscheinlichkeit gebleicht wäre.
Wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Abstimmen der Abtastbedingungen die Abtastgeschwindigkeit erhöht wird, wird der angestrebte Effekt der reduzierten Belastung des Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe bei jedem Abtasten des Abtastbereichs erreicht, ohne dass sich die Durchführung des Verfahrens, bis ausreichend Photonen für ein Bild der interessierenden Struktur in der Probe registriert sind, lange hinzieht. Für das erfindungsgemäße verfahren kommt es nicht darauf an, die Emission nur weniger Photonen in einem bestimmten Zeitraum hervorzurufen, sondern die Emission nur weniger Photonen bei jeder Wiederholung des Abtastens des Abtastbereichs. Daher kann durch eine erhöhte Abtastgeschwindigkeit und eine damit erhöhte Frequenz, mit der der Abtastbereich abgetastet wird, die Ausbeute an Photonen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren schadlos erhöht werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können die räumlichen Verteilungen auch von gegenüber Bleichen hochempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffen mit hochauflösender Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie, insbesondere mit STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie, erfasst werden.
Konkret kann beim Abstimmen der Abtastbedingungen die Abtastgeschwindigkeit so hoch eingestellt werden, dass eine Pixel-Dwell-Time von kleinergleich 10 ns, vorzugsweise kleinergleich 7 ns und am meisten bevorzugt etwa 6 ns erreicht wird. Die Pixel-Dwell-Time ist die Zeit, binnen derer der geometrische Fokuspunkt eine Strecke zurücklegt, die der räumlichen Auflösung des jeweiligen Rasterfluoreszenzlichtmikroskopieverfahrens entspricht. Bei STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie liegt die räumliche Auflösung bei 20 nm. Entsprechend beträgt die Abtastgeschwindigkeit dann vorzugsweise etwa 3 nm/ns, d. h. 3 m/s oder etwa 10 km/h.
Durch die geringe Anzahl von Photonen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren während jedes Abtastens des Abtastbereichs detektiert und einzelnen Orten der Probe zugeordnet werden, müssen die den einzelnen Photonen während allermindestens 3, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 100 und am meisten bevorzugt mindestens 1000 aufeinanderfolgenden Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs zugeordnet wurden, zu einem Bild der Struktur zusammengesetzt werden.
Die während einer längeren Messperiode den einzelnen Photonen zugeordneten Orte der Probe können aber auch verwendet werden, um einen Film, d. h. eine Folge von zeitlich aneinander anschließenden Bildern der Probe zu generieren, indem aus den Orten, die den einzelnen Photonen während einer Vielzahl von aufeinanderfolgenden Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs zugeordnet wurden, mehrere zeitlich aufeinanderfolgenden Bilder der Struktur zusammengesetzt werden. Dieses Zusammensetzen erfolgt im Auswertestadium des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das heißt, es kann ohne Informationsverlust ausprobiert werden, wie viele Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs zusammengefasst werden müssen, um ein einzelnes Bild mit der gewünschten Informationsdichte bereitzustellen.
Es versteht sich, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch alle anderen bekannten vorteilhaften Detailausgestaltungen zur Anwendung kommen können, wie sie aus der Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie grundsätzlich bekannt sind. Hierzu zählt es beispielsweise, den Abtastbereich auf solche Bereiche der Probe zu konzentrieren, in denen sich interessierende Strukturen befinden. Hierzu zählt es auch, das Abtastend des Abtastbereichs in einem ganz genau definierten Muster mit möglichst konstanter Abtastgeschwindigkeit und konstantem Zeilenvorschub durchzuführen. Ein definiertes Abtastmuster ist z. B. Voraussetzung dafür, den Ort des Fokuspunkts des Anregungslichtstrahls in der Probe, der einem einzelnen Photon des Fluoreszenzlichts aus dem Abtastbereich zugeordnet wird, allein aus dem Zeitpunkt der Detektion des Photons bestimmen zu können. Bei einer konstanten Abtastgeschwindigkeit und einem konstanten Zeilenvorschub können zum Beispiel die Ortskoordinaten des Orts des Fokuspunkts in der Probe aus Zählerständen von Zählern abgeleitet werden, von denen einer längs jeder Zeile und der zweite die Zeilenvorschübe zählt.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist eine Anregungslichtquelle zur Bereitstellung des Anregungslichtstrahls, ein Objektiv zum Fokussieren des Anregungslichtstrahls, einen Rasterscanner zum wiederholten Abtastens des Abtastbereichs mit der um den Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichtstrahls lokalisierten Lichtintensitätsverteilung, ein Detektor zum Detektieren des aus dem Abtastbereichs emittierten Fluoreszenzlichts und eine Auswerteeinrichtung auf, die das Fluoreszenzlicht dem jeweiligen Ort des Fokuspunkts zuordnet. Dabei ist eine Steuerung vorgesehen, die die Abtastbedingungen, mit denen der Abtastbereich abgetastet wird, so abstimmt, dass das Fluoreszenzlicht in Form einzeln detektierbarer Photonen aus dem Abtastbereich emittiert wird. Dann setzt die Auswerteeinrichtung ein Bild der Struktur aus den Orten zusammen, die den detektierten Photonen während mehrerer Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs zugeordnet wurden.
Die Anregungslichtquelle und eine etwaige Stimulationsquelle können jeweils einen Dauerstrichlaser aber auch einen hochfrequenzgepulsten Laser aufweisen. Der Rasterscanner weist typischerweise zumindest für das schnelle Scannen längs einer Zeile einen elektrooptischen Deflektor auf. Der Zeilenvorschub kann durch einen vergleichsweise langsameren Scanner beispielsweise auf Basis eines Galvanometers realisiert sein.
Der Detektor der neuen Vorrichtung ist vorzugsweise ein Punktdetektor, dieser kann konfokal zu dem Fokuspunkt des Anregungslichtstrahls angeordnet sein. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen so genannten Hybriddetektor, der mehrere Detektoreinheiten aufweist, um auch dicht zeitlich aufeinanderfolgende Photonen einzeln zeitgenau detektieren zu können.
Weitere bevorzugte Details der erfindungsgemäßen Vorrichtung wurden bereits im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erläutert.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile von allen erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die Erfindung wird im Folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert und beschrieben.
1 zeigt den Aufbau eines STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskops als Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
2 zeigt illustriert das einmalige Abtasten eines Abtastbereichs mit einem Fokuspunkt eines Anregungslichtstrahls in dem STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop gemäß 1.
3 zeigt ein Bild einer Struktur in einer Probe, das nach dem wiederholten Abtasten der Probe gemäß 2 aus den Orten generiert wurde, die dabei einzeln detektierten Photonen von Fluoreszenzlicht aus dem Abtastbereich zugeordnet wurden.
FIGURENBESCHREIBUNG
Das in 1 als Beispiel für eine erfindungsgemäße Vorrichtung 1 illustrierte STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop 2 weist eine Anregungslichtquelle 3 in Form eines Lasers auf, der einen Anregungslichtstrahl 4 abgibt. Die Wellenlänge des Anregungslichtstrahls 4 wird hier durch ein akustisch-optisch einstellbares Filter 5 selektiert, um das Anregungslicht später chromatisch von Fluoreszenzlicht trennen zu können, das durch das Anregungslicht angeregt wird. Neben der Anregungslichtquelle 3 ist eine Stimulationslichtquelle 6 vorgesehen, die einen Stimulationslichtstrahl 7 abgibt, der mit einer Optik 8 geformt, einem Spiegel 9 zu einem dichroitischen Strahlteiler 10 umgelenkt und vor dem Auftreffen auf den dichroitischen Strahlteiler 10 mit einem Wellenfrontmodulator 11 bezüglich seiner Wellenfronten aberriert wird. Mit Hilfe des dichroitischen Spiegels 10 werden der Anregungslichtstrahl 4 und der Stimulationslichtstrahl 7 auf einer optischen Achse zusammengefasst. Auf dieser treten sie zunächst durch einen elektro-optischen Modulator 34 hindurch, bevor sie von einem Spiegel 12 umgelenkt werden und durch einen elektro-optischen Deflektor 13 hindurchtreten. Diesem folgt eine Optik 14 zur Strahlformung, eine Umlenkanordnung aus einem Spiegel 15 und einem zugleich als Bandpassfilter dienenden Spiegel 16. Anschließend lenkt ein weiterer Spiegel 17 die Lichtstrahlen in ein Objektiv 18, vor dem noch ein Galvanometer 19 und eine Phasenplatte 20 angeordnet sind. Das Objektiv 18 fokussiert die beiden Lichtstrahlen 4, 7 in einer Probe 21 auf einen gemeinsamen Fokuspunkt. Dabei weist das Anregungslicht des Anregungslichtstrahls 4 in dem Fokuspunkt seine maximale Intensität auf, während das Stimulationslichts des Stimulationslichtstrahls 7 hier aufgrund seiner aberrierten Wellenfronten eine Nullstelle hat. Da das Stimulationslicht des Stimulationslichts 7 fluoreszenzverhindernd wirkt, kann von dem Anregungslicht des Anregungslichtstrahls 4 angeregtes Fluoreszenzlicht praktisch nur aus dem Bereich unmittelbar um den Fokuspunkt des Anregungslichts 4 stammen und damit aus einem kleineren Bereich als einem beugungsbegrenzten Spot. Registriert wird das Fluoreszenzlicht 22 von der Probe 21 mit einem Detektor 23, der hinter dem Spiegel 16 angeordnet ist, wobei dessen Bandpassfilter auf die Wellenlänge des Fluoreszenzlichts 22 abgestimmt ist. Im Strahlengang des separierten Fluoreszenzlichts 22 sind hier zwei Spiegel 24 und 25, eine zweiteilige Optik 26 und eine Schlitzblende 27 vorgesehen. Aufgrund der Schlitzblende 27 ist die Anordnung des Detektors 23 in einer Richtung konfokal bezüglich des Fokuspunkts des Anregungslichtstrahls 4 in der Probe 21. Das separierte Fluoreszenzlicht 22 ist an dem Spiegel 16 aber noch nicht vollständig entscannt, weil Verschiebungen der Lichtstrahlen 4 und 7 mittels des elektro-optischen Deflektors 13 noch nicht rückgängig gemacht sind. Dieser elektrooptische Deflektor 13 dient zum schnellen zeilenweisen Scannen oder Abtasten eines Abtastbereichs in der Probe 21 mit dem Fokuspunkt des Anregungslichtstrahls. Demgegenüber ist das Galvanometer 19 für den etwas langsameren Vorschub zwischen den einzelnen Zeilen beim Scannen des Abtastbereichs vorgesehen. Der elektro-optische Modulator 34 kann genutzt werden, um beispielsweise beim Scannen einen Zeilenrücklauf ohne Beaufschlagung der Probe mit Anregungslicht und Stimulationslicht vorzusehen. Die Phasenplatte 20 dient zur Optimierung der Polarisation des Fluoreszenzlichts 22 im Hinblick auf seine Transmission bis zu und damit seine Detektionsausbeute in dem Detektor 23.
2 skizziert einen Abtastbereich 28, der mit dem Fokuspunkt 29 des Anregungslichtstrahls 4 gemäß 1 abgetastet wird. Dabei ist die Zeilenrichtung 30, in der ein schnelles Abtasten erfolgt, hier senkrecht und die Zeilenvorschubrichtung 31 hier waagerecht wiedergegeben. Beispielsweise möge jede Zeile 6 µm lang sein und binnen 2 µs abgetastet werden. Die Ortsauflösung in der STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie beträgt etwas 20 nm. Dies bedeutet, dass auf jede Zeile etwa 300 auflösbare Pixel entfallen, von denen jedes von dem Fokuspunkt 29 binnen weniger als 7 ns durchlaufen wird. In der Zeilenvorschubrichtung 21 erfolgt der Zeilenvorschub zwischen zwei benachbarten Zeilen um jeweils die Auflösungsgrenze von 20 nm (2 ist zwischen der Zeilenrichtung 30 und der Zeilenvorschubrichtung 31 nicht maßstabgerecht). Während des Abtastens des Abtastbereichs 28 mit dem Fokuspunkt 29 mit Hilfe des Detektors 23 gemäß 1 detektierte einzelne Photonen werden den Orten 32 zugeordnet, an denen sich der Fokuspunkt 29 während des Detektierens des jeweiligen Photons befand. Aus den derart über mehrere Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs 28 gewonnenen Informationen wird ein Bild zusammengesetzt, das die Verteilung des Fluoreszenzlichts von der Probe wiedergibt und damit eine Darstellung einer Struktur ist, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der dieses Fluoreszenzlicht emittiert, in der Probe markiert ist.
Ein solches Bild ist in 3 illustriert. Die Summe der einzelnen Orte 32 über eine Vielzahl von Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs 28 lässt die interessierende Struktur 33 deutlich werden. Ein solches Bild kann bei der beschriebenen Vorgehensweise auch dann aufgenommen werden, wenn der Fluoreszenzfarbstoff, mit dem die Struktur 33 markiert ist, hochempfindlich gegenüber einem Bleichen durch die auf ihn einwirkenden Lichtintensitäten des Stimulationslichtstrahls 7 und des Anregungslichtstrahls 4 ist, denen er ausgesetzt wird, bevor er in den Bereich des Fokuspunkts 29 gelangt. Indem die Abtastbedingungen hier so gewählt sind, dass bei jedem Abtastvorgang nur einzelne Photonen von Fluoreszenzlicht detektiert werden, ist bei jedem einzelnen Abtasten des Abtastbereichs nicht nur die Wahrscheinlichkeit der Emission von Fluoreszenzlicht sondern auch die Wahrscheinlichkeit des Bleichens des Fluoreszenzfaktors gering. Soweit ein Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs auftritt, erfolgt dies über viele Wiederholungen des Abtasten des Abtastbereichs über den gesamten Abtastbereich hinweg, so dass vor dem endgültigen Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs von allen seinen Molekülen, die über den Abtastbereich 28 verteilt sind, mit einer hohen Wahrscheinlichkeit Photonen detektiert werden konnten. Bei herkömmlicher STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie hingegen, bei der an jedem Ort des Fokuspunkts 29 möglichst viel Fluoreszenzlicht aufgefangen wird, kann hingegen ein empfindlicher Fluoreszenzfarbstoff von den vorlaufenden Lichtintensitäten vollständig gebleicht werden, bevor er von dem eigentlichen Messpunkt erreicht wird.
Bezugszeichenliste

1: Vorrichtung
2: STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop
3: Anregungslichtquelle
4: Anregungslichtstrahl
5: akustisch-optisch einstellbares Filter
6: Stimulationslichtquelle
7: Stimulationslichtstrahl
8: Optik
9: Spiegel
10: dichroitischer Strahlenteiler
11: Wellenfrontenmodulator
12: Spiegel
13: elektro-optischer Deflektor
14: Optik
15: Spiegel
16: Spiegel mit Bandpassfilter
17: Spiegel
18: Objektiv
19: Galvanometer
20: Phasenplatte
21: Probe
22: Fluoreszenzlicht
23: Detektor
24: Spiegel
25: Spiegel
26: Optik
27: Schlitzblende
28: Abtastbereich
29: Fokuspunkt
30: Zeilenrichtung
31: Zeilenvorschubrichtung
32: Ort
33: Struktur
34: elektro-optischer Modulator

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2010/069987 A1 [0005]
DE 102005027896 A1 [0006, 0006, 0007, 0007]

Claims

Verfahren zum Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur (33) in einer Probe (21), – wobei die Probe (21) in einem Abtastbereich (28) mit einer um einen Fokuspunkt (29) eines fokussierten Anregungslichtstrahls (4) lokalisierten Lichtintensitätsverteilung wiederholt abgetastet wird und – wobei aus dem Abtastbereich (28) emittiertes Fluoreszenzlicht (22) detektiert und dem jeweiligen Ort (32) des Fokuspunkts (29) zugeordnet wird, dadurch gekennzeichnet, dass Abtastbedingungen, die neben einer Abtastgeschwindigkeit, mit der der Fokuspunkt (29) gegenüber der Probe (21) verschoben wird, und Lichtintensitäten der Lichtintensitätsverteilung Eigenschaften und eine Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Abtastbereich (28) umfassen, so aufeinander abgestimmt werden, dass das Fluoreszenzlicht (22) in Form einzeln detektierbarer Photonen aus dem Abtastbereich (28) emittiert wird; und dass ein Bild der Struktur (33) aus den Orten (32) zusammengesetzt wird, die den detektierten Photonen während mehrerer Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs zugeordnet wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtintensitätsverteilung einen bezüglich des Verlaufs seiner Wellenfronten aberrierten, fokussierten Stimulationslichtstrahl (7) umfasst, dessen Stimulationslichtintensitätsverteilung an dem Fokuspunkt (29) des Anregungslichtstrahls (4) eine Nullstelle aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abstimmen der Abtastbedingungen die Lichtintensität des fokussierten Anregungslichtstrahls (4) reduziert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abstimmen der Abtastbedingungen die Lichtintensität des fokussierten Anregungslichtstrahls (4) hochfrequent moduliert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abstimmen der Abtastbedingungen die Abtastgeschwindigkeit erhöht wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass beim Abstimmen der Abtastbedingungen die Abtastgeschwindigkeit so hoch eingestellt wird, dass eine Pixel-Dwell-Time von kleiner gleich 10 ns, vorzugsweise von kleiner gleich 7 ns erreicht wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Bild der Struktur (33) aus den Orten (32) zusammengesetzt wird, die den einzelnen Photonen während mindestens 3, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt wenigstens 100 und am meisten bevorzugt mindestens 1000 aufeinander folgenden Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs (28) zugeordnet wurden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass aus den Orten (32), die einzelnen Photonen während einer Vielzahl von aufeinander folgenden Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs (28) zugeordnet wurden, mehrere zeitlich aufeinander folgende Bilder der Struktur (33) zusammengesetzt werden.
Vorrichtung (1) zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, – mit einer Anregungslichtquelle (3) zur Bereitstellung eines Anregungslichtstrahls(4); – mit einem Objektiv (18) zum Fokussieren des Anregungslichtstrahls (4); – mit einem Rasterscanner zum wiederholten Abtasten eines Abtastbereichs (28) mit einer um einen Fokuspunkt (29) des fokussierten Anregungslichtstrahls (4) lokalisierten Lichtintensitätsverteilung; – mit einem Detektor (23) zum Detektieren von aus dem Abtastbereich (28) emittiertem Fluoreszenzlicht (22); und – mit einer Auswerteeinrichtung, die das Fluoreszenzlicht dem jeweiligen Ort des Fokuspunkts (29) zugeordnet, dadurch gekennzeichnet, dass eine Steuerung vorgesehen ist, die Abtastbedingungen, die neben einer Abtastgeschwindigkeit, mit der der Fokuspunkt (29) gegenüber der Probe (21) verschoben wird, und Lichtintensitäten der Lichtintensitätsverteilung Eigenschaften und eine Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Abtastbereich (28) umfassen, so aufeinander abstimmt, dass das Fluoreszenzlicht (22) in Form einzeln detektierbarer Photonen aus dem Abtastbereich (28) emittiert wird; und dass die Auswerteeinrichtung ein Bild der Struktur (33) aus den Orten (32) zusammensetzt, die den detektierten Photonen während mehrerer Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs (28) zugeordnet wurden.
Vorrichtung (1) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Stimulationslichtquelle (6) vorgesehen ist, die einen bezüglich des Verlaufs seiner Wellenfronten aberrierten Stimulationslichtstrahl (7) bereitstellt, welcher von dem Objektiv (18) in den Fokuspunkt (29) des Anregungslichtstrahls (4) fokussiert und von dem Rasterscanner mit dem Anregungslichtstrahl (4) verschoben wird, wobei die Lichtintensitätsverteilung eine Stimulationslichtintensitätsverteilung mit einer Nullstelle an dem Fokuspunkt (29) des Anregungslichtstrahls (4) aufweist.
Vorrichtung (1) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichtquelle (3) und die Stimulationslichtquelle (6) jeweils einen Dauerstrichlaser oder einen hochfrequent gepulsten Laser aufweisen.
Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Rasterscanner einen elektro-optischen Deflektor aufweist.
Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (23) ein Punktdetektor ist.
Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (23) ein Hybriddetektor ist.
Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteeinrichtung aus den Orten (32), die einzelnen Photonen während einer Vielzahl von aufeinander folgenden Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs (28) zugeordnet wurden, mehrere zeitlich aufeinander folgende Bilder der Struktur (33) zusammensetzt.