DE1016711B

DE1016711B - Verfahren zur Herstellung der Erdalkalisalze des Antibioticums Cycloserin

Info

Publication number: DE1016711B
Application number: DEC11742A
Authority: DE
Inventors: Roger Lee Harned
Original assignee: Commercial Solvents Corp
Current assignee: Commercial Solvents Corp
Priority date: 1954-08-24
Filing date: 1955-08-22
Publication date: 1957-10-03

Description

Verfahren zur Herstellung der Erdalkalisalze des Antibioticums Cycloserin Die Erfindung betrifft die Herstellung der Erdalkalisalze des antibiotisch wirksamen Cycloserins.
Das Verfahren der Erfindung wird durchgeführt, indem man entweder Cycloserin in wäßriger Lösung mit einer Erdalkalibase umsetzt oder eine wäßrige Aufschlämmung des Silbercycloserins mit einem wasserlöslichen Erdalkalisalz versetzt, dessen Anion mit dem Silberion des Silbercycloserins ein wasserunlösliches Silbersalz bildet, dieses von der Lösung abtrennt und die Cycloserinsalzlösung im Vakuum gefriertrocknet.
Das Antibioticum Cycloserin ist ein bakterizid wirkendes Mittel von großer Wirkungsbreite, das sowohl gegen gramnegative als auch grampositive Bakterien, einschließlich der Mycobakterien, z. B. Mycobacterium ranae, wirksam ist. Das neue Antibioticum wird durch eine Mikroorganismenart gebildet, der man den Namen Streptomyces orchidaceus gegeben hat. Das Antibioticum ist eine amphotere Verbindung, die schwach saure und schwach basische Gruppen besitzt, in Wasser sehr gut löslich, in Glykolen, Isopropylalkohol, Methanol, Äthanol und Aceton zum Teil löslich und in Hexan, Benzol, Chloroform, Äther, Petroläther, Dioxan, Butanol-(1), Essigsäureäthylester und Äthylendichlorid unlöslich ist. Das Cycloserin schmilzt unter Zersetzung bei etwa 152' und wird dann durch 1 n-Salzsäure bei 140' hydrolytisch gespalten.
Zur Herstellung des neuen Antibioticums Cycloserin wird der Mikroorganismus Streptomyces orchidaceus unter Luftzufuhr bei etwa 20 bis 30' in einer Nährstofflösung gezüchtet, die eine geeignete Eiweiß- und eine geeignete Kohlehydratquelle enthält.
Es wurde festgestellt, daß Cycloserin in der freien Form in wäßriger Lösung verhältnismäßig unbeständig ist. Der größte Teil der Wirksamkeit des Cycloserins geht nämlich in wäßriger Lösung bei Raumtemperatur schon nach etwa 1 bis 2 Tagen verloren. Diese Tatsache läßt die Anwendung des Antibioticums als nicht zweckmäßig erscheinen, da nur die frisch bereitete wäßrige Lösung verwendet werden kann.
Verhältnismäßig beständig sind die Alkalisalze des Cycloserins. Aber sie sind so hygroskopisch, daß sie nicht leicht in der Salzform gewonnen werden können.
Die nach dem Verfahren der Erfindung herstellbaren Erdalkalisalze des Antibioticums Cycloserin können leicht und in guter Ausbeute erhalten werden, sind nicht hygroskopisch, also auch lagerfähig, und sind in wäßriger Lösung lange beständig. Die neuen Cycloserinsalze können durch Zugabe des Cycloserins in freier Form zu einem Erdalkalihydroxyd, 20minütiges Rühren der Mischung, Filtrieren und Gefriertrocknung des Filtrats im Vakuum hergestellt werden. Die neuen Salze können auch durch Aufschlämmen des Silbersalzes des Cycloserins in Wasser, Zugeben eines wasserlöslichen Erdalkalisalzes, das ein zur Bildung eines unlöslichen Silbersalzes befähigtes Anion, z. B. ein Chlorion besitzt, Abtrennen des ausgefällten Silbersalzes, z. B. des Silberchlorids, von der Lösung des Erdalkalisalzes des Cycloserins und Trocknen der Salzlösung durch Gefriertrocknung im Vakuum hergestellt werden. Diese Umsetzung wird bevorzugt mit Calcium-, MLagnesium-, Barium- oder Strontiumchlorid durchgeführt.
Das Silbersalz des Cycloserins kann nach verschiedenen Verfahren gewonnen werden. Nach einem dieser Verfahren wird die filtrierte Nährstofflösung, in welcher das Antibioticum Cycloserin durch Züchtung des Organismus Streptomyces orchidaceus gebildet wurde, mit Holzkohle behandelt und nach dem Abfiltrieren Kohle bei einem pl,-Wert zwischen 5,5 und 9,0 mit Silbernitrat versetzt. Das ausgefällte Silbersalz des Cycloserins wird sodann von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt und getrocknet. Aus dem Silbersalz kann freies Cycloserin durch Zusatz von Salzsäure zur wäßrigen Aufschlämmung des Silbersalzes und Entfernung des Silberchlorids aus der sich ergebenden wäßrigen Lösung des Cycloserins und Trocknen der Lösung nach einem geeigneten Verfahren, z. B. durch Sprühtrocknung oder durch Gefriertrocknung im Vakuum, gewonnen werden; dabei entsteht trockenes, amorphes, freies Cycloserin.
Dem Silbercycloserin gegenüber, das unlöslich ist, sind die Erdalkalisalze wegen ihrer hohen Löslichkeit in Wasser vorteilhafter, da man Lösungen des Cycloserins herstellen kann, die die in Wasser beständigen Erdalkalisalze enthalten, während freies Cycloserin inWasser unbeständig ist.
Die Erdalkalisalze des Cycloserins lassen sich medizinisch verwenden. Es sind große Mengen z. B. des Bariumsalzes an Menschen innerlich verabreicht worden, ohne daß sich Störungen oder Schädigungen irgendwelcher Art eingestellt hätten. Vor allem steht aber auch der äußerlichen Anwendung dieser Produkte nichts im Wege.

Die verschiedenen Erdalkalisalze des Cycloserins haben folgende Eigenschaften.

Cycloserinsalze des

Bariulns Strontiums Magnesiums Caleiums

Zersetzungspunkt ..... etwa 195' etwa 200' etwa 200' etwa 200'

0/, Cycloserin ......... 45,7 50,7 48 ' 9 56,8

orale tödliche Dosis LDO 4001 mg je kg >4000 mg je kg >4000 mg je kg 1000 mg je kg

LD50 710 ± 35 mg je kg - - 2250 ± 358 mg je kg

LD,00 ............... iooomgjekg 1 4000 mg je kg

Zur Bestimmung der Wirksamkeitseinheit des Cycloserins werden Agar-Penicillin-Testplatten benutzt, die mit M. pyogenes var. aureus PCI 209P oder ATCC 6538P beimpft worden sind (vgl. hierzu Teil 141 a der Food and Drug Administration's )Compilation of Regulations for Tests and Methods of Assay and Certification of Antibiotic and Antibiotic-containing Drugs<,). Genau abgemessene Mengen Cycloserin, in 111/,igem Phosphatpuffer, pH-Wert = 6,0, gelöst, werden auf eine Reihe von Agax-Penicillin-Testplatten aufgebracht, bei denen nach 16stündiger Bebrütung bei 37' die Durchmesser der mit den verschiedenen Cycloserinmengen erhaltenen Hemmzonen (auf 0,1 mm genau) festgestellt und mit der Wirkung der Standard-Penicillinmenge verglichen werden.

Oder aber die Bestimmung der Wirksamkeitseinheit erfolgt mit Hilfe eines Farbreagenzes (Natriumnitritpentacyanferrat, NaFe [CNJ" [N 0,#) und einerEichkurve, mit einem Beckman-Spektralphotometer Modell DU.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Beispiel 1 10 g Silbersalz des Cycloserins mit einer Wirkungsmenge von 2,45 Einheiten je mg wurden in 100 cm3 Wasser aufgeschlämmt und mit 2,64g wasserfreiem Calciumchlorid versetzt. Zu dieser Aufschlämmung wurden unter Rühren 20/, Aktivkohle gegeben, und sodann wurde das Silberchlorid-Aktivkohle-Gemisch abfiltriert. Die klare Lösung wurde im Vakuum der Gefriertrocknung unterworfen. Hierbei wurden 4,6 g Calciumsalz des Cycloserins mit 2,3 Einheiten je mg mit einem Gehalt von 17,310/, Calcium und 15,9 0/, Feuchtigkeit erhalten.

500 mg Calciumsalz des Cycloserins wurden in 5 cm3 Wasser gelöst und die Lösung 456 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. In regelmäßigen Abständen wurden Proben zur Prüfung der Cycloserinwirksamkeit entnommen. Die folgende Tabelle gibt die Ergebnisse der Beständigkeitsprüfung des Calciumsalzes des Cycloserins in wäßriger Lösung bei Raumtemperatur wieder.

Tabelle 1

Calciumsalz des Cycloserins

Stunden 0 Stunden 4 Stunden 27 Stunden 99 Stuln2de 3 n St unde 147 n St unden 171 Stunden 348 Stunden 456

Einheiten je cm3 ............. 225 216 231 230 228 228 250 230 222

Zum Vergleich wurden 40 mg freies amorphes Cycloserin in 1 cm3 Wasser gelöst und 216 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben zur Wirksamkeitsprüfung entnommen. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Beständigkeitsprüfung.

Tabelle 2

Freies amorphes Cycloserin

24 48 72 144 168 216

Stunden Stunden Stunden Stunden Stunden Stunden Stunden

Einheiten je cra3 ........... 205 110 75 55 39 39 29

In ähnlicher Weise wurden 120 mg freies kristallisiertes Cycloserin in 1 cm3 Wasser gelöst und 36 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben zur Wirksamkeitsprüfung ent- i nommen. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Beständigkeitsprüfung.

Tabelle 3

Freies kristallisiertes Cycloserin

0 1,5 24 36

Stunden Stunden tunden Stunden

Einheiten je cm3 590 1 400 116 71

Den Tabellen kann man entnehmen, daß das Calciumsalz des Cycloseri-ns innerhalb einer Zeitspanne, in der das amorphe und das kristalline Cycloserin praktisch ihre gesamte antibiotische Wirksamkeit verlieren, beständig bleibt.

Beispiel 2 zu 50 cm3 Wasser, das 7,75 g Bariumhydroxyd Ba (0 H), - 8 H, 0 enthielt, wurden 5 g Cycloserin in der freien Form gegeben. Die Mischung wurde 20 Minuten gerührt und sodann filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 7,35 g Bariumsalz des Cycloserins mit 2,9 Einheiten je mg und einem Gehalt von 39,27 "/, Barium erhalten wurden. Eine Lösung von 100 mg Bariumsalz des Cycloserins in 1 cm3 Wasser wurde 288 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben zur Wirksamkeitsprüfung entnommen. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Beständigkeitsprüfung.

Tabelle 4

Bariumsalz des Cycloserins

0 1 24 144 192 288

Stunden Stunden Stunden Stunden Stunden

Einheiten 300 310

300 280

292

je cm3 ....

Beispiel 3 5 g Cycloserin in der freien Form wurden zu 50 cm3 Wasser, das 6,47 g Strontiumhydroxyd Sr (OH) 2 - 8 H, 0 enthielt, gegeben. Die Mischung wurde 20 Minuten gerührt und sodann filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 6,5 g Strontiumsalz des Cycloserins mit 3,4 Einheiten je mg und einem Gehalt von 31,91 "/, Strontium erhalten wurden.
Eine Lösung von 100 mg Strontiumsalz des Cycloserins in 1 cm.3 Wasser wurde 288 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben zur Wirksamkeitsprüfung entnommen. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Beständigkeitsprüfung.

Tabelle 5

Strontiumsalz des Cycloserins

0 24 144

St192 1 288

Stunden Stunden Stunden unden Stunden

Einheiten

je cm3 .... 345 350 336

336 322

Beispiel 4 10 g Silbersalz des Cycloserins, in 50 cm.3 Wasser aufgeschlämmt, wurden mit 4,84g Magnesiumchlorid, Mg C12 - 6 H, 0, und 2 "/, Aktivkohle versetzt. Dann wurde die Mischung gerührt und filtriert. Die klare Lösung wurde im Vakuum der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 4,65 g Magnesiumsalz des Cycloserins mit 3,8 Einheiten je mg und einem Gehalt von 9,430/, Magnesium erhalten wurden.
Eine Lösung von 100 mg Magnesiumsalz des Cycloserins in 1 cm.3 Wasser wurde 168 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben zur Wirksamkeitsprüfung entnommen. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Beständigkeitsprüfung.

Tabelle 6

Magnesiumsalz des Cycloserins

0 24 48 120 144 168

Stunden Stunden Stunden Stunden Stunden Stunden

Einheiten je cm3 ................ 380 310 262 246 260 262

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung der Erdalkalisalze des Antibioticums Cycloserin, dadurch gekennzeichnet, daß man entweder Cycloserin in wäßriger Lösung mit einer Erdalkalibase umsetzt oder daß man eine wäßrige Aufschlämmung des Silbercycloserins mit einem wasserlöslichen Erdalkalisalz versetzt, dessen Anion mit dem Silberion des Silbercycloserins ein wasserunlösliches Silbersalz bildet, dieses von der Lösung abtrennt und die Cycloserinsalzlösung im Vakuum gefriertrocknet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit Calcium-, Magnesium-, Barium- oder Strontiumchlorid durchführt.