DE10065815A1

DE10065815A1 - Verfahren zur flexiblen Herstellung von Oligomer-Arrays

Info

Publication number: DE10065815A1
Application number: DE10065815A
Authority: DE
Inventors: Kurt Berlin
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2002-07-11

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung von Anordnungen mehrerer Oligonukleotide auf einer Festphase wie beispielsweise Oligonukleotidarrays. Im ersten Schritt wird ein Monomer in einem Lösungsmittel auf die Oberfläche aufgebracht, wobei es unter Bindung an die immobilisierten Oligomere reagiert, die an ihrem Ende keine Schutzgruppe aufweisen. Im zweiten Schritt wird eine an dem Monomer befindliche säurelabile Schutzgruppe durch das Aufbringen eines nichtflüchtigen, säurehaltigen Reagenzes auf die Festphase in Form eines oder mehrerer Tropfen an den Stellen abgespalten, an denen im nächsten Schritt eine Reaktion mit einem weiteren Monomer erfolgen soll. Im dritten Schritt wird auf die gleiche Stelle an der Oberfläche, an der sich das säurehaltige Reagenz befindet, ein Puffer aufgebracht, um die Säure zu neutralisieren und die Reagenzien und Puffer in einem Waschschritt entfernt. Die Schritte werden wiederholt, bis Oligonukleotide der gewünschten Sequenz und Länge entstanden sind.

Description

Oligomer-Arrays (DNA-Chips) werden heute vielfach zur Analyse von Polymorphismen in Nukleinsäureproben eingesetzt, beispielsweise zur Analyse von Expressionsmustern in bestimmten Zellen oder Geweben. Sie werden auch zur Diagnose von Erbkrankheiten sowie zur Teilsequenzierung und zum Auffinden von Polymorphismen weiter entwickelt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur hochflexiblen und kostengünstigen Herstellung relativ kleiner Stückzahlen unterschiedlicher Oligomer-Arrays aus Monomeren, ohne dabei vorgefertigte Oligomer-Bausteine zu verwenden.

DNA-Chips sind kleinste, meist planare Oberflächen, auf welchen räumlich geordnet eine große Anzahl verschiedener Oligomere (kurze, einsträngige DNA-Moleküle) angebracht sind. Solche Chips werden beispielsweise zur parallelen Erkennung zahlreicher DNA-Sequenzen in einer präparierten Gewebeprobe verwendet. Dazu benetzt man die Chipoberfläche mit einer Lösung von DNA-Fragmenten aus der Gewebeprobe, worauf sich komplementär passende DNA-Stücke aus der Lösung an die entsprechenden, an die Chipoberfäche angebrachten Oligomere anlagern (Hybridisierung). Danach bestimmt man mit einer geeigneten Methode wie z. B. Fluoreszenzmarkierung, an welchen Stellen auf dem Chip eine Hybridisierung stattgefunden hat. Wenn man weiss, wo auf dem Chip welche Oligomere angebracht sind, kann man somit Rückschlüsse auf DNA-Sequenzen in der Gewebeprobe ziehen. Dazu definiert man in der Regel auf der Chip-Trägerfläche ein dichtes rechtwinkliges Raster. Auf jedem Rasterpunkt ist in Form eines kleinen Flecks (Spot) genau eine Sorte von Oligomer angebracht. Die maximal mögliche Anzahl von verschiedenen DNA-Sequenzen auf dem Chip ist demzufolge normalerweise gleich der Anzahl der Rasterpunkte. Da man möglichst viele Sorten von Oligomeren auf einen Chip aufbringen will, die Chips aber gleichzeitig so klein wie möglich sein sollten, um effektiv hybridisiert werden zu können, ist es ein wichtiges Ziel bei der Herstellung von DNA-Chips, eine möglichst hohe Rasterdichte zu erreichen.

Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur DNA-Chip Herstellung bekannt:

1. Alle Oligomere werden auf herkömmliche Weise einzeln synthetisiert und danach an den vorgesehenen Rasterpunkten auf den Träger aufpipettiert, typischerweise von einer automatischen Micropipettieranlage. Diese Methode ist sehr aufwendig und teuer, da jedes Oligomer einzeln hergestellt bzw. gekauft und von Hand der Pipettieranlage zugeführt werden muss. Die Rasterdichte ist durch die hohe Winkelungenauigkeit der heute verfügbaren, typischerweise piezoelektrischen Mikropipetten stark limitiert.
2. Die Oligomere werden mit Hilfe einer automatischen Mikrodosieranlage direkt auf dem Chip synthetisiert. Auf jedem Rasterpunkt wird die dort vorgesehene Oligomerkette Baustein für Baustein (Nukleobasen) aufgebaut. Das chemische Verfahren ist grundsätzlich das gleiche wie bei der herkömmlichen Oligomer-Synthese im Reagenzglas. Der Unterschied ist, dass alle Oligomere gleichzeitig, von einer einzigen automatischen Anlage direkt am jeweils vorgesehenen Bestimmungsort hergestellt werden. Die bei Methode 1) separaten Arbeitsschritte Oligomer-Synthese und Micropipettierung werden somit zu einem einheitlichen Arbeitsschritt zusammengefasst. Diese "in situ" Synthese läuft normalerweise wie folgt ab: Auf einem vorpräparierten Substrat tropft der Dosierautomat auf jedem Rasterpunkt die dort vorgesehene erste Nukleobase auf. Dies ist mechanisch nicht sehr aufwendig, da es nur 4 verschiedene Nukleobasen (C, T, G, A) gibt. Man kann dafür z. B. 4 aneinandergekoppelte Micropipetten verwenden. Nach dem Auftragen des ersten Nukleosidbausteins auf jedem Rasterpunkt wird das Substrat gewaschen und nach einem optionalen "Capping Schritt" die Schutzgruppen an den 5'-OH Funktionen entfernt, um die Reaktion mit dem jeweils nachfolgenden Nukleosidbaustein zu ermöglichen. Danach wird an jedem Rasterpunkt die zweite Nukleobase aufpipettiert. Das Substrat wird dann wieder gewaschen und entschützt. Auf diese Weise baut man Schritt für Schritt auf jedem Rasterpunkt die jeweils erforderlichen Oligomerketten auf. Diese Methode ist nicht besonders schnell, da nacheinander auf jedem Rasterpunkt für jede Nukleobase neu pipettiert werden muss. Wie bei Methode 1) ist die Rasterdichte durch die Ungenauigkeit der Micropipetten beschränkt. Die Ungenauigkeit wirkt sich hier noch schlimmer aus, da jeder Rasterpunkt mehrmals nacheinander auf möglichst identische Weise getroffen werden muss.
3. Die Oligomere werden wie bei 2) direkt auf den Träger synthetisiert, die gezielte Anbindung der richtigen Nukleobasen an den richtigen Rasterpunkten geschieht jedoch durch eine vollkommen parallele, photolithographische Technik anstelle von sequenziellen, zielgenauen Pipettierschritten. Das Verfahren basiert darauf, dass man mit Licht einer bestimmten Wellenlänge gezielt 5'-OH Schutzgruppen von Oligonukleotiden entfernen kann. Durch geeignete örtliche Bestrahlungsmuster kann man somit Oligonukleotid-Enden an genau jenen Rasterpunkten reaktionsfähig machen, an denen man im nächsten Schritt ein neues Nukleosid anbringen will. Bei vollständiger Benetzung der Chipoberfläche mit einer Nukleotidbaustein-Lösung wird somit nur an den vorher belichteten Stellen ein Nukleotidbaustein angebunden, alle unbelichteten Stellen bleiben unverändert. Die örtlichen Belichtungsmuster werden erzeugt, indem man eine microphotographische schwarz-weiss Maske zwischen dem Substrat und der Lichtquelle positioniert, die alle Rasterstellen abdeckt, die nicht reaktionsfähig gemacht werden sollen. Die Verlängerung der Oligomer-Ketten auf allen Rasterpunkten um eine Nukleobase geschieht demnach wie folgt: Mit Hilfe einer ersten Maske werden genau jene Rasterpunkte belichtet, welche um die erste der 4 möglichen Sorten von Nukleobasen (z. B. C) erweitert werden müssen. Danach wird der Chip mit einer Lösung des entsprechenden Nukleotidbausteins benetzt, worauf nur die belichteten Punkte um diese Base verlängert werden. Da die neu angebundenen Basen noch alle über eine Schutzgruppe verfügen, werden sie in den folgenden Schritten nicht weiter reagieren, bis ihre Schutzgruppen durch eine weitere Belichtung abgespaltet werden. Nach diesem Reaktionsschritt wird der Chip gewaschen. Nun werden mit Hilfe einer zweiten Maske genau jene Rasterstellen belichtet, welche um die zweite der 4 möglichen Sorten von Nukleobasen (z. B. T) erweitert werden müssen. Darauf wird der Chip wiederum mit einer Lösung des entsprechenden Nukleotidbausteins benetzt und die belichteten Stellen dadurch um diese Base verlängert. Genauso verfährt man für die verbleibenden zwei Basen (z. B. G und A). Für die Verlängerung aller Oligomere um eine Nukleobase benötigt man demzufolge vier Belichtungsschritte bzw. 4 Photomasken. Diese Methode ist wegen der hohen Parallelität sehr effizient, zudem ist sie wegen der hohen Präzision, die mit Photolithographie erreicht werden kann, geeignet, um sehr hohe Rasterdichten zu erzielen. Allerdings ist die Methode sehr aufwendig und somit teuer, da man für die Herstellung einer bestimmten Sorte von Chip zuerst eine grosse Anzahl von Photomasken erzeugen muss. Bei hohen Rasterdichten werden zudem hohe Anforderungen an die Positionierungsgenauigkeit der Masken während der Belichtung gestellt, die effizient nur durch Verwendung von teuren Apparaturen erfüllt werden können.
4. Man synthetisiert die Chips wie bei 3) nach dem photolithographischen Verfahren, belichtet hier aber die einzelnen Rasterpunkte mit Hilfe von Reflexion an kleinen Spiegeln. Dafür wird ein spezieller Typ von Siliziumchip verwendet, der kommerziell für die Verwendung in Videoprojektoren hergestellt wird. Es handelt sich bei diesem Chip um eine kleine (einige Quadratcentimeter große) Siliziumoberfläche, auf dem in einem rechtwinklige Raster eine große Zahl (z. B. 800 × 600) mikroskopisch kleiner, rechteckiger (z. B. 16 µm x 16 µm) Aluminiumspiegel angebracht sind. Jeder der Spiegel ist bezüglich seiner Diagonalachse beweglich gelagert und kann in zwei stabile Positionen A und B gekippt werden, die sich um einige Winkelgrade unterscheiden. Welcher der Spiegel sich in welcher der beiden Positionen befindet, kann durch elektronische Signale an den Chipeingängen beliebig eingestellt werden. So ein Mikrospiegel-Chip ("micromirror device") wird zusammen mit einer Lichtquelle, einer Optik und der zu belichtenden Array-Oberfläche so angeordnet, dass jeder der Spiegel das reflektierte Licht in der Position A auf das Array wirft und in der Position B auf eine lichtschluckende Fläche neben dem Array. Dabei gehört zu jeder Rasterposition auf dem zu belichtenden Array genau ein Spiegel, welcher Licht genau auf diese Rasterposition reflektiert, falls er sich in Position A befindet.

Diese Methoden nach dem Stand der Technik weisen eine Reihe von Nachteilen auf. Die attraktivste Methoden, um günstig und flexibel DNA-Arrays hoher Rasterdichte herzustellen, ist die Methode mit dem Mikrospiegel-Chip. Jedoch ist es bei all diesen photolithographischen Methoden erforderlich, spezielle photolabile Synthesebausteine zu verwenden, die nicht kommerziell erhältlich sind. Zudem dauern die Synthesen, unabhängig von der Dichte, relativ lange, da für die Bausteine bestimmte Belichtungszeiten erforderlich sind.

Für hochflexible Chips mit geringerer Dichte besteht demnach Bedarf für eine Methodik, mit der beliebige Chips mit den unterschiedlichsten Anordnungen von Sequenzen ausgehend von einem einzigen Satz von Chemikalien herzustellen sind.

Aufgabenstellung

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, das die Nachteile des Standes der Technik überwindet. Es soll zur hochflexiblen und kostengünstigen Herstellung relativ kleiner Stückzahlen unterschiedlicher Oligomer-Arrays aus Monomeren dienen, ohne dabei vorgefertigte Oligomer-Bausteine zu verwenden und sich besonders für die Synthese von Oligonukleotidarrays eignen.

Beschreibung

Die Aufgabe soll durch ein Verfahren gelöst werden, welches zur Herstellung von Anordnungen mehrerer Oligonukleotide auf einer Festphase wie beispielsweise Oligomerarrays dient, wobei die Oligonukleotide direkt auf der Festphase synthetisiert werden. Das Verfahren erlaubt die parallele Herstellung unterschiedlicher Sequenzen auf der Festphase, ohne dass dabei spezielle Synthesebausteine verwendet werden müssen, es können vielmehr die gleichen z. B. mit Dimethoxytritylschutzgruppen geschützten Phosphoramidite zum Einsatz kommen, wie sie auch in grossen Mengen zur kommerziellen Synthese einzelner Oligonukleotide verwendet werden.

Das Verfahren besteht aus den folgenden Teilschitten:

1. Zuerst wird ein Monomer in einem Lösungsmittel auf die Oberfläche aufgebracht, wobei es unter Bindung an ungeschützte Funktionalitäten der Oberfläche oder zuvor an diese gebundene Oligomere reagiert, die an ihrem Ende keine Schutzgruppe aufweisen. Dieser Schritt wird bevorzugt in einer Kammer ausgeführt, deren eine Seite von der Oberfläche gebildet wird. Eine derartige Kammer ist in Fig. 1 skizziert. Die Oberfläche wird dabei zunächst bevorzugt mit einem getrockneten Gas wie beispielsweise Argon getrocknet, bevor das Monomer in einem Lösungsmittel wie beipielsweise Acetonitril zusammen mit einem Aktivator, z. B. Tetrazol, in die Kammer gebracht wird. Wird die Oberfläche erstmalig mit dem Monomer kontaktiert, so bindet dieses an alle nicht geschützten Funktionalitäten auf der Oberfläche. Es ist bevorzugt, dass die Oberfläche derartige Funktionalitäten (wie Amino- oder Hydoxylgruppen) nur an den Stellen aufweist, an denen eine Synthese von Oligonukleotiden erfolgen soll. Dies kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass man die folgenden Schritte mit der Oberfläche zuvor ausführt. Bevorzugt werden jedoch vorher Linkermoleküle an den Stellen die Oberfläche gebunden, an denen nachfolgend eine Synthese erfolgen soll. Die restliche Oberfläche wird dagegen mit einer Schutzgruppe versehen (beipielsweise acetyliert), um den Hintergrund bei Hybridisierungsreaktionen mit dem synthetisierten Array zu vermindern.
Wurden jedoch bereits zuvor Monomere mit der Oberfläche kontaktiert, so reagiert das Monomer im wesentlichen nur an die bereits gebundenen Monomere oder Oligomere, welche an ihrem Ende keine Schutzgruppe aufweisen. Da die bevorzugte Richtung der Oligonukleotidsynthese 3' nach 5' ist, handelt es sich bei dem Ende in der Regel um das 5'-Ende eines noch an den Basen und am Rückgrat entsprechend geschützten Monomers oder Oligomers. Nach der Bindung des Monomers wird überschüssiges Reagenz und Aktivator durch Waschschritte entfernt, die Oberfläche getrocknet und die Kammer geöffnet.
2. Im nächsten Schritt wird die an dem Monomer befindliche säurelabile Schutzgruppe wird durch das Aufbingen eines nichtflüchtigen, säurehaltigen Reagenzes auf die Festphase in Form eines oder mehrerer Tropfen an den Stellen abgespalten, an denen im nächsten Schritt eine Reaktion mit einem weiteren Monomer erfolgen soll. Wird beispielsweise in einem Schritt ein Thymidinderivat als Monomer eingesetzt, werden an dieser Stelle nur diejenigen Positionen auf dem Array durch die Säurebehandlung entschützt an denen im nächsten Schritt 1) ein Thymidin gebunden werden soll. Analog werden im folgenden Schritt beispielsweise nur diejenigen Positionen entschützt, an denen ein Cytosinderivat als Monomer gebunden werden soll. Durch das gezielte Aufbringen der Säure an bestimmte Positionen des Arrays ist es daher möglich, unterschiedliche Sequenzen zu erhalten, obgleich immer die gesamte Oberfläche mit der Monomerlösung kontaktiert wird (Fig. 2).
Bei dem säurehaltigen Reagenz handelt es sich bevorzugt um eine Lösung eines halogensubstituierten Benzoesäure- oder Essigsäurederivates, beispielsweise Trichlorbenzoesäure. Die Säure wird in Form eines Tropfens aufgebracht. Dafür sind unterschiedlichste Methoden geeignet, bevorzugt werden dafür jedoch Nadeln oder piezogesteuerte Elemente verwendet, wie sie auch sonst für die Herstellung von Oligomerarrays kommerziell erhältlich sind (z. B. in Robotern von Canberra Packard). Es wird davon ausgegangen, dass dem Fachmann weitere Möglichkeiten geläufig sind, Tropfen präzise auf einer Oberfläche zu positionieren. Der Tropfen wirkt auf die Schutzgruppe (beipielsweise Dimethoxytrityl) so lange ein, bis von einer vollständigen Entschützung ausgegangen werden kann. Je nach Säure und Schutzgruppe sind dafür 30 s bis einige Minuten erforderlich.
3. Im nächsten Schritt muss die Säure neutralisiert werden, da es sonst zu einer ungewollten Entschützung benachbarter Positionen kommen kann. Bevorzugt wird daher auf den Säuretropfen ein Puffertropfen aufgebracht, der die Säure neutralisiert. Dies kann mit der gleichen Instrumentierung erfolgen, die auch für das Aufbringen des Säuretropfens verwendet wurde. Dies ist besonders angesichts möglicher Positionierungsprobleme bei Oligomerarrays mit hohen Dichten vorteilhaft. Bei dem Puffer handelt es sich bevorzugt um Trialkylammoniumacetat oder -carbonatpuffer, jedoch kann davon ausgegangen werden, dass sich auch andere Puffer gleichermaßen eignen würden.
4. Im vierten Schritt werden Puffer und andere Reagenzien in einem Waschschritt entfernt, wofür bevorzugt die Kammer wieder geschlossen wird. Bei Arrays niedriger Dichte ist es auch möglich, den dritten Schritt wegzulassen und direkt mit dem Puffer zu waschen, allerdings muss sorgsam darauf geachtet werden, dass keine Feuchtigkeit in der Kammer verbleibt. In jedem Fall ist es bevorzugt, vor dem nächsten Schritt 1) mehrmals mit Schutzgas zu trocknen und mit einem trockenen Lösungsmittel zu waschen.

Die Schritte 1 bis 4 werden wiederholt, bis Oligonukleotide der gewünschten Sequenz und Länge auf der Oberfläche entstanden sind.

Bei den verwendeten Monomeren handelt es sich bevorzugt um Phosphoramidite oder Phosphonate, wie sie auch üblicherweise in der Oligonukleotidsynthese verwendet werden. Die Phosphoramidite sind dabei an der 5'-Position bevorzugt mit einer Dimethoxytrityl-, Monomethoxytrityl- oder einer anderen substituierten Tritylschutzgruppe verknüpft.

Besonders bevorzugt kommen bei dem Verfahren mehrere Nadeln oder andere Dosiersysteme gleichzeitig beim Aufbringen des säurehaltigen Reagenzes und/oder des Puffers zum Einsatz, wodurch die zeitliche Effizienz bedeutend gesteigert wird, auch wenn prinzipiell mit nur einer Nadel oder Dosiersystem gearbeitet werden könnte.

Besonders bevorzugt wird für das Verfahren ein Gerät verwendet, bei welchem die Nadeln nicht relativ zueinander bewegt werden können und mindestens 4, bevorzugt jedoch mindestens 16 Nadeln gleichzeitig verwendet werden. Bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem 16 Nadeln zum Einsatz kommen, die mindestens in jeweils 4 Reihen und Spalten angeordnet sind, die zueinander rechtwinklig sind.

Bevorzugt werden zur Kontaktierung der Nadeln mit säurehaltigem Reagenz Behälter für dieses Reagenz derart bereitgestellt, dass eine beliebige Kombination von Nadeln benetzt wird, während die anderen Nadeln entweder mit einem anderen Reagenz kontaktiert werden oder aber mit keinem Reagenz kontaktiert werden. Besonders bevorzugt sind diese Behälter in zueinander verschiebbaren Reihen angeordnet.

Besonders bevorzugt werden Paare von Oligomersequenzen synthetisiert, die sich in ihrer Sequenz nur dadurch unterscheiden, dass sich jeweils ein Oligomer ein CG Dinukleotid umfasst, während das jeweils andere ein TG Dinukleotid umfasst. Weiterhin ist es besonders bevorzugt, dass Paare von Oligomersequenzen synthetisiert werden, die sich in ihrer Sequenz nur dadurch unterscheiden, dass sich jeweils ein Oligomer ein CG Dinukleotid umfasst, während das jeweils andere ein CA Dinukleotid umfasst.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des Verfahrens zur Herstellung von Oligomer-Arrays zur Analyse von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben. Dazu eignen sich die oben aufgeführten Paare von Oligonukleotiden besonders gut, da eine Proben DNA nach Behandlung mit Bisulfit (siehe Stand der Technik) je nach ursprünglichem Methylierungsstatus entweder mit dem einen oder dem anderen Oligonukleotid eines Paares bevorzugt hybridisiert.

Legende zu Fig. 1

1. Kammerdeckel
2. Syntheseort
3. Mechanik zur Bewegung des Kammerdeckels
4. Dichtung
5. Ein- und Auslass
6. Anschlüsse für Flüssigkeiten oder Gase

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Anordnungen mehrerer Oligonukleotide auf einer Festphase, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Schritte ausgeführt werden:

a) ein Monomer wird in einem Lösungsmittel auf die Oberfläche aufgebracht, wobei es unter Bindung an ungeschützte Funktionalitäten der Oberfläche oder zuvor an diese gebundene Oligomere reagiert, die an ihrem Ende keine Schutzgruppe aufweisen,
b) die an dem Monomer befindliche säurelabile Schutzgruppe wird durch das Aufbingen eines nichtflüchtigen, säurehaltigen Reagenzes auf die Festphase in Form eines oder mehrerer Tropfen an den Stellen abgespalten, an denen im nächsten Schritt eine Reaktion mit einem weiteren Monomer erfolgen soll,
c) nachfolgend wird auf die gleiche Stelle an der Oberfläche, an der sich das säurehaltige Reagenz befindet, ein Puffer aufgebracht, um die Säure zu neutralisieren,
d) das säurehaltige Reagenz wird in einem Waschschritt entfernt,

die Schritte werden wiederholt, bis Oligonukleotide der gewünschten Sequenz und Länge entstanden sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Monomeren um Phosphoramidite oder Phosphonate handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den säurelabilen Schutzgruppen um Dimethoxytrityl-, Monomethoxytrityl- oder andere substituierte Tritylschutzgruppen handelt.

4. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem säurehaltigen Reagenz um eine Lösung eines halogensubstituierten Benzoesäure- oder Essigsäurederivates handelt.

5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Puffer um einen Trialkylammoniumacetat oder -carbonatpuffer handelt.

6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säurehaltige Reagenz und/oder der Puffer mittels einer Nadel auf die Oberfläche aufgebracht wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das säurehaltige Reagenz und/oder der Puffer mittels eines piezogesteuerten Dosiersystems auf die Oberfläche aufgebracht wird.

8. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer, nachdem der Tropfen des säurehaltigen Reagenzes an einer bestimmten Position auf der Oberfläche eingewirkt hat, in Form eines Tropfens mit dem Tropfen des säurehaltigen Reagenzes vereinigt wird.

9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Nadeln oder andere Dosiersysteme gleichzeitig beim Aufbringen des säurehaltigen Reagenzes und/oder des Puffers zum Einsatz kommen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nadeln nicht relativ zueinander bewegt werden können und mindestens 4, bevorzugt jedoch mindestens 16 Nadeln gleichzeitig verwendet werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass 16 Nadeln mindestens in jeweils 4 Reihen und Spalten angeordnet sind, die zueinander rechtwinklig sind.

12. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Kontaktierung der Nadeln mit säurehaltigem Reagenz Behälter für dieses Reagenz derart bereitgestellt werden, dass eine beliebige Kombination von Nadeln benetzt wird, während die anderen Nadeln entweder mit einem anderen Reagenz kontaktiert werden oder aber mit keinem Reagenz kontaktiert werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass diese Behälter in zueinander verschiebbaren Reihen angeordnet sind.

14. Verfahren nach einem der voranstehenden Anspüche, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils Paare von Oligomersequenzen synthetisiert werden, die sich in ihrer Sequenz nur dadurch unterscheiden, dass sich jeweils ein Oligomer ein CG Dinukleotid umfasst, während das jeweils andere ein TG Dinukleotid umfasst.

15. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils Paare von Oligomersequenzen synthetisiert werden, die sich in ihrer Sequenz nur dadurch unterscheiden, dass jeweils ein Oligomer ein CG Dinukleotid umfasst, während das jeweils andere ein CA Dinukleotid umfasst.

16. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Herstellung von Oligomer-Arrays zur Analyse von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben.