DE10024717A1

DE10024717A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Oligomeren und Arrays von Oligomeren sowie die Verwendung der Vorrichtung

Info

Publication number: DE10024717A1
Application number: DE10024717A
Authority: DE
Inventors: Mario Adamschik; Cornelia Egger; Michael Hinz; Eberhard P Hofer; Eberhard Kohn; Claus Maier; Hartmut Seliger
Original assignee: Merckle GmbH
Current assignee: Merckle GmbH
Priority date: 1999-11-10
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2001-06-07

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung von Oligomeren und Arrays von Oligomeren, wobei das Syntheseverfahren durch einen zusätzlichen Neutralisationsschritt erweitert wird. Dadurch wird eine verschleppungsfreie Abspaltung der Schutzgruppen ermöglicht, die eine Entschützung der Oligomere auf exakt definierten Positionen des Trägermaterials erlaubt. Für dieses Verfahren wird eine neuartige mikroelektromechanische Vorrichtung eingesetzt, die durch die Integration von Reaktionskammern (13) und mehreren Flüssigkeitsdosierelementen (1, 4, 5, 7, 8) in einem Chip eine genaue Adressierung auf einem Trägermaterial in Form eines ein- oder mehrdimensionalen Arrays erlaubt. Die erfindungsgemäße Lösung soll dabei eine Möglichkeit schaffen, Oligomere oder Arrays von Oligomeren zu schaffen, die zum einen auf kleinsten Raum exakt positioniert sind und gleichzeitig durch den Neutralisationsschritt und der damit verhinderten Verteilung des Entschützungsagens auf nicht zu entschützende Positionen eine minimale Fehlerquote bei der Erzeugung der Sequenzen der Oligomere aufweist. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung soll zusätzlich die Möglichkeit geschaffen werden, mit geringem Aufwand in kurzer Zeit die Herstellung von Oligomeren und deren Arrays zu realisieren.

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Oligome ren, die durch schrittweise Kopplung von Monomerein heiten an einem festen Trägermaterial synthetisiert werden. Dabei ist der intermediäre Schutz der Mono merbausteine durch eine oder mehrere geeignete Schutzgruppen notwendig, die bei der Kopplung des Mo nomerbausteins auf das wachsende Kettenende übertra gen werden und von denen somit eine vor dem nächsten Kopplungsschritt abgespalten werden muss, um ein re aktives (verlängerbares) Kettenende zu erzeugen. Die wachsende Kette ist dabei am Trägermaterial immobili siert.

Üblicherweise wird das dabei verwendete Reagenz zur Abspaltung einfach vom Träger gewaschen, z. B. mit Acetonitril, jedoch konnten wir feststellen, dass ein zusätzlicher Schritt zur Neutralisation dieses Rea genzes, die Anwendung der beschriebenen Syntheseme thode in manchen Fällen erleichtert oder in anderen Fällen Überhaupt erst möglich macht.

Ein Beispiel für das beschriebene Syntheseprinzip ist die Erzeugung von Oligonukleotiden nach der Methode mit Phosphorigsäure-esteramid (Amidit-Methode) oder auch der H-Phosphonat-Methode an fester Phase. Die Amidit-Methode läuft nach dem in Fig. 1 dargestellten Schema ab, bei der H-Phosphonat-Methode fehlt der Oxidationsschritt, der für alle H-Phosphonat- Einheiten am Ende der Synthese gemeinsam durchgeführt wird.

Jeder Synthesezyklus beginnt mit der Abspaltung einer Dimethoxytrityl- (bei manchen Monomeren einer Monome thoxytrityl-) Schutzgruppe ("Detritylierung"), ge folgt von der Kopplung des nächsten Monomers, einem "Cap-Schritt" zur Eliminierung nichtverlängerter Ket ten und schließlich der Oxidation des Phosphors. Die ser Synthesezyklus ist weitgehend optimiert und wird auf entsprechenden Automaten routinemäßig mit Kopp lungsausbeuten von über 99% pro Kopplung ausgeführt.

Dennoch ist es möglich, durch die Einführung eines einfachen zusätzlichen Schrittes in den Synthesezy klus neue Anwendungsgebiete, z. B. für die Herstellung von Oligoribonukleotiden, zu erschließen, für die der Standardzyklus sonst entweder nur mit beträchtlichem technischen Aufwand oder gar nicht einsetzbar wäre:

Die zur Abspaltung der Schutzgruppe durchgeführte De tritylierung erfolgt meist durch eine organische Säu re in einem organischen Lösungsmittel, z. B. 2% Trichloressigsäure in Dichlorethan. Nach einer gewis sen Zeit, z. B. 1-2 Minuten, wird die Säure durch Waschen entfernt, wobei oft relativ lange Waschzeiten notwendig sind, um die Säure vollständig, auch die an das Trägermaterial adsorbierte Säure, und sicher zu entfernen. Nachteilig ist das besonders im Hinblick darauf, dass diese Säure zu Depurinierungen, abhängig von der Einwirkzeit, führen kann. Ein Neutralisati onsschritt dagegen beendet die Einwirkung der Säure jedoch sicher und zu einem genau definierten Zeit punkt. Hierfür bieten sich organische Basen, wie z. B. Collidin, an.

Es ist auch bereits die Herstellung von Arrays von Oligomeren bekannt. Hierzu zählen Arrays von Oligonu kleotiden, die oft auch als Oligonukleotid- oder DNA- Chips bezeichnet werden. Sie können zum einen dadurch hergestellt werden, dass zunächst die Oligonukleotide der gewünschten Sequenz hergestellt werden, die dann auf einem geeigneten Träger definiert abgelegt wer den, oder indem die Synthese direkt auf dem Trägerma terial durchgeführt wird. Da sich endlich mehrere Oligomere verschiedener Sequenz auf dem Träger befin den sollen, muss die direkte Synthese auf dem Träger material adressiert ablaufen, wobei entweder der gan ze Synthesezyklus adressiert wird, oder aber nur der Schritt der Entschützung. Gerade die letztere Methode ist besonders reizvoll, da alle übrigen Schritte des Zyklus parallel für alle Oligomere durchgeführt wer den können. Bekannt sind hierzu bisher zwei Ansätze, die aber beide erhebliche Nachteile aufweisen:

- die Verwendung von Schutzgruppen, die durch Licht abgespalten werden können (US 5 424 186)
Nachteil dabei ist, dass vom optimierten Synthesezyklus abgewichen werden muss, dabei sinken die er reichbaren Kopplungsausbeuten spürbar, was diese Me thode limitiert.
- die Verwendung von Masken, die definierte Bereiche der Synthesefläche abdecken (DE 197 06 570), oder, damit nahe verwandt, das Aufbringen der Säure durch einen Druckkopf an definierten Positionen der Synthe sefläche (US 5 847 105).

Nachteil letzterer Methode ist, dass die Gefahr be steht, dass die aufgebrachte Säure verschleppt wird, also, besonders beim Abwaschen der Säure, auf Berei che gelangt, in denen keine Synthese stattfinden soll. Aus US 5 847 105 ist der Versuch bekannt, die ses Problem zu umgehen, indem Zinkbromid statt einer Säure verwendet wird. Allerdings wird die Detritylie rung dann so langsam, dass auch beim Waschen eine ge wisse Chance besteht, dass Bereiche, die nicht detri tyliert werden sollen, tatsächlich weitgehend unbe einflusst bleiben. Die Synthese wird dadurch sehr zeitaufwendig, die Detritylierung mit Zinkbromid ist im Vergleich zu einer Detritylierung mit Säure (z. B. Trichloressigsäure in Dichlormethan) um wenigstens den Faktor 10 langsamer.

In DE 197 06 570 wird das Problem der Verschleppung durch die Verwendung von Masken reduziert, die auf das Synthesesubstrat (den Träger) gelegt werden und nur die Bereiche freigeben, die zu bearbeiten sind. Bei der Detritylierung kann die Säure (oder jedes an dere Agens) abgewaschen werden, ohne dass die Gefahr einer Verschleppung besteht, da ja die nicht zu ent schützenden Bereiche noch immer durch die Maske ge schützt bleiben können. Allerdings wird die Methode eben durch die Maskentechnik auch sehr unflexibel.

Soll in einem so zu erzeugenden Array eine oder meh rere Sequenzen geändert werden, so macht das die Her stellung neuer Masken notwendig, die diese Änderungen wiederspiegeln, wodurch der arbeitstechnische wie der zeitliche Aufwand dieses Verfahrens immens ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein verbessertes Verfahren mitsamt Vorrichtung für die Herstellung von Oligomeren und Arrays von Oligo meren herzustellen.

Zur Lösung dieser Aufgabenstellung wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem eine Verschleppung des Ent schützungsreagens verhindert wird und auf einfach zu handhabende Weise mit der erfindungsgemäßen Vorrich tung eine schnellere Herstellung von Oligomeren und Arrays von Oligomeren möglich ist.

Der Neutralisationsschritt, der in dem erfindungsge mäßen Verfahren durchgeführt wird, löst diese Proble me auf einfache und elegante Weise, indem nach der nötigen Einwirkzeit der Säure auf die behandelten Po sitionen eine Base zur Neutralisation aufgebracht wird. Die entstehenden Produkte führen weder zu einer unerwünschten Schutzgruppenabspaltung, noch beein trächtigen sie die weiteren Schritte des Reaktionszy klus. Die bekannten und optimierten Synthesemethoden können beibehalten werden, insbesondere sind keine neuen Monomerbausteine zu entwickeln.

Bei der hier gezeigten Methode wird eine Änderung der Hardware bei einer Änderung der herzustellenden Arrays unnötig, wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 34 eingesetzt wird. So erfolgt die adressierte Entschützung in einem Array von unabhängigen und gegeneinander abgeschlossenen Reaktionskammern. Diese Anordnung von Reakti onskammern spiegelt die Anordnung von Oligomeren auf dem Träger wieder, wobei die Reagenzien, die für die Abspaltung der Schutzgruppen und der Neutralisation verwendeten Reagenzien über ein Flüssigkeitsdo sierelement auf definierte Positionen des Trägermate rials aufgebracht wird. Da aber die Versorgung jeder Kammer mit dem Entschützungsagens individuell gesteu ert werden kann, kann dieses Array von Reaktionskam mern auch jede beliebige Sequenz von Oligomeren auf dem Träger erzeugen. Wie die Versorgung der einzelnen Kammern mit Reagenzien erfolgt, ist dabei ebenso we nig von Belang, wie die Art oder der Aggregatszustand des Entschützungsagens. Das Array von Reaktionskam mern kann auch als aktive Maske betrachtet werden.

Diese Methode macht aber nur dann Sinn, wenn das Ent schützungsagens neutralisiert wird, um damit eine Verschleppung zu vermeiden.

Die Herstellung der Arrays von Oligomeren wird mit einer neuartigen mikroelektromechanischen Vorrichtung mit integriertem Mikroreaktor und Flüssigkeitsdosier system durchgeführt, wobei das Flüssigkeitsdosierele ment als auch die Mikroreaktionskammer auf einem Chip integriert sind. Dabei werden über das Flüssigkeits dosierelement die für die Abspaltung der Schutzgrup pen und die Neutralisation eingesetzten Reagenzien in die Mikroreaktionskammer injiziert. Diese Flüssig keitsdosierelemente basieren auf dem "Ink-Jet"- Prinzip und dienen zum Ausstoß bzw. der Injizierung von verschiedenen Flüssigkeiten in eine integrierte Mikroreaktionskammer.

Bei diesem Prinzip wird mit Hilfe eines Heizelementes eine sehr kleine Menge der auszustoßenden Flüssigkeit (z. B. Tinte), die sich über dem Heizer befindet, in nerhalb sehr kurzer Zeit auf eine Temperatur, die zur spontanen Überhitzung notwendig ist, gebracht. Hier durch bildet sich eine Gasblase, deren Volumenexpan sion zur Ejection der verdrängten Flüssigkeitsmenge durch eine Düsenöffnung führt. Die heutzutage verwen deten "Bubble-Jet"-Systeme sind in der Regel aufgrund der Materialauswahl und vom Aufbau her auf den Druck betrieb mit Tinte ausgelegt. Daraus folgt im wesent lichen die Einschränkung auf nicht chemisch aggressi ve Flüssigkeiten. Auch sind diese Systeme nicht für Anwendungen, die biokompatible Materialien vorausset zen, geeignet. In spezifischen Anwendungen in der Me dizintechnik, der Biomedizintechnik, der Chemie oder auch dem Automobilbereich tritt somit das Problem auf, dass nur eine enge Auswahl an Flüssigkeiten ver wendet werden könnten. Auch fehlt für viele Anwendun gen wie z. B. die DNA-Sequenzierung oder Mischung von Flüssigkeiten ein geeigneter Bauelementaufbau, d. h. es fehlen integrierte Reaktionskammern, mikrofluidi sche Mischstrukturen usw.. Ferner können die Arrays aufgrund der hohen Oberflächenrauhigkeit der Düsen platte nicht auf ein eventuell externes Substrat flüssigkeitsdicht aufgesetzt werden.

Mikrodosiergeräte in Verbindung mit Reaktionskammern oder Substraten, auf denen eine chemische Reaktion stattfindet, werden heute hauptsächlich in der Che mie, Medizin und in der Biochemie zur parallelen, und damit schnelleren, chemischen Synthese oder Analyse, sowie zur Mischung, Dosierung, Ejection oder Injekti on verschiedenster Flüssigkeiten eingesetzt. Hierbei besteht das Gesamtsystem meistens aus einem Flüssig keitsdosiersystem, das durch konventionelle mechani sche Elemente bewegt und gesteuert wird, und einem Substrat oder Behälter, auf bzw. in dem die Reaktion stattfindet.

Beide Komponenten sind bei den vorbekannten Systemen nicht auf einem Chip integriert. Probleme, welche die meisten dieser Systeme aufbaubedingt kennzeichnen, sind die fehlende Möglichkeit der selektiv adressier baren Flüssigkeitszuführungen, eine maßgebliche Be grenzung der Integrationsdichte, keine Dosierung von Flüssigkeitsmengen im pl-Bereich und ein daraus re sultierender hoher Verbrauch an Reaktionsflüssigkei ten.

Das hier vorgestellte Konzept löst alle oben genann ten Probleme mittels der Integration von mehreren Flüssigkeitsdosierelementen zusammen mit einer Reak tionskammer, beide Elemente als Einheit auch Aktuator genannt, auf einem Mikroreaktionschip. Die zur Her stellung des Chips angewendete Technologie stammt aus der Mikroelektronik und ermöglicht kleinste Bauweisen und hohe Integrationsdichten.

Der Chip besteht im einzelnen aus den Komponenten Flüssigkeitsdosierelement, Reaktionskammer und den verwendeten Substraten.

Die Aktuatoren können dabei sowohl in einem ein- oder zweidimensionalen Array angeordnet sein.

In dem hier exemplarisch hergestellten Chip sind je weils 2 Aktuatoren über jeder Reaktionskammer ange ordnet, so dass zwei unterschiedliche Flüssigkeiten ausgestoßen werden können. Allerdings können auch mehr Flüssigkeitsdosierelemente pro Reaktionskammer eingesetzt werden.

Der Chip lässt die Dosierung kleinster Flüssigkeits mengen zu und jede Dosiereinheit ist selektiv adressierbar.

Die Flüssigkeitsdosierelemente beruhen auf einer Flüssigkeitszuführung, über die die Flüssigkeit durch ein Mikrofluidsystem in eine Düsenkammer gelangt, wo die Flüssigkeit überhitzt wird und bei der anschlie ßenden Gasblasenexpansion durch eine Düse in die Re aktionskammer ausgestoßen wird. Die integralen Be standteile der Flüssigkeitsdosierelemente, die Mikro heizelemente, über die die Überhitzung der Flüssig keit erfolgt, und die Düsenplatte, sind aus chemisch inerten CVD-Diamantschichten hergestellt. Allerdings kann die Düsenplatte ebenso aus anderen inerten Mate rialien, wie Polyimid, Fotolack, Kunststoff, einem Halbleiter, einem Metall oder einem Dielektrikum (SiN, SiO₂) gefertigt sein. Ebenso kann die Oberflä che des Heizelementes mit verschiedenen Materialien passiviert sein.

Die elektrische Kontaktierung der Heizelemente er folgt hier exemplarisch mittels einer hochtemperatur stabilen Multilayermetallisierung aus Si/W:Si:N/Ti/Au. Es ist aber ebenso möglich jegliches Metall, welches einen ohm'schen Kontakt zu dem Heize lement bildet, zu verwenden. Zusätzlich ist auch die Abdeckung des Metalls mit Hilfe einer Schutzschicht möglich.

Jede Reaktionskammer besitzt neben der Düsenzuführung einen zusätzlichen Kanal, der zum Druckausgleich oder der Zuführung verschiedener Flüssigkeiten oder Gase, z. B. Schutzgase, dient.

Das Mikrofluidsystem basiert auf einem aus Polyimid aufgebautem Verteilungssystem aus Kapillaren und Re servoirs, durch das die Flüssigkeiten in die Düsenkammer treten. Als Materialien kommen ebenso Fotolac ke (Positivrest, Negativrest), Polymere, Metalle, Dielektrika oder Halbleiter in Frage. Dabei kann sich das mikrofluidische System sowohl auf der Vorder- als auch auf der Rückseite des mechanischen Trägersub strates befinden.

Zu den weiteren integralen Bestandteilen des Chips gehören die verschiedenen Substrate. Hierzu zählen das mechanische Trägersubstrat, in das die Flüssig keitszuleitungen geätzt werden und auf dessen Vorder- oder Rückseite sich das mikrofluidische System befin det, das Reaktionskammersubstrat, das die Reaktions kammer umschließt und das Reaktionsproduktesubstrat, das die Reaktionskammer von unten abschließt. Die Substrate können durch nasschemische oder trockenche mische Ätzverfahren strukturiert werden.

Als Material für diese Substrate bzw. als Oberflä chenbeschichtung dieser Substrate kann Silicium, Quarz, Glas, Kunststoff, Diamant, SiC oder ein belie biges anderes Material verwendet werden. Ebenso kann ein Mehrschichtsystem aus diesen Materialien oder ei nem anderen Material verwendet werden, wobei die Sub strate nicht aus dem gleichen Material sein müssen. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, sowohl das Reaktionskammersubstrat als auch das Reaktionsproduk tesubstrat durch das zuvor beschriebene mikrofluidi sche System zu ersetzten.

Die chemische Reaktion findet auf dem Reaktionspro duktesubstrat statt, das in dem hier hergestellten Chip nicht mechanisch fest verbunden, sondern abnehm bar ist. Auf dem Reaktionsproduktesubstrat findet in der hier genutzten Applikation die Synthese der Oli gonukleotidketten statt. Die Oberfläche des Reaktionsproduktesubstrats ist chemisch funktionalisiert. Ebenso können die Düsenplatte und das Reaktionskam mersubstrat funktionalisiert sein. Die funktionali sierten Bereiche sind ferner strukturiert. Nach der Synthese kann das Reaktionsproduktesubstrat abgenom men werden und weiter genutzt werden.

Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass das Reaktionsproduktesubstrat auch transparent sein kann. Dies ermöglicht den Einsatz analytischer Geräte mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung, wie z. B. Mikroskopen, CCD-Kameras, Photodioden und Photo transistoren. Zusätzlich ist auch die direkte Inte grierung elektronischer Bauelemente wie Transistoren, Dioden, CCD's, Fotodioden, Fototransistoren, Wider ständen oder Elektroden zur Impedanzmessung oder für zyklische Voltammetrie möglich.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Figuren und bevorzugten Ausführungsbeispielen näher beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1: Synthesezyklus der Amidit-Methode mit Phosphorigsäure-esteramid;

Fig. 2: die Strukturierung einer erfindungsge mäßen mikroelektromechanischen Vor richtung;

Fig. 3: die Darstellung für die Gleichge wichtsreaktion der Detritylierung im sauren Medium;

Fig. 4: die Strukturierung des Synthesemoduls für die Kopplung, das Capping und die Oxidation und des Synthesemoduls für die adressierte Entschützung

In Fig. 1 ist das Schema des Synthesezyklus der Ami dit-Methode mit Phosphorigsäure-esteramid für die Herstellung von Oligonukleotiden dargestellt.

Der Zyklus beruht in Schritt I auf der Abspaltung ei ner Di- bzw. Monomethoxytrityl-Schutzgruppe. Dieser Schritt wird als Detritylierung bezeichnet. In Schritt II erfolgt die Kopplung des Monomers an der ungeschützten Position. Schritt III, genannt "Cap ping" sorgt für eine Elimination nichtverlängerter Ketten. Im abschließenden Schritt IV erfolgt schließ lich die Oxidation des Phosphors.

In Fig. 2 ist die Strukturierung der erfindungsgemä ßen mikroelektromechanischen Vorrichtung dargestellt.

Der hier vorgestellte Chip löst die oben genannten Probleme und stellt ein integriertes System, beste hend aus mehreren Flüssigkeitsdosierelemen ten(1), (4), (8), (7), (5), einem mikrofluidischen System (4) und einer Reaktionskammer (13), dar. Neben dem neuartigen Aufbau wurden auch neuartige Materialien wie CVD-Diamantschichten für die Mikroheizelemente (8), die Düsenplatte (5) und die Beschichtung des Re aktionskammersubstrats (6) und des Reaktionsproduk tesubstrats (9) benutzt. Die Diamantschicht für die Heizelemente (8) wurde in situ bordotiert und troc kenchemisch (Ar/O₂-Plasma) strukturiert. Die Dotier stoffkonzentration betrug ca. 10²⁰ cm^-3. Damit wurde ein spezifischer Widerstand im mΩcm Bereich er reicht. Ferner wurde eine undotierte CVD- Diamantschicht auf Si als Düsenplatte (5) und als Be schichtung (12) eingesetzt. Die Düsen (11) wurden ebenfalls trockenchemisch geätzt. Diamant besitzt hervorragende mechanische, chemische und thermische Eigenschaften. Er ist chemisch völlig inert und me chanisch sehr stabil, weshalb alle nasschemischen Substanzen eingesetzt werden können. Es sind keine Passivierungsschichten gegen Oxidation, Kavitations schäden oder gegen einen chemischen Angriff des Mi kroheizers und auch der Düsenplatte notwendig. Durch die geringe Oberflächenrauhigkeit können Standardli thogrpahieprozesse aus der Mikroelektronik zur Struk turierung verwendet werden.

Das mechanische Trägersubstrat (2) besteht aus Sili zium in das nasschemisch die Zuführungen (1) für zwei unterschiedliche Flüssigkeiten geätzt wurden. Das me chanische Trägersubstrat (2) ist mit einer dünnen (2 µm) Schicht SiO₂ (3), die als thermischer Isolator für die Mikroheizelemente (8) dient, beschichtet. Die Flüssigkeiten werden mit Hilfe eines aus Polyimid aufgebauten mikrofluidischen Verteilungssystem aus Kapillaren und Reservoirs (4) von der Rückseitenzu führung (1) auf die jeweiligen Diamantheizelemente (8) geleitet. Die Mikroheizelemente (8) dienen zur Überhitzung der verwendeten Flüssigkeit die infolge der Gasblasenvolumenexpansion durch die Diamantdüsen platte (5) und der Düse (11) in die Mikroreaktions kammer (13) ausgestoßen wird. Die Heizelemente werden mittels einer hochtemperaturstabilen Multilayermetal lisierung aus Si/W:Si:N/Ti/Au (7) elektrisch kontak tiert. Die chemische Reaktion findet auf dem Reakti onsproduktesubstrat (9) statt, das in dem hier herge stellten Chip nicht mechanisch fest verbunden, son dern abnehmbar ist. Auf dem Reaktionsproduktesubstrat (9) findet in der hier genutzten Applikation die Syn these der Oligonukleotidketten statt. Die Oberfläche des Reaktionsproduktesubstrats (9) ist chemisch funk tionalisiert. Die funktionalisierten Bereiche sind ferner strukturiert. Nach der Synthese kann das Sub strat abgenommen werden und weiter genutzt werden. Jede Reaktionskammer (13) enthält einen Kanal (10), welcher zum Druckausgleich oder zur Zuführung ver schiedener Flüssigkeiten oder Gase, z. B. Schutzgase dient.

In Fig. 3 ist das Gleichgewicht der Detritylierungs reaktion eines immobilisierten Oligonukleotids darge stellt. Die Hinreaktion, d. h. die Detritylierung zum entschützten Oligonukleotid erfolgt dabei durch Zuga be einer Säure. Bei der Neutralisation, z. B. mit Col lidin, bilden sich Reaktionsprodukte, die die Synthe se nicht beeinträchtigen. Die Rückreaktion fällt da her kaum ins Gewicht.

In Fig. 4 ist der Aufbau der Synthesekammern darge stellt. Die Synthesekammer besteht aus einem Unter teil, auf das die Folie als Reaktionsproduktesub strat, die in einem Rahmen eingespannt ist, aufgelegt wird, und zwei Oberteilen, von denen eines die adres sierte Entschützung/Neutralisation ermöglicht, das zweite die Durchführung aller übrigen Schritte des Zyklus für die gesamte Folie.

Das Oberteil für die Entschützung/Neutralisation ist im Wesentlichen eine Platte mit mehreren schlitzför migen Reaktionskammern, die mit mehreren Flüssig keitsdosierelementen bestückt ist. Für die adressier te Entschützung wird an den zu entschützenden Posi tionen zunächst die Säure, die eine örtlich definier te Detritylierung bewirkt, dann die Base eingebracht. Beides geschieht manuell.

Die zweite Platte beinhaltet eine Synthesekammer, die alle möglichen Positionen abdeckt und gemeinsam mit Reagenzien versorgt. Für jede Kettenverlängerung muss, ebenfalls manuell, einmal zwischen den Kammern gewechselt werden.

Beispiel 1

Die Sequenz .dA₂₀ wurde auf einem Pharmacia Gene As sembler dergestalt erzeugt, dass der Detritylierungs schritt aus dem Programm entfernt wurde und die Syn thesekartusche mit dem Trägermaterial außerhalb des Geräts mit 0.5 mL 2% Trichloressigsäure in Dichloret han versetzt wurde. Nach 1 Minute wurde mit 0.5 mL 10% Collidin in Acetonitril neutralisiert, die Kartu sche nach gründlicher Durchmischung aus der Lösung entnommen, noch nass wieder in das Gerät eingesetzt und der Reaktionszyklus fortgeführt. Die Analyse des so erzeugten Oligonukleotids zeigt, dass die Reakti onsprodukte der Neutralisation die Synthese nicht be einträchtigen und die mögliche Rückreaktion (Fig. 3) nicht merklich ins Gewicht fällt.

Beispiel 2 Manuelle Synthese eines zweidimensionalen Oligonu kleotid-Arrays

Die Synthese wurde in einer speziellen Synthesekam mer, die an kommerziell erhältliche Synthesizer ange schlossen werden kann, auf einer funktionalisierten Polypropylenfolie⁴, durchgeführt. Die Synthesekammer besteht aus einem Unterteil, auf das die Folie, die in einem Rahmen eingespannt ist, aufgelegt wird, und zwei Oberteilen, von denen eines die adressierte Ent schützung/Neutralisation ermöglicht, das zweite die Durchführung aller übrigen Schritte des Zyklus für die gesamte Folie. Die Vorrichtung ist auch für die Verwendung anderer Trägermaterialien geeignet.

Das Oberteil für die Entschützung/Neutralisation ist im Wesentlichen eine gelochte Platte; in die Öffnun gen wird an den zu entschützenden Positionen zunächst die Säure, die eine örtlich definierte Detritylierung bewirkt, dann die Base eingebracht. Beides geschieht manuell. Die zweite Platte beinhaltet eine Synthese kammer, die alle möglichen Positionen abdeckt und ge meinsam mit Reagenzien versorgt. Für jede Kettenver längerung muss, ebenfalls manuell, einmal zwischen den Kammern gewechselt werden.

Vor dem ersten adressierten Synthesezyklus wurde in der Kammer II auf die Folie eine Kopplung mit einen C₆-Aminolink durchgeführt, dadurch können die er zeugten Sequenzen auf Wunsch für eine Qualitätskon trolle abgespalten werden.

Prinzipielle Vorgehensweise bei jeder Kettenverlänge rung:

1. Oberteil I wird aufgesetzt
2. Säure wird in die Öffnungen, die den zu verlän gernden Positionen entsprechen, eingebracht.
3. Warten bis zur vollständigen Detritylierung (30 sec.)
4. Base wird in die mit Säure beaufschlagten Öffnun gen eingebracht
5. (optional) Entfernen der Flüssigkeit aus den be treffenden Öffnungen
6. Kammer I wird entfernt
7. Kammer II wird aufgesetzt und an den Synthesizer angeschlossen
8. der Synthesizer führt die Schritte "Kopplung eines Monomers", "Capping" und "Oxidation" nach Vorschrift des Geräteherstellers durch.

Beispiel 3 Manuelle Synthese eines eindimensionalen Oligonukleo tid-Arrays

Die Vorgehensweise entspricht der aus Beispiel 2. Die Synthese wurde in einer speziellen Synthesekammer, die an kommerziell erhältliche Synthesizer ange schlossen werden kann, auf einem funktionalisierten Polypropylenstreifen, durchgeführt. Die Synthesekam mer besteht aus einem Unterteil, auf das der Streifen aufgelegt wird, und zwei Oberteilen, von denen eines die adressierte Entschützung/Neutralisation, das zweite die Durchführung aller übrigen Schritte des Zyklus für den gesamten Streifen ermöglicht. Die Vor richtung ist auch für die Verwendung anderer Träger materialien geeignet.

Das Oberteil für die Entschützung/Neutralisation ist im Wesentlichen eine mit Schlitzen versehene Platte, in die Schlitze wird an den zu entschützenden Posi tionen zunächst die Säure, die eine örtlich definier te Detritylierung bewirkt, dann die Base eingebracht. Beides geschieht manuell. Die zweite Platte beinhal tet eine mäanderförmige Synthesekammer, die alle mög lichen entschützten Positionen abdeckt und gemeinsam mit Reagenzien versorgt (Fig. 4). Für jede Kettenver längerung muss, ebenfalls manuell, einmal zwischen den Kammern gewechselt werden.

Vor dem ersten adressierten Synthesezyklus wurde in der Kammer II auf die Folie eine Kopplung mit einen C6-Aminolink durchgeführt, dadurch können die erzeug ten Sequenzen auf Wunsch für eine Qualitätskontrolle abgespalten werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Oligomeren durch schrittweise Kopplung von Monomereinheiten an ein festes Trägermaterial, wobei der intermediä re Schutz durch eine oder mehrere Schutzgruppen erfolgt, die bei der Kopplung der Monomereinheit auf das wachsende Kettenende übertragen werden und vor dem nächsten Kopplungsschritt durch Schutzgruppenabspaltung entfernt werden, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Abspaltung der Schutzgruppe ein zusätzlicher Neutralisationsschritt durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Oligomere Oli gonukleotide eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Oligomere Oli goribonukleotide eingesetzt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass abiologische Mono mereinheiten Verwendung finden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Abspaltung der Schutzgruppe durch eine Säure, z. B. Trichlores sigsäure, erfolgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Neutralisa tion verwendete Base eine organische Base, z. B. Collidin, ist.

7. Verfahren zur Herstellung von Arrays von Oligo meren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Injektion der Reagenzien für die Abspaltung der Schutzgruppen und die Neutralisation über ein Flüssigkeitsdo sierelement (1, 4, 5, 7, 8) in eine Mikroreakti onskammer (13) erfolgt, wobei das Flüssigkeits dosierelement und die Mikroreaktionskammer auf einem Chip integriert sind.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Abspaltung der Schutzgruppe und zur Neutralisation verwen deten Reagenzien in gegeneinander abgeschlosse nen Reaktionskammern (13) eingebracht werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Abspaltung der Schutzgruppe und zur Neutralisation verwen deten Reagenzien durch ein Flüssigkeitsdosierelement (1, 4, 5, 7, 8) auf definierte Posi tionen des Trägermaterials aufgebracht werden.

11. Mikroelektromechanische Vorrichtung zur Herstel lung von Arrays von Oligomeren durch die Injek tion der Reagenzien für die Abspaltung der Schutzgruppen und die Neutralisation über ein Flüssigkeitsdosierelement (1, 4, 5, 7, 8) in ei ne Mikroreaktionskammer (13), wobei das Flüssig keitsdosierelement und die Mikroreaktionskammer auf einem Chip integriert sind.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Reaktions kammern (13) als ein- oder mehrdimensionales Array angeordnet sind.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass jede Reaktionskam mer (13) mindestens zwei Flüssigkeitsdosierele mente (1, 4, 5, 7, 8) besitzt.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Flüssigkeits dosierelement (1, 4, 5, 7, 8) selektiv adres sierbar ist.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass durch Überhitzung einer Flüssigkeit und einer anschließenden Gas blasenexplosion die Flüssigkeit durch die Düse (11) in eine Reaktionskammer (13) ausgestoßen wird.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroheizele mente (8) und die Düsenplatte (5) aus chemisch inerten Materialien hergestellt sind.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Düsenplatte (5) auch aus Polyimid, Fotolack, Kunststoff, einem Halbleiter, einem Metall oder einem Dielektrikum (SiN, SiO₂) besteht.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroheizele ment (8) an der Oberfläche mit verschiedenen Ma terialien passiviert ist.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass für die Metallisie rung (7) ein beliebiges Metall, welches einen ohm'schen Kontakt zu dem Mikroheizelement (8) bildet, verwendet wird.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallisierung (7) durch ein Schutzschicht abgedeckt ist.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass jede Reaktionskam mer (13) einen Kanal (10) zur Entlüftung oder zur Zufuhr zusätzlicher Flüssigkeiten oder Schutzgase enthält.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das mikrofluidische System (4) auch aus einem Fotolack (Positivrest, Negativrest), einem Polymer, einem Polyimid, ei nem Metall, einem Dielektrikum oder einem Halb leiter besteht.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Substrate (2, 6, 9) mit Hilfe von nasschemischen oder trocken chemischen Ätzverfahren strukturiert sind.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass sich das mikroflui dische System (9) für die Reaktionsflüssigkeiten auf der Vorderseite oder der Rückseite des me chanischen Trägersubstrates (2) befindet.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Substrate (2, 6, 9) aus Silicium, Quarz, Glas, Kunststoff, Diamant, SiC oder einem beliebigen anderen Mate rial oder einem Mehrschichtsystem aus den ge nannten oder einem anderen Material besteht.

26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionskam mersubstrat (6) komplett oder nur teilweise mit Diamant, SiC, SiO₂, Si₃N₄, Metallen, Kunststoffen oder Dielektrika beschichtet wird.

27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionspro duktesubstrat (9) komplett oder nur teilweise mit Diamant, SiC, SiO₂, Si₃N₄, Metallen, Kunst stoffen oder Dielektrika beschichtet wird.

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Substrate (6, 9) durch ein mikrofluidisches System analog (4) ersetzt werden.

29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionspro duktesubstrat (9) fest mit der Vorrichtung ver bunden ist oder als abnehmbares System ausgelegt ist.

30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionspro duktesubstrat (9) zur Mischung, Synthese oder einer beliebigen chemischen Reaktion verwendet wird.

31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionspro duktesubstrat (9), die Düsenplatte (5) oder das Reaktionskammersubstrat (6) chemisch oberflä chenbehandelt (z. B. funktionalisiert oder termi niert) wird.

32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionspro duktesubstrat (9) transparent ist, um darunter Analysengeräte wie z. B. Mikroskope, CCD-Kameras, Photodioden, Phototransistoren einzusetzen.

33. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass im Reaktionsproduk tesubstrat (9) elektronische Bauelemente wie Transistoren, Dioden, CCD's, Fotodioden, Foto transistoren, Widerstände oder Elektroden zur Impedanzmessung oder für zyklische Voltammetrie integriert sind.

34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass in die Reaktions kammer (13) oder auf die Substrate (6, 9) elek tronische Bauelemente wie Transistoren, Dioden, CCD's, Fotodioden, Fototransistoren, Widerstände oder Elektroden zur Impedanzmessung oder für die zyklische Voltammetrie integriert sind.

35. Verwendung der Vorrichtung nach einem der An sprüche 11 bis 34 zur Analyse von DNA-Ketten oder Oligomeren.

36. Verwendung der Vorrichtung nach einem der An sprüche 11 bis 34 für die Mischung und Reaktion verschiedener, auch aggressiver Flüssigkeiten.

37. Verwendung der Vorrichtung nach einem der An sprüche 11 bis 34 zur Dosierung und/oder Mischung verschiedener Flüssigkeiten auf einem Feststoff, z. B. zur Analyse oder Reaktion des Feststoffs.