DE60007498T2

DE60007498T2 - Verfahren yur Herstellung von Oligonukleotidarrays

Info

Publication number: DE60007498T2
Application number: DE60007498T
Authority: DE
Inventors: Arthur Schleifer; May Tom-Moy
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2020-10-19
Also published as: US6077674A; EP1095698A3; EP1095698B1; DE60007498D1; EP1095698A2

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Werkzeuge und Verfahren, die zum Überwachen von Genexpressions- und -mutationspegeln in Gensequenzen verwendet werden. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen von Oligonucleotid-Arrays, das die Reinigung und den Zusammenbau von Oligonucleotiden mit einer Vollänge bzw. Vollängen-Oligonucleotiden auf ein Array zu einem Schritt kombiniert.
Stand der Technik
Es gibt zwei grundlegende Verfahren zum Erzeugen von Oligonucleotid-Arrays. Eine Technik besteht darin, das Oligonucleotid-Array in einzelnen Merkmalsstellen auf dem Array zu synthetisieren, Nucleotid für Nucleotid, unter Verwendung einer bekannten Phosphoramidit-Synthese-Chemie. Dieses Verfahren wird In-Situ-Oligonucleotid-Array-Synthese genannt. Die für die In-Situ-Synthese verwendeten Phosphoramiditen können unter Verwendung z. B. einer von Hewlett-Packard, Kalifornien, hergestellten Tintenstrahlaufbringungsausrüstung auf dem Array punktförmig aufgebracht werden, um ein räumlich einzigartiges Oligonucleotidmuster zu erzeugen. Um die unterschiedlichen Phosphoramiditen punktförmig auf das Arraysubstrat aufzubringen, werden vier Tintenstrahldüsen verwendet. Das Array aus Merkmalen auf dem Substrat ist eventuell physisch getrennt, oder es befindet sich eventuell kein Raum zwischen derartigen Merkmalen. Die In-Situ-Synthese schließt die sich wiederholenden Schritte des Entblockens, Koppelns, Abdeckens und Oxidierens ein, die in der Technik bekannt sind, bis die gewünschten Oligonucleotide mit einer Vollänge synthetisiert sind.
Zwar ist die In-Situ-Synthese ein sehr flexibles Mittel zum Herstellen von DNA-Arrays, doch ist die Wiedergabetreue oder der Anteil von Oligonucleotiden mit einer Vollänge, die innerhalb eines Merkmals auf dem Array synthetisiert werden, geringer als 100 %. Ein ideales Array weist nur Oligonucleotide mit einer Vollänge an jedem Merkmal angehängt auf. Das ideale Array fördert die Genauigkeit bei Hybridisierungsexperimenten oder Untersuchungen von biologischen Zielmaterialien. Ist die Wiedergabetreue eines in situ erzeugten Arrays weniger als 100 %, weist es in der Regel Oligonucleotide ohne eine Vollänge innerhalb eines Merkmals auf, das meist aus kürzeren Längen der korrekten Sequenz und, zu einem geringeren Grad, unkorrekten Sequenzen besteht. Typische DNA-Kopplungswirkungsgrade liegen für die standardmäßige Phosphoramiditchemie bei 97 bis 99 %. Für Oligonucleotide mit einer Länge von 25 Nucleotiden ergeben diese Wirkungsgrade nur 46 bis 77 % Oligonucleotide mit einer Vollänge, die innerhalb eines Merkmals enthalten sind (0, 97²⁵ bis 0, 99²⁵) . Dieser Wiedergabetreueverlust kann ein chemisches Rauschen bei Hybridisierungsexperimenten und/oder Schwierigkeiten beim Entwickeln von Hybridisierungsbedingungen bewirken. Der Wiedergabetreueverlust kann auch zu Schwierigkeiten beim Auswerten der Daten führen.
Die Photolithographie ist ein Verfahren, das von Affymetrix in Kalifornien verwendet wird, um unter Verwendung von Vorgängen, die ähnlich den in der Halbleiterindustrie verwendeten Vorgängen sind, In-Situ-Rrrays herzustellen. Bei einem von Fodor u. a. beschriebenen Vorgang aus dem U.S.-Patent mit der Seriennummer 5,405,783 von Affymetrix wird ein Photoschutzbefreiungsschritt verwendet, bei dem die Schutzgruppe auf dem Phosphoramidit durch Belichten einer photoempfindlichen Schutzgruppe entfernt wird. Es werden vier Photomasken verwendet, um Muster zu erzeugen, um Bereiche des Substrats von einem Schutz zu befreien, und anschließend wird zu diesen Regionen ein Nucleotid hinzugefügt. Diese Technik erfordert vier Masken für jede Nucleotidschicht. Zwar ermöglicht diese Technik eine Herstellung von Oligonucleotid-Arrays mit hoher Dichte, doch ist sie weniger effizient als eine traditionelle Phosphoramiditsynthese-Chemie. Bei Wirkungsgraden von etwa 90 bis 95 ist der Anteil von Oligonucleotiden mit einer Vollänge innerhalb eines Merkmals weiter reduziert auf etwa 9 bis 27 % für Oligonucleotide mit einer Länge von 25 Nucleotiden (0,90²⁵ und 0,9525).
Die Aufbringung oder das punktförmige Aufbringen von vorsynthetisierten Oligonucleotiden ist ein weiteres Verfahren zum Erzeugen von DNA-Arrays. Der Prozeß umfaßt in der Regel ein Synthetisieren der Oligonucleotide auf einem handelsüblichen DNA-Synthetisierer, wobei ein Nucleotid unter Verwendung der bekannten, sich wiederholenden Schritte der Detritylierung, Kopplung, Abdeckung und Oxidation an seinem 3'-Ende an einem festen Träger angehängt wird und das Oligonucleotid auf seinem 5'-Ende aufgebaut wird. Wenn die Synthese abgeschlossen ist, wird ein abschließender Schutzbefreiungs- und Abspaltungsschritt durchgeführt, um das 3'-Ende des ersten Nucleotids für eine Anhängung an das Arraysubstrat von dem Träger zu befreien. Bevor das synthetisierte Oligonucleotid an ein Arraysubstrat angehängt wird; ist ein Reinigungsschritt erforderlich, weil die Synthese zu einem Gemisch aus einem Vollängenprodukt und einem Anteil aus inkorrekten Oligonucleotiden mit einer kürzeren Länge führt. Ohne einen Reinigungsschritt wäre die Merkmalswiedergabetreue ähnlich der oben beschriebenen in situ synthetisierten Oligonucleotid-Arrays.
Der Reinigungsschritt kann mittels einer Anzahl von bekannten herkömmlichen Möglichkeiten durchgeführt werden. Ein Verfahren besteht darin, eine Festphasensäule zu verwenden, um die Trennung der Vollängensequenzen von den inkorrekten Sequenzen mit kürzerer Länge durch Halten der Trityl-Schutzgruppe (DMT) auf dem letzten Nucleotid in der Sequenz durchzuführen. Dies wird „Trityl-auf"-Synthese genannt. Nur die Vollängen-Oligonucleotid-Sequenzen sollten die Tritylgruppe immer noch angehängt aufweisen, da Ketten mit einer kürzeren Länge in dem Abdeckschritt abgedeckt wurden. Die Festphasenreinigungssäule weist eine hohe Affinität zu der Tritylgruppe auf und hält dieselbe auf der Säule zurück, während sie es ermöglicht, daß die unvollständigen Sequenzen ohne die Tritylgruppe hindurchlaufen. Das Abspalten der Tritylgruppe von den Oligonucleotiden mit einer Vollänge wird durch Anwenden einer sauren Lösung auf die Säule erreicht. Schließlich werden die Oligonucleotide mit einer Vollänge mit einer Lösung aus Acetonitril und Wasser aus der Säule eluiert. Die Elutionslösung enthält in erster Linie nur das Vollängenprodukt. Ein anderes bekanntes Reinigungsverfahren verwendet die Flüssigchromatographie (LC). Die synthetisierte Oligonucleotidlösung läuft auf einem LC-System, bei dem die Oligonucleotide mit einer Vollänge von den inkorrekten und kurzen Sequenzen getrennt werden und die Fraktion, die nur die Vollängen-Oligonucleotid-Lösung enthält, gesammelt wird. Diese Reinigungsschritte sind teuer, zeitaufwendig, anfällig für einen Produktverlust und eine Verdünnung der endgültigen Konzentration der Oligonucleotid-Lösung.
An der 3'-Ende-Anhängung an den festen Träger kann in der Regel ein Linker verwendet werden, der z. B. eine Aminogruppe enthält. Nachdem das Oligonucleotid von dem festen Träger abgespalten wurde, steht die 3'-Aminogruppe zur Verfügung, um das Oligonucleotid an das Arraysubstrat anzuhängen. Bei diesem herkömmlichen Vorgang weist jedes synthetisierte Oligonucleotid, einschließlich der kürzeren oder inkorrekten Sequenzen, seine 3'-Aminogruppe verfügbar für ein Anhängen an die Arrayoberfläche auf. Außer dem herkömmlichen Reinigungsschritt hindert nichts die kürzeren oder inkorrekten Sequenzen daran, sich während des Aufbringungsschrittes an die Arrayoberfläche anzuhängen. Ohne einen Reinigungsschritt liegt ein Anteil an Oligonucleotiden mit einer Vollänge in dem Merkmal vor, der niedriger als erwünscht ist. Um ein Oligonucleotid-Merkmal mit hoher Wiedergabetreue unter Verwendung der herkömmlichen Verfah ren zu erreichen, muß die Lösung vor der Aufbringung gereinigt werden.
Es gibt zwei bekannte grundlegende Techniken zum punktförmigen Aufbringen von synthetisierten Oligonucleotiden auf ein Array. Das Stiftplazieren (pin spotting) ist eine Technik, bei der Metallstifte in Lösungen aus vorsynthetisierten Oligonucleotiden getaucht werden und anschließend mit einem Substrat in Berührung gebracht werden. Eine kleine Menge der Lösung wird zu der Substratoberfläche übertragen. Die andere Technik verwendet die oben erwähnte Tintenstrahlausrüstung, um die Lösungen aus vorsynthetisierten Oligonucleotiden punktförmig aufzubringen. Die Tintenstrahlen sind mit den vorsynthetisierten Oligonucleotidlösungen beladen. Die Tintenstrahlen bringen die Oligonucleotide in einer computergesteuerten Weise auf die Oberfläche auf. cDNA-Arrays werden ebenfalls unter Verwendung der punktförmigen Aufbringungstechniken hergestellt.
Die vorsynthetisierten Oligonucleotide können durch bekannte herkömmliche Verfahren mit der Arraysubstratoberfläche verknüpft oder an dieselbe angehängt werden. Ein Verfahren umfaßt die kovalente Verknüpfung eines chemisch modifizierten Oligonucleotids (z. B. aliphatisches 1° Amin) mit der Substratoberfläche, die eine Amin-reaktive Gruppe (z. B. aromatisches Isothiocyanat) trägt. Ein anderes Verfahren umfaßt die Adsorption an eine Substratoberfläche, die mit einem positiv geladenen Polyelektrolyt (z. B. Poly-L-Lysin) beschichtet ist, gefolgt von einem chemischen oder photochemischen Vernetzen (z. B. kovalente Stabilisierung über ultraviolettes (UV-) Photovernetzen) mit der Oberfläche.
Olejnik, J. u, a., „Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides", Nucleic Acids Research, 1996, Bd. 24, Nr. 2, S. 361 – 366, beschreibt die Synthese eines photoabspaltbaren Biotin-Phosphoramidits (PCB) zum Anhängen an das 5'-Ende eines synthetischen Oligonucleotids. Das 5'-PCB-Ende des Oligonucleotids bindet an Streptavidin für eine Streptavidin-Affinität-Reinigung des Oligonucleotids aus Fehlersequenzen. Das PCB wird nach der Reinigung photoabgespalten. Das von Olejnik u. a. offenbarte Affinität-Reinigungsverfahren ist ein komplexes Verfahren, das ein Hinzufügen des rohen 5'-PCB-Oligonucleotids zu einer Suspension aus Streptavidin-Agarose-Perlen umfaßt, die dann inkubiert, drehgefiltert, mehrere Male gewaschen und drehgefiltert, resuspendiert, bestrahlt, drehgefiltert und wieder gewaschen werden.
Es wäre somit von Vorteil, ein Verfahren zum Herstellen eines Oligonucleotid-Arrays zu besitzen, das im wesentlichen nur Oligonucleotide mit einer Vollänge aufweist, das nicht die aufwendigen Reinigungsschritte erforderte und gleichzeitig eine Reinheit größer als 90 % Oligonucleotide mit einer Vollänge auf dem Array ergäbe. Die so hergestellten Arrays könnten Untersuchungsergebnisse mit höherer Qualität liefern. Ein derartiges Verfahren würde ein seit langer Zeit bestehendes Problem auf dem Gebiet der Arrayherstellung lösen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zum Herstellen von Oligonucleotid-Arrays mit einem hohen Anteil an Oligonucleotiden mit einer Vollänge, das einen Reinigungsschritt oder „eine Anreicherung eines Vollängen-Oligonucleotid-Anhangs" mit dem Aufbringungsschritt kombiniert. Das Verfahren verwendet die bekannten Synthesechemien, um Oligonucleotide auf einem Träger vorzusynthetisieren, und vorzugsweise wird die Phosphit-Triester-Synthese-Chemie verwendet. Des weiteren werden in der Erfindung herkömmliche Träger verwendet, die unten definiert sind. Nachdem das letzte Nucleotid der Oligonucleotidsequenz hinzugefügt wurde, umfaßt das vorliegende Verfahren jedoch den Schritt des Regierenslassens eines Verknüpfungsmittels mit dem freien Ende der Oligonucleotide mit einer Vollänge. Die Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge werden während eines herkömmlichen Abdeckschrittes abgedeckt und koppeln daher nicht mit dem Verknüpfungsmittel. Das Verknüpfungsmittel auf den Oligonucleotiden mit einer Vollänge schafft ein Mittel für die Oligonucleotide mit einer Vollänge, sich vorzugsweise an ein Arraysubstrat und nicht an andere vorhandene Oligonucleotide anzuhängen, wie z. B. die Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Verknüpfungsmittel ein Amin lieferndes Mittel, das den Oligonucleotiden mit einer Vollänge eine Aminogruppe hinzufügt. Alle Sequenzen mit einer kürzeren Länge wurden bei dem herkömmlichen Abdeckschritt abgedeckt. Daher wird die Aminogruppe nicht den Oligonucleotiden mit einer kürzeren Länge hinzugefügt. Während des herkömmlichen Abspalt- und Schutzbefreiungsschrittes wird ein Gemisch aus den Oligonucleotiden mit einer Vollänge und allen anderen Oligonucleotiden mit einer kürzeren Länge von dem Träger getrennt und die Aminogruppe an den Oligonucleotiden mit einer Vollänge in ein primäres Amin umgewandelt. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist der verwendete Träger ein standardmäßiger CPG ohne einen Amin-Linker, so daß dem Oligonucleotid bei der Abspaltung von dem Träger keine Amingruppe bereitgestellt wird.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird vorteilhafterweise der herkömmliche Reinigungsschritt, der die Oligonucleotide mit einer Vollänge von den Oligonucleotiden mit einer kürzeren Länge trennt, gestrichen. Statt dessen weist das vorliegende Verfahren ein Aufbringen des Gemischs aus den abgespalteten Oligonucleotiden auf das Array auf. Das Gemisch aus abgespalteten Oligonucleotiden wird gleichzeitig gereinigt, um während des Schrittes des Aufbringens durch die bevorzugte Anhängung der inhärent reaktiveren Verknüpfungsgruppe, z.B. vorzugsweise der reaktiveren Primäramingruppe, die nur auf den Oligonucleotiden mit einer Vollänge vorhanden ist, an die Oberfläche des Arrays, Oligonucleotide mit einer Vollänge von Oligonucleotiden mit einer kürzeren Länge zu trennen. Das primäre Amin an dem freien Ende des Oligonucleotids mit einer Vollänge hängt sich im Vergleich zu sekundären Aminen (die innerhalb der Struktur des Oligonucleotids enthalten sind) bevorzugt an das Substrat an, weil primäre Amine chemisch reaktiver als sekundäre oder tertiäre Amine sind. Daher bilden im wesentlichen nur die Oligonucleotide mit einer Vollänge eine kovalente Bindung mit der Arrayoberfläche. Nach der Aufbringung wird das Arraysubstrat verarbeitet, um das nichtgebundene Material wie z. B. die Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge zu entfernen. Das resultierende Array weist Merkmale mit einer hohen Konzentration an Oligonucleotiden mit einer Vollänge auf, die an die Arrayoberfläche gebunden sind.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist ein Verfahren zum Herstellen von Oligonucleotid-Arrays aus einem Gemisch aus Oligonucleotiden vorgesehen, bei dem das Gemisch Oligonucleotide mit einer Vollänge und Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge aufweist, die jeweils ein 5'-Ende und ein 3'-Ende aufweisen. Das Verfahren umfaßt ein Reagierenlassen eines Verknüpfungsmittels mit dem Oligonucleotid mit einer Vollänge, um eine Verknüpfungsgruppe mit einem Ende des Oligonucleotids mit einer Vollänge zu koppeln. Das Oligonucleotidgemisch wird ohne eine getrennte Reinigung auf eine Oberfläche des Arrays zum Zweck einer Anhängung an die Oberfläche aufgebracht, wobei sich die Verknüpfungsgruppe an dem Ende des Oligonucleotids mit einer Vollänge bevorzugt an die Oberfläche des Arrays anhängt im Vergleich zu anderen Gruppen, die an den Oligonucleotiden des Gemischs mit einer Vollänge und einer kürzeren Länge vorliegen. Optional können bei jedem der Ausführungsbeispiele zumindest 10 % (in Mol) oder sogar zumindest 15 % oder 20 % der Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge in dem aufgebrachten Gemisch vorliegen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung fügt während des Syntheseprozesses vorteilhafterweise nur den Oligonucleotiden mit einer Vollänge eine Verknüpfungsgruppe hinzu. Die Verknüpfungsgruppe ist das Mittel für eine Anhängung der Oligonucleotide mit einer Vollänge an die Arrayoberfläche. Nach einem Vorgang zum Abspalten und Befreien der Oligonucleotide von einem Schutz hängt sich während des Aufbringungsschritts ein hoher Anteil der Oligonucleotide mit einer Vollänge, die die Verknüpfungsgruppe aufweisen, an die Arrayoberfläche. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umgeht vorteilhafterweise den herkömmlichen Reinigungsschritt, erreicht aber dennoch Vollängen-Oligonucleotid-Merkmale mit hoher Wiedergabetreue und spart Herstellungszeit und -kosten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die verschiedenen Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind besser verständlich unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung, die in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen gegeben wird, bei denen gleithe Bezugszeichen gleiche strukturelle Elemente bezeichnen und in denen:
1 ein Blockdiagramm ist, das den herkömmlichen Oligonucleotid-Array-Syntheseprozeß darstellt.
2 ein Blockdiagramm ist, das das Verfahren der vorliegenden Erfindung darstellt.
3 ein Blockdiagramm ist, das einen Schritt 208 aus 2 bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel genauer darstellt.
Modi zum Ausführen der Erfindung
Definitionen
Die folgenden Begriffe sollen bei ihrer Verwendung hierin die folgenden allgemeinen Bedeutungen haben-
Polynucleotid – eine Verbindung oder Zusammensetzung, die ein polymeres Nucleotid oder Nukleinsäurepolymer ist. Das Polynucleotid kann eine natürliche Verbindung oder eine synthetische Verbindung sein. In dem Kontext einer Untersuchung kann das Polynucleotid von etwa 5 bis 5.000.000 oder mehr Nucleotide aufweisen. Die größeren Polynucleotide sind allgemein in dem natürlichen Zustand anzutreffen. In einem isolierten Zustand kann das Polynucleotid ungefähr 30 bis 50.000 oder mehr Nucleotide aufweisen, meist etwa 100 bis 20.000 Nucleotide, häufiger 500 bis 10.000 Nucleotide. Es ist daher offensichtlich, daß eine Isolierung eines Polynucleotids von dem natürlichen Zustand oft zu einer Fragmentierung führt. Die Polynucleotide umfassen Nukleinsäuren und Fragmente derselben aus einer beliebigen Quelle in gereinigter oder ungereinigter Form, darunter DNA, doppelsträngig oder einsträngig (dsDNA und ssDNA), und RNA, darunter t-RNA, m-RNA, r-RNA, mitochondriale DNA und RNA, Chloroplasten-DNA und -RNA, DNA/RNA-Hybride oder Mischungen derselben, Gene, Chromosomen, Plasmiden, die Genomen biologischer Materialien wie z. B. Mikroorganismen, z. B. Bakterien, Hefepilze, Viren, Viroide, Schimmelpilze, Pilze, Pflanzen, Tiere, Menschen und dergleichen. Das Polynucleotid ist u.U. nur ein kleiner Bruchteil eines komplexen Gemisches wie z. B. einer biologischen Probe. Ebenfalls eingeschlossen sind Gene, wie z. B. Hämoglobingene für Sichelzellenanämie, Zystische-Fibrose-Gene, Oncogene, cDNA und dergleichen. Polynucleotide umfassen Nukleinsäurepolymere mit einem modifizierten Rückgrat oder modifizierte Nucleotidbasen, wie z. B. Protein-Nukleinsäuren (PNAs) oder PNA-Hybride, wie in der US 5,948,902 offenbart.
Das Polynucleotid kann aus verschiedenen biologischen Materialien durch in der Technik bekannte Vorgänge erhalten werden. Das Polynucleotid kann gegebenenfalls abgespalten werden, um ein Fragment zu erhalten, das eine Zielnucleotidsequenz enthält, z. B. durch Scheren oder durch eine Behandlung mit einer Restriktionsendonuclease oder einem anderen ortspezifischen chemischen Abspaltungsverfahren.
Für Zwecke dieser Erfindung ist das Polynucleotid, oder ein aus dem Polynucleotid erhaltenes abgespaltenes Fragment, meist zumindest teilweise denaturiert oder einsträngig oder derart behandelt, um dasselbe denaturiert oder einsträngig zu machen. Derartige Behandlungen sind in der Technik bekannt und umfassen z. B. eine Wärme- oder Alkalibehandlung oder eine enzymatische Verdauung eines Strangs. Zum Beispiel kann eine doppelsträngige DNA (dsDNA) auf 90–100°C für eine Zeitdauer von etwa 1 – 10 Minuten erwärmt werden, um ein denaturiertes Material herzustellen, wohingegen eine RNA, die über Transkription aus einer dsDNA-Matrize hergestellt wurde, bereits einsträngig ist.
Ferner ist für die Zwecke der Erfindung der Begriff „Polynucleotid" mit dem Begriff „Oligonucleotid" austauschbar.
Oligonucleotid – ein Polynucleotid, meist einsträngig, meist ein synthetisches Polynucleotid, kann aber ein natürlich vorkommendes Polynucleotid sein. Das (Die) Oligonucleotid(e) ist (sind) meist aus einer Sequenz mit einer Länge von zumindest fünf Nucleotiden, üblicherweise 10 bis 100 Nucleotiden, noch üblicher 20 bis 50 Nucleotiden, bevorzugt 10 bis 30 Nucleotiden, noch bevorzugter 20 bis 30 Nucleotiden und wünschenswerterweise etwa 25 Nucleotiden zusammengesetzt. Für die Zwecke der Erfindung sind die Begriffe Oligonucleotid und Polynucleotid hierin austauschbar verwendet und sollen die wie hierin definierten Bedeutungen haben, sofern nicht anders angemerkt.
Verschiedene Techniken können zum Herstellen eines Oligonucleotids eingesetzt werden. Derartige Oligonucleotide können durch biologische Synthese oder durch chemische Synthese erhalten werden. Für kurze Sequenzen (bis zu etwa 100 Nucleotide) ist die chemische Synthese häufig wirtschaftlicher im Vergleich zu der biologischen Synthese. Zusätzlich zur Wirtschaftlichkeit liefert die chemische Synthese eine praktische Möglichkeit zum Eingliedern von Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht und/oder modifizierten Basen während spezifischer Syntheseschritte. Des weiteren ist die chemische Synthese bezüglich der Auswahl der Länge und Region einer Zielpolynucleotidbindungssequenz sehr flexibel. Das Oligonucleotid kann durch Standardverfahren wie z. B. jenen, die in handelsüblichen automatisierten Nukleinsäuresynthetisierern verwendet werden, synthetisiert werden. Die chemische Synthese einer DNA auf einem geeignet modifizierten Glas oder Harz kann zu einer DNA führen, die kovalent an die Oberfläche angehängt ist. Dies bietet unter Umständen Vorteile beim Waschen und bei der Probenhandhabung. Für längere Sequenzen können in der Molekularbiologie eingesetzte standardmäßige Replikationsverfahren verwendet werden, wie z. B. die Verwendung von M13 für eine einsträngige DNA, wie in J. Messing (1983) Methods Enzymol. 101: 20–78, beschrieben, durch Bezugnahme hierin enthalten.
Andere Verfahren der Oligonucleotidsynthese umfassen Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren (Narang, u. a., (1979) Meth. Enzymol 68: 90) und die Synthese auf einem Träger (Beaucage, u. a. (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859–1862) sowie Phosphoramidit-Techniken (Caruthers, M. H., u. a., „Methods in Enzymology", Bd. 154, S. 287–314 (1988), und andere in „Synthesis and Applications of DNA and RNA", S. A. Narang, Herausgeber, Academic Press, New York, 1987, beschriebene Techniken und die darin enthaltenen Verweise. Die sequentielle Addition von Nucleotidphosphoramiditen an oberflächenverknüpfte Hydroxylgruppen ist von T. Brown und Dorcas J. S. Brown in Oligonucleo tides and Analogues A Practical Approach, F. Eckstein, Herausgeber, Oxford University Press, Oxford, S. 1–24 (1991) beschrieben. Die chemische Synthese über ein photolithographisches Verfahren von räumlich adressierbaren Oligonucleotid-Arrays, die an Glasoberflächen gebunden sind, ist von A. C. Pease, u. a., Proc. Nat. Aca. Sci. USA (1994) 91: 5022–5026 beschrieben. Eine Anhängung von vorsynthetisierten Oligonucleotiden kann erreicht werden durch (1) kovalente Verknüpfung eines chemisch modifizierten Oligonucleotids (z. B. aliphatisches 1° Amin) mit der Substratoberfläche, die eine Amin-reaktive Gruppe (z. B. aromatisches Isothiocyanat) trägt, wie in Z. Guo, R. A. Guilfoyle, A. J. Thiel, R. Wang, L. M. Smith, Nucleic Acids Res 22, 5456–65 (1994) beschrieben, oder (2) Adsorption an eine Substratoberfläche, die mit einem positiv geladenen Polyelektrolyt (z. B. Poly-L-Lysin) beschichtet ist, gefolgt von einem chemischen oder photochemischen Vernetzen (z. 8. kovalente Stabilisierung über ultraviolettes (UV-) Photovernetzen) mit der Oberfläche, wie in M. Schena, D.
Shalon, R. W. Davis, P. O. Brown, Science, 270, 467–70 (1995) beschrieben. Eine herkömmliche Aufbringungsausrüstung, die zum Bilden von Arrays verwendet wird, umfaßt die in M. Schena u. a. (oben angeführt), A. C. Pease u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5022–6 (1994) und A. P. Blanchard, R. J. Kaiser L. E. Hood, Biosensors & Bioelectronics 11, 687–690 (1996) beschriebene Ausrüstung. Alle oben angeführten Verweise sind hierin durch Bezugnahme aufgenommen. Eine Reinigung nach der Synthese kann unter Verwendung der Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) oder Flüssigkeitschromatographie, wie z. B. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), durchgeführt werden, die am besten in Wu, R., u. a., (1984) „Purification and sequence analysis of synthetic oligodeoxyribonucleotides", In Oligonucleotide Synthesis: a practical aproach (Gafft, M. J., Herausgeber), IRL Press, Oxford, S. 135–151, beschrieben ist.
Oligonucleotidsonde – ein Oligonucleotid, das eingesetzt wird, um an einen Abschnitt eines Polynucleotids wie z. B. eines anderen Oligonucleotids oder einer Zielnucleotidsequenz zu binden. Der Entwurf und die Vorbereitung der Oligonucleotidsonden hängen allgemein von der erforderlichen Empfindlichkeit und Spezifität, der Sequenz des Zielpolynucleotids und, in bestimmten Fällen, der biologischen Signifikanz bestimmter Abschnitte der Zielpolynucleotidsequenz ab.
Phosphoramidit – Formel I umfaßt Phosphoramiditen (auch als Phosphittriester bekannt), Phosphite und H-Phosphonate. Für die Zwecke der Erfindung umfaßt der Begriff „Phosphoramidit(en)", wenn hierin verwendet, die Begriffe „Phosphit(e)" und „H-Phosphonat(e)", sofern nicht anders angemerkt.

wobei:
A H oder eine optional geschützte Hydroxylgruppe darstellt;
B eine Purin- oder Pyrimidinbasis ist, deren exozyklische Amin-Funktionale-Gruppe optional geschützt ist; wenn jedoch B durch A ersetzt wird, stellt die Formel I einen Phosphodiester' oder Phosphotriester dar;
C eine herkömmliche Schutzgruppe für die 5'--OH funktionale Gruppe ist und nicht seine herkömmliche Bedeutung „Kohlenstoff" hat, sofern nicht anders angemerkt;
x = 0 oder 1 unter der Voraussetzung, daß:
a) wenn x = 1:
R₃ H darstellt und R₉ ein negativ geladenes Sauerstoffatom darstellt; oder R₃ ein Sauerstoffatom ist und R₄ entweder ein Sauerstoffatom oder ein Sauerstoffatom, das eine Schutzgruppe trägt, darstellt; und
b) wenn x = 0:
R₃ ein Sauerstoffatom ist, das eine Schutzgruppe tragt, und R₄ entweder ein Wasserstoff oder eine disubstituierte Amingruppe ist.

Wenn x gleich 1 ist, R₃ ein Sauerstoffatom ist und R₄ ein Sauerstoffatom, ist das Verfahren in diesem Fall das sogenannte Phosphodiesterverfahren; wenn R₄ ein Sauerstoffatom ist, das eine Schutzgruppe trägt, ist das Verfahren in diesem Fall das sogenannte Phosphotriesterverfahren.
Wenn x gleich 1 ist, R₃ ein Wasserstoffatom ist und R₄ ein negativ geladenes Sauerstoffatom, wird das Verfahren als H-Phosphonat-Verfahren bezeichnet.
Wenn x gleich 0 ist, R₃ ein Sauerstoffatom ist, das eine Schutzgruppe trägt, und R₉ ein Halogen ist, wird das Verfahren als Phosphitverfahren bezeichnet, und wenn R₄ eine Rustrittsgruppe des disubstituierten Amintyps ist, wird das Verfahren als Phosphoramiditverfahren bezeichnet.
Nucleotid – die monomere Einheit von Nukleinsäurepolymeren, d. h. DNA und RNA, die eine stickstoffhaltige heterozyklische Base, die ein Derivat von entweder Purin oder Pyrimidin ist, einen Pentosezucker und ein Phosphat (oder Phosphorsäure) aufweist. Wenn das Phosphat entfernt wird, ist die verbleibende monomere Einheit ein „Nucleotid". Ein Nucleotid ist somit ein 5'-Phosphat des entsprechenden Nucleosids. Wenn die stickstoffhaltige Base von dem Nucleotid entfernt wird, ist die verbleibende monomere Einheit ein „Phosphodiester". Ein Nucleotid ist ein Phosphoramidit während der Synthese eines Oligonucleotids. Für die Zwecke der Erfindung umfaßt der Begriff „Nucleotid" sein entsprechendes Phosphoramidit, Nucleotid und seinen entsprechenden Phosphodiester, und „Oligonucleotid" umfaßt sein entsprechendes Oligonucleosid und seinen entsprechenden Oligophosphodiester, sofern nicht anders angegeben. Andere Beispiele sind u.a. abasische Phosphodiester, wie z. B. Polyäther und Proteinnukleinsäure-(PNA)-Hybride.
Modifiziertes Nucleotid – ein Nucleotid, das einen modifizierte Base, einen modifizierten Zucker oder eine modifizierte Phosphat- oder Phosphit-Gruppe enthält. Das modifizierte Nucleotid kann durch eine chemische Modifizierung eines Nucleotids entweder als Teil des Nukleinsäurepolymers oder vor der Einlagerung des modifizierten Nucleotids in das Nukleinsäurepolymer hergestellt werden. Zum Beispiel können die oben erwähnten Verfahren für die Synthese eines Oligonucleotids eingesetzt werden. Bei einem anderen Ansatz kann ein modifiziertes Nucleotid durch Einlagern eines modifizierten Nucleosidtriphosphats in die Polymerkette während einer Verstärkungsreaktion hergestellt werden.
Beispiele für modifizierte Nucleotide, als Erläuterung und nicht Einschränkung, umfassen Didesoxynucleotide, Derivate oder Analoga, die biotinyliert, aminmodifiziert, alkyliert, Fluorophor-markiert und dergleichen sind, und umfassen auch Phosphorothioat-, Phosphit-, Ring-Atom-modifizierte Derivate usw. Für die Zwecke der Erfindung umfassen modifizierte Nucleotide modifizierte Phosphoramiditen.
Substrat oder Träger – ein poröses oder nichtporöses, in Wasser unlösliches Material. Die Oberfläche kann jede einer Anzahl von Formen aufweisen, wie z. B. Streifen, Platte, Scheibe, Stab, Partikel, einschließlich Perle und dergleichen. Das Substrat kann hydrophil sein oder in der Lage sein, hydrophil gemacht zu werden, und umfaßt anorganische Pulver wie z. B. Kieselerde, Magnesiumsulfat und Tonerde; natürliche polymere Materialien, insbesondere zellulosische Materialien und von Zellulose abgeleitete Materialien wie z. B. faserenthaltende Papiere, z. B. Filterpapier, chromatographisches Papier etc.; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere wie z. B. Nitrozellulose, Zelluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-Methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat) etc.; verwendet entweder alleine oder in Zusammenhang mit anderen Materialien; Glas, das als Bioglas zur Verfügung steht, Keramiken, Metalle und dergleichen. Natürliche oder synthetische Anordnungen wie z. B. Liposome, Phospholipidvesikel und Zellen können ebenfalls eingesetzt werden. Ein häufig verwendeter Träger ist Glas mit gesteuerten Poren (Controlled Pore Glass (CPG)), das aus einer einheitlich hergestellten Glasmatrix mit Poren einer definierten Größe besteht.
Eine Immobilisierung von Oligonucleotiden auf einem Substrat oder einer Oberfläche kann durch bekannte Techniken erreicht werden, die gewöhnlich in der Literatur zur Verfügung stehen. Zum Beispiel siehe A. C. Pease, u. a., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 5022–5026 (1994), durch Bezugnahme hierin aufgenommen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zum Herstellen von Oligonucleotid-Arrays mit einer hohen Konzentration von Oligonucleotiden mit einer Vollänge ohne den herkömmlichen Schritt der Reinigung. Vorteilhafterweise sorgt das vorliegende Verfahren für ein Synthetisieren der Oligonucleotide mit einer Vollänge unter Verwendung herkömmlicher Verfahren in einem herkömmlichen DNA-Synthetisierer, mit der Ausnahme, daß ein Verknüpfungsmittel, nachdem die Oligonucleotide mit einer Vollänge synthetisiert wurden, mit den Oligonucleotiden mit einer Vollänge gekoppelt wird, bevor die Oligonucleotide von dem DNA-Synthetisierer-Träger abgespalten werden. Das Koppeln des Verknüpfungsmittels mit den Oligonucleotiden mit einer Vollänge ersetzt den Bedarf nach dem herkömmlichen Reinigungsschritt, wie unten genauer beschrieben wird.
1 stellt ein Blockdiagramm eines herkömmlichen Oligonucleotid-Syntheseverfahrens dar, das den Phosphittriester- (oder Phosphoramidit-) -Ansatz zur Arrayherstellung verwendet. Andere Oligonucleotid-Syntheseverfahren, die das H-Phosphonat-Verfahren und das Phosphoramidit-Verfahren zum Synthetisieren von Oligoribonucleotiden einschließen, aber nicht auf dieselben beschränkt sind, sind gleichermaßen auf die Erörterung unten anwendbar.
Ein Nucleosid wird durch eine kovalente Reaktion zwischen der 3'-Hydroxylgruppe an dem Nucleosid und einem Linker an dem Träger an einen festen Träger, in der Regel ein CPG, angehängt. Das CPG kann mit einem bereits an demselben angehängten ersten Nucleosid erworben werden. Ein Oligonucleotid wird in der Regel ausgehend von der 3'- zu der 5'-Richtung synthetisiert, wobei jedoch auch eine Synthese ausgehend von dem 5'-Ende zu dem 3'-Ende bekannt ist. Die Erörterung unten beschreibt die herkömmliche 3'→5'-Syntheserichtung unter Bezugnahme auf 1. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die Erfindung auf Syntheseverfahren anwendbar ist, die entweder die 3'→5'- oder 5'→3'-Syntheserichtung verwenden. Die Oligonucleotidkette wird durch einen nucleophilen Angriff der 5'-Hydroxylgruppe des immobilisierten Nucleosids auf dem Träger verlängert. Zu Beginn des Syntheseprozesses ist die 5'-Hydroxylgruppe an dem mit dem Träger verknüpften Nucleosid zeitweise durch z. B. Alkylierung mit 4',4'-Dimethoxytritylchlorid (DMT) geschützt. Um die Oligonucleotidkette zu verlängern, muß die Schutzgruppe entfernt werden. Darüber hinaus weist jedes Phosphoramidit, das danach hinzugefügt wird, um die Kette zu verlängern, eine 5'-Schutzgruppe auf, wie z. B.
DMT, die entfernt wird, um ein weiteres Phosphoramidit hinzuzufügen.
Bezug nehmend auf 1 wird ein durch ein 5'-DMT geschütztes gekoppeltes Phosphoramidit detrityliert (Schritt 101), um das Phosphoramidit zum Koppeln mit einem weiteren Phosphoramidit an seinem vom Schutz befreiten 5'-Ende vorzubereiten. Das DMT wird z. B. durch eine herkömmliche Behandlung mit Trichloressigsäure (1 – 3 % w/v) in Dichlormethan in weniger als 1 Minute von dem 5'-Ende abgespalten.
Das vom Schutz befreite gekoppelte Phosphoramidit wird mit einem weiteren Phosphoramidit gekoppelt (Schritt 103), das durch Behandeln desselben mit einer schwachen Säure, wie z. B. Tetrazol, an seiner 3'-Phosphoramidit-Funktionalen-Gruppe aktiviert wurde. Das aktivierte Phosphoramidit weist die nächste stickstoffhaltige Base auf, die der Oligonucleotidkette hinzugefügt werden soll. Das aktivierte Phosphoramidit enthält ein durch ein DMT geschütztes 5'-Ende und wird über die aktivierte Phosphitgruppe an seinem 3'-Ende mit dem vom Schutz befreiten 5'-Ende des zuvor gekoppelten Phosphoramidits gekoppelt.
Jeder Kopplungsschritt 103 ist nicht zu 100 % effizient. In der Regel ist jeder Kopplungsschritt zu ungefähr 97 % bis 99 % effizient. Eine geringe Menge der vom Schutz befreiten 5'-Stellen koppelt also während des Kopplungsschritts nicht mit dem nächsten Phosphoramidit. Zum Beispiel beträgt für einen Kopplungswirkungsgrad von 98 % für ein Oligonucleotid mit einer Länge von 20 Nucleotiden der Anteil der korrekten Oligonucleotide mit einer Vollänge ungefähr 67 % (0,98²⁰). Um inkorrekte Sequenzen (sogenannte Streichungen) zu verhindern, werden die Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge daran gehindert, in einem späteren Kopplungsschritt mit einem Phosphoramidit zu koppeln. Daher werden die Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge bzw. „gescheiterten" Oligonucleotide abgedeckt (Schritt 105), um eine spätere Kopplungsreaktion zu blockieren. Die freien Hydro xylgruppen an dem 5'-Ende der gescheiterten Oligonucleotide werden durch Acetylierung unter Verwendung eines starken Acetylierungsreagenzes, wie z. B. N-Acetyldimethylaminopyridiniumion, abgedeckt, das aus einer Reaktion zwischen Acetanhydrid und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder N-Metyhl-Imidazol gebildet wird. Diese oder andere in der Technik bekannte Acetylierungsverfahren können verwendet werden.
Die Syntheselösung weist nun eine wachsende Oligonucleotidkette und möglicherweise einige ungekoppelte Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge auf, die abgedeckt wurden, um eine zukünftige Phosphoramiditaddition zu verhindern. Jedes zu der wachsenden Oligonucleotidkette hinzugefügte Phosphoramidit weist eine instabile Phosphit-Internucleotid-Verknüpfung an seinem 3'-Ende auf, so daß die Phosphitverknüpfung unter Verwendung von z. B. Jod in einer basischen Tetrahydrofuranlösung mit Wasser zu einer stabilen fünfwertigen Phosphattriesterbindung oxidiert oder stabilisiert (Schritt 107) wird. Nach dem Oxidationsschritt 107 sind die wachsenden Oligonucleotidketten für die Addition weiterer Phosphoramiditen bereit.
Die Schritte 101–107 werden solange wiederholt, bis das gewünschte Oligonucleotid mit einer Vollänge synthetisiert ist. Die Phosphoramiditen werden aufeinanderfolgend an der 5'-Hydroxylstelle hinzugefügt, wo die Schutzgruppe bei dem Detritylierungsschritt 101 entfernt wurde.
Nachdem das Oligonucleotid mit einer Vollänge synthetisiert wurde, wird es von dem Träger abgespalten und seine stickstoffhaltigen Basen und seine Phosphatgruppe werden gleichzeitig durch Behandlung mit Ammoniumhydroxid und/oder Methylamin unter bekannten Bedingungen von einem Schutz befreit (Schritt 109).
Wie oben erwähnt, führt die Synthese von Oligonucleotiden gemäß den herkömmlichen Verfahren zu „gescheiterten Ket ten", die sich allmählich in Abhängigkeit von der Oligonucleotidkettenlänge ansammeln. Gescheiterte Ketten schließen verkürzte Ketten wie z. B. vorzeitig beendete Ketten, basenmodifizierte Ketten und gescheiterte Ketten ein, die aus einer Kettenabspaltung während der Schutzbefreiung resultieren. Es gibt keine einzelne Quelle derartiger Gescheiterte-Ketten-Verunreinigungen, zu denen Kopplungswirkungsgrade sicherlich beitragen. Da das oben beschriebene Syntheseverfahren 100 einige gescheiterte Ketten, wie z. B. Oligonucleotide mit einer „kürzeren Länge", zusammen mit den Oligonucleotiden mit einer Vollänge umfaßt, müssen die Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge aus der Lösung herausgetrennt werden, so daß hauptsächlich nur das Oligonucleotid mit einer Vollänge auf die Arrayoberfläche aufgebracht wird, um das Array aus Vollängen-Oligonucleotid-Merkmalen zu bilden. Das Heraustrennen der gescheiterten Ketten oder „Reinigen" des Oligonucleotids mit einer Volllänge ist ein sehr wichtiger Schritt, um Arrays mit hoher Wiedergabetreue zu erreichen. Die Lösung wird unter Verwendung der bekannten Verfahren der Festphasenchromatographie, Polyacrylamidgel-Elektrophorese oder Flüssigkeitschromatographie gereinigt (Schritt 111).
Die gereinigte Lösung aus Oligonucleotiden mit einer Volllänge wird unter Verwendung von bekannten manuellen oder automatischen Mitteln zum punktförmigen Aufbringen des Oligonucleotids mit einer Vollänge auf die Merkmalsbereiche auf die Oberfläche des Arrays aufgebracht (Schritt 113). Die gereinigten Oligonucleotide mit einer Vollänge werden mittels herkömmlicher Methoden zum Anhängen an ein Substrat mit dem Array verknüpft.
Das Verfahren 200 zum Herstellen von Vollängen-Oligonucleotiden mit hoher Wiedergabetreue gemäß der vorliegenden Erfindung weist vorteilhafterweise die Schritte 101 bis 109, 113 und 115 auf, wie oben für das herkömmliche Verfahren 100 beschrieben, so daß die gleiche bewährte Ausrüstung, die gleichen bewährten Materialien und Prozesse verwendet werden können. Das Verfahren 200 der Erfindung vermeidet jedoch vorteilhafterweise den kostspieligen und zeitaufwendigen Reinigungsschritt 111, erreicht aber dennoch ein Vollängen-Oligonucleotid-Array mit hoher Wiedergabetreue oder Reinheit.
2 stellt ein Blockdiagramm des Verfahrens 200 zum Herstellen von Vollängen-Oligonucleotid-Arrays gemäß der Erfindung dar. Die Schritte 201–207, 209 und 213 in 2 sind im wesentlichen die gleichen wie ihre herkömmlichen Entsprechungen (101–109, 113 und 115) in 1. Jedoch wird nach dem letzten Oxidationsschritt 207, wenn das Oligonucleotid mit der gewünschten Länge („mit einer Volllänge") synthetisiert wurde, ein zusätzlicher Detritylierungsschritt 201 durchgeführt, um das 5'-Ende des Oligonucleotids mit einer Vollänge freizugeben. Das freigegebene Oligonucleotid mit einer Vollänge läßt man mit einem Verknüpfungsmittel reagieren (Schritt 208). Das Verknüpfungsmittel fügt dem freien Ende des Oligonucleotids mit einer Vollänge eine Verknüpfungsgruppe hinzu, nicht aber den Oligonucleotiden mit einer kürzeren Länge, da diese in Schritt 205 an ihrem freien Ende abgedeckt werden.
Das Verknüpfungsmittel ist ein Mittel, das z. B. aus einem Amin liefernden Mittel, einem Carboxyl liefernden Mittel oder einem Thiol liefernden Mittel ausgewählt ist, das mit einer Arraysubstratoberfläche eine kovalente Bindung bilden kann, das aber mit keiner anderen Gruppe auf den abgedeckten Oligonucleotiden mit einer kürzeren Länge reagiert. Derartige Verknüpfungsmittel sind z. B. von Rainer Bischoff u. a., „Introduction of 5'-Terminal Functional Groups into Synthetic Oligonucleotides for Selective Immobilization", Analytical Biochemistry, 164, 336–344 (1987), und den darin aufgeführten Verweisen beschrieben. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird ein Amin lieferndes Mittel verwendet, das aus aminmodifizierten Phosphoramiditen oder anderen Mitteln oder Reaktanten ausgewählt ist, die dem letzten Nucleotid der Vollängen-Oligonucleotid-Kette eine Amino gruppe hinzufügen, den abgedeckten Oligonucleotiden mit einer kürzeren Länge aber keine Aminogruppe hinzufügen. Noch bevorzugter werden die aminmodifizierten Phosphoramiditen verwendet, und am meisten bevorzugt werden die 5'-aminmodifizierten Phosphoramiditen verwendet. Das aminmodifizierte Phosphoramidit wird mit dem Oligonucleotid mit einer Vollänge auf die gleiche Weise gekoppelt, wie die anderen Phosphoramiditen mit der wachsenden Oligonucleotidkette gekoppelt wurden (Schritt 203). Wenn das 5'-aminmodifizierte Phosphoramidit verwendet wird, um mit dem Oligonucleotid mit einer Vollänge zu koppeln, ersetzt eine Rminogruppe die herkömmliche DMT-Schutzgruppe an dem 5'-Ende des aminmodifizierten Phosphoramidits. Die bevorzugte Aminogruppe an dem 5'-Ende des aminmodifizierten Phosphoramidits ist eine Trifluoracetylamino-(TFA)-Gruppe, doch können andere aminmodifizierte Gruppen an dem modifizierten Phosphoramidit verwendet werden, wie z. B. MMT. Die TFA-Gruppe wird bevorzugt, da sie unbeständig gegenüber Basen ist und somit während des herkömmlichen Abspaltungs- und Schutzbefreiungsschritts 209, wie unten beschrieben, vorteilhafterweise reduziert wird. Die TFA-Gruppe umfaßt unter anderem z. B. eine TFA mit sechs Kohlenstoffatomen (C6), eine TFA mit drei Kohlenstoffatomem (C3), ist aber nicht darauf beschränkt. Die C6-TFA wird bevorzugt, da sie mehr Raum zwischen der 5'-Amin-Moietät und dem Oligonucleotid mit einer Vollänge bereitstellt.
Der Schritt des Reagierenslassens 208 ist in 3 für das bevorzugte Ausführungsbeispiel dargestellt. Das Amin liefernde Mittel wird mit dem Oligonucleotid mit einer Vollänge gekoppelt (Schritt 208a). Das Amin liefernde Mittel fügt dem von einem Schutz befreiten 5'-Ende der Oligonucleotide mit einer Vollänge eine Aminogruppe hinzu. Dann wird der Abdeckschritt 208b durchgeführt, um jegliche Oligonucleotide mit einer Vollänge abzudecken, die nicht erfolgreich mit dem Amin liefernden Mittel koppelten. Der Abdeckprozeß kann der gleiche sein wie derjenige, der bei den oben beschriebenen Schritten 105, 205 verwendet wurde. Dann wird die Verknüpfung zwischen dem Amin liefernden Mittel und dem Oligonucleotid mit einer Vollänge stabilisiert (Schritt 208c). Bei dem bevorzugteren Ausführungsbeispiel, bei dem das Amin liefernde Mittel das aminmodifizierte Phosphoramidit ist, wird die Phosphitgruppe an dem modifizierten Oligonucleotid mit einer Vollänge auf die gleiche Weise oxidiert (Schritt 208c) wie bei den oben beschriebenen Schritten 107, 207, um die Phosphattriesterbindung zwischen dem Oligonucleotid mit einer Vollänge und dem aminmodifizierten Phosphoramidit zu stabilisieren.
Das Vollängen-Oligonucleotid mit einer durch das Verknüpfungsmittel an dasselbe angehängten Verknüpfungsgruppe wird im folgenden als „modifiziertes Oligonucleotid mit einer Vollänge" der Erfindung bezeichnet. Bezug nehmend wieder auf 2 werden die Oligonucleotide von dem Träger abgespalten und von einem Schutz befreit (Schritt 209), wodurch eine Mischung aus modifizierten Oligonucleotiden mit einer Vollänge, abgedeckten Oligonucleotiden mit einer Vollänge und abgedeckten Oligonucleotiden mit einer kürzeren Länge hergestellt wird. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel wandelt der Abspalt- und Schutzbefreiungs= schritt 209 auch die Aminogruppe an allen modifizierten Oligonucleotiden mit einer Vollänge in ein primäres Amin um. Für die Erfindung werden standardmäßige CPG-Träger verwendet, die keinen Linker aufweisen, der beim Abspalten von dem Träger dieselbe Verknüpfungsgruppe als Verknüpfungsmittel bereitstellt.
Die Mischung wird unter Verwendung einer herkömmlichen Aufbringungsausrüstung und herkömmlicher Aufbringungsverfahren auf ein Arraysubstrat aufgebracht (Schritt 211), vorteilhafterweise ohne die Mischung zuerst zu trennen oder zu reinigen, um die gewünschten Oligonucleotide mit einer Vollänge herauszutrennen. Sehr zum Vorteil hängen sich die modifizierten Oligonucleotide mit einer Vollänge während des Aufbringungsprozesses 211 aufgrund der höheren chemischen Reaktivität der Verknüpfungsgruppe an dem freien Ende des Oligonucleotids im Vergleich zu anderen Gruppen, die innerhalb der Struktur enthalten sind oder an einem freien Ende der Oligonucleotide, einschließlich der Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge, vorzugsweise an das Substrat an. Daher reagieren die modifizierten Oligonucleotide mit einer Vollänge schneller und binden an die Arrayoberfläche, bevor eines der abgedeckten Oligonucleotide mit einer Vollänge in dem Gemisch bindet, und insbesondere bevor eines der Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge in dem Gemisch bindet, da keines dieser Oligonucleotide eine Verknüpfungsgruppe mit höherer Reaktivität für eine Bindung zur Verfügung hat. Daher fungiert der Schritt des Aufbringens 211 auch als Reinigungsschritt, der gleichzeitig mit der Anhängung der Oligonucleotide auf dem Array auftritt. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Verknüpfungsgruppe mit höherer Reaktivität das während des Abspaltungsschritts 209 gebildete primäre Amin. Das primäre Amin weist eine höhere chemische Reaktivität als sekundäre oder tertiäre Amine auf, die in der Struktur der Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge enthalten sein können. Es sei darauf hingewiesen, daß in gewissem Umfang eine Bindung anderer Gruppen, wie z. B. der sekundären und tertiären Amine, an den Oligonucleotiden mit einer kürzeren Länge an die Oberfläche des Arrays während des Aufbringungsschritts 211 auftreten kann. Das Auftreten dieser unerwünschten Bindung bringt Verunreinigungen mit kürzerer Länge oder inkorrekter Sequenz („Verunreinigungen") in das gemäß der Erfindung hergestellte Array ein. Vorteilhafterweise ist der Anteil dieser eingebrachten Verunreinigung auf das bevorzugte Anhängungsverhältnis der Verknüpfungsgruppe zu anderen Gruppen, die für eine Bindung zur Verfügung stehen, bezogen, und vorzugsweise auf das bevorzugte Anhängungsverhältnis der primären Amine zu sekundären und tertiären Aminen, wie weiter unten beschrieben.
Nach der Aufbringung 211 und in Abhängigkeit von der verwendeten Oberfläche des Arrays werden die Arraysubstrate oder -objektträger verarbeitet, entweder durch Liegenlassen derselben über Nacht zum Trocknen oder Rehydratisieren derselben in einer befeuchteten Kammer. Nach der Trocknung oder Rehydratisierung über Nacht werden die Arrayobjektträger mit einer Mischung aus Reagenzien passiviert, um unspezifische Bindungsstellen auf Bereichen der Arrayobjektträgeroberfläche, die keine Oligonucleotidmerkmale enthalten, zu deaktivieren oder blockieren. In anderen Fällen werden die Arrayobjektträger verschiedenen Schritten, die in der Technik bekannt sind, unterzogen, um die kovalente Bindung zwischen dem Oligonucleotid und der Oberflächenchemie der Arrayobjektträgeroberfläche zu stabilisieren.
Das Array wird verarbeitet (Schritt 213), um das nichtgebundene Material zu entfernen, einschließlich der Oligonucleotide mit einer kürzeren Länge, und um jegliche auf der Oberfläche verbleibenden chemisch aktiven Stellen zu inaktivieren. Der Verarbeitungsschritt weist vorzugsweise ein Waschen des Arrays mit 6X SSPE und 0,005 % Triton-X-100 für 1 Minute auf; Waschen des Arrays mit 0,1X SSPE und 0,005 Triton-X-100 bei 37°C für 15 Minuten mit Umrühren; und Durchführen eines letzten Waschgangs in 0,1X SSPE ohne Triton-X-100 bei 4°C für 2 Minuten; gefolgt von einem Zentrifugieren der Arrayobjektträger bei 1.200 Umdrehungen pro Minute für 1 Minute zum Trocknen.
Somit vermeidet das vorliegende Verfahren 200 den herkömmlichen getrennten Reinigungsschritt 111, der teuer, zeitaufwendig, anfällig für einen Produktverlust und eine Verdünnung der endgültigen Konzentration der Oligonucleotid-Lösung für eine Aufbringung ist. Das Verfahren 200 überwindet nicht nur die Nachteile der herkömmlichen Verfahren, sondern erreicht dabei auch ein Oligonucleotid-Array mit hoher Wiedergabetreue oder Reinheit. Vollängen-Oligonucleotid-Arrays mit hoher Wiedergabetreue werden durch das vorliegende Verfahren 200 mit einer Reinheit größer als 90 % bei niedrigeren Kosten und schnelleren Verfahrenszeiten hergestellt als die Vollängen-Oligonucleotid-Arrays, die durch herkömmliche Verfahren, wie z. B. das oben beschriebene Verfahren 100, hergestellt werden.
Gemäß dem Verfahren 200 der Erfindung verbessert das bevorzugte Anhängungsverhältnis der Verknüpfungsgruppe im Vergleich zu anderen Gruppen, die frei sind, sich anzuhängen, den Anteil an Oligonucleotiden mit einer Vollänge, die sich an das Arraysubstrat anhängen. Das Ergebnis ist ein höherer Anteil an Oligonucleotiden mit einer Vollänge, die an die Oberfläche des Arrays angehängt sind, oder, alternativ, ein niedrigerer Anteil an Oligonucleotiden mit einer kürzeren Länge, die an das Array angehängt sind. Für die Erfindung beträgt das bevorzugte Anhängungsverhältnis des Verknüpfungsmittels nur etwa 5:1, um eine hohe Reinheit größer als 90 % zu erreichen, und vorzugsweise liegt das bevorzugte Anhängungsverhältnis etwa zwischen 10:1 und etwa 30:1. Primäre Amine weisen in der Regel ein bevorzugtes Anhängungsverhältnis von 5:1 bis zu 30:1 im Vergleich zu sekundären oder tertiären Aminen auf, um eine Reinheit >90 % zu erreichen. Mit einer Reinheit von 90 % ist gemeint, daß der Anteil an modifizierten Oligonucleotiden mit einer Vollänge, die nach dem Schritt 213 auf dem Array vorliegen, gleich oder größer als 90 % ist. Alternativ bedeutet eine Reinheit von 90 %, daß der Anteil an Oligonucleotiden mit einer kürzeren Länge oder Verunreinigungen, die auf dem Array vorliegen, gleich oder kleiner als 10 % ist, gemäß dem Verfahren 200 der Erfindung.
Als ein weiteres Beispiel sei eine Endmischung bei Schritt 209 betrachtet, die 50 % modifiziertes Vollängenprodukt mit einem primären Amin und 50 % Sequenzen mit kürzerer Länge oder inkorrekte Sequenzen ohne ein primäres Amin aufweist. Wenn ein bevorzugtes Anhängungsverhältnis des modifizierten Oligonucleotids mit einer Vollänge von 10:1 besteht, dann hängen sich nur eine von 10 oder 10 % der ursprünglichen 50 % der kürzeren oder inkorrekten Sequenzen oder 5 % (0,10 × 0,50) auch an die Arrayoberfläche an. Somit ergibt dieses Beispiel ungefähr 95 % modifizierte Oligonucleotide mit einer Vollänge, die an die Arrayoberfläche angehängt sind, oder eine Reinheit von 95 % und eine Verunreinigung von nur 5 %, gemäß der Erfindung.
Das hergestellte Array gemäß dem Verfahren 200 der Erfindung wird verwendet, um zu testende „Ziel"-Proben aus Polynucleotiden oder Oligonucleotiden auszuwerten. Ein Benutzer setzt das Array einer Probe aus, wie z. B. bei Hybridisierungs- oder Bindungsuntersuchungen, und fragt das Array im Anschluß an ein derartiges Aussetzen unter Verwendung bekannter herkömmlicher Verfahren ab. Die Abfrage liefert ein Ergebnis. Informationen über die Zielprobe können aus den Ergebnissen der Abfrage erhalten werden. Der Benutzer kann sich an einer Stelle befinden, die von der Stelle, an der das Array hergestellt wird, entfernt ist. Der Benutzer kann die Ergebnisse oder die aus den Ergebnissen gewonnenen Informationen zu einer Stelle übermitteln, die von der Stelle des Benutzers entfernt ist. Eine Stelle ist entfernt, wenn sie zumindest eine unterschiedliche Stelle ist, z. B. ein unterschiedliches Gebäude, eine unterschiedliche Stadt, ein unterschiedlicher Staat oder ein unterschiedliches Land.
Es wurde somit ein neues Verfahren zum Herstellen von Vollängen-Oligonucleotid-Sondenarrays mit hoher Wiedergabetreue beschrieben, das den herkömmlichen getrennten Reinigungsschritt und seine inhärenten Probleme vermeidet und dennoch Arrays mit hoher Wiedergabetreue bei niedrigen Kosten und einer schnelleren Verfahrenszeit ergibt. Es sei darauf hingewiesen, daß die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele lediglich einige der vielen spezifischen Ausführungsbeispiele, die die Prinzipien der vorliegenden Erfindung darstellen, erläutern. Es ist klar, daß zahlreiche andere Anordnungen ohne weiteres von Fachleuten auf dem Gebiet entwickelt werden können, ohne von dem Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Claims

Ein Verfahren (200) zum Herstellen von Oligonucleotid-Arrays aus einem Gemisch von vorsynthetisierten Oligonucleotiden auf einem Träger, wobei das Gemisch ein Oligonucleotid mit einer Vollänge und ein Oligonucleotid einer kürzeren Länge aufweist, die jeweils ein 5'-Ende und ein 3'-Ende aufweisen, wobei ein freies Ende des Oligonucleotid mit der Vollänge eine Schutzgruppe aufweist und ein freies Ende des Oligonucleotids der kürzeren Länge eine Abdeckgruppe aufweist, wobei das andere Ende jedes Oligonucleotids an dem Träger angehängt ist, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: Reagierenlassen (208) eines Verknüpfungsmittels mit dem Oligonucleotid mit der Vollänge, um eine Verknüpfungsgruppe mit dem freien Ende des Oligonucleotid mit der Vollänge zu koppeln; Abspalten (209) des anderen Endes der Oligonucleotide in dem Gemisch von dem Träger; und Aufbringen (211), ohne separates Reinigen, des Oligonucleotidgemischs auf einer Oberfläche des Arrays zur Anhängung an der Oberfläche, wobei die Verknüpfungsgruppe an dem freien Ende des Oligonucleotid mit der Vollänge eine höhere chemische Reaktionsfähigkeit als andere Gruppen aufweist, die an den Oligonucleotiden mit der Vollänge und der kürzeren Länge des Gemischs vorliegen, um vorzugsweise an die Oberfläche des Arrays angehängt zu werden.
Das Verfahren (200) gemäß Anspruch 1, das ferner den Schritt des Verarbeitens (213) des Arrays aus aufge brachtem Oligonucleotid aufweist, um nicht angehängte Materialien, einschließlich des abgedeckten Oligonucleotids der kürzeren Länge, zu entfernen.
Das Verfahren (200) gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem der Schritt des Reagierenlassens (208) eines Verknüpfungsmittels folgende Schritte aufweist: Befreien (201) des freien Endes des Oligonucleotids der vollen Länge von einem Schutz durch Entfernen der Schutzgruppe; Koppeln (208a) der Verknüpfungsgruppe mit dem vom Schutz befreiten freien Ende des Oligonucleotid mit der Vollänge; und Abdecken (208b) des freien Endes jegliches nicht gekoppelten, vom Schutz befreiten Oligonucleotid mit der Vollänge.
Das Verfahren (200) gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, bei dem das Verknüpfungsmittel aus Amin liefernden Mitteln, Carboxyl liefernden Mitteln oder Thiol liefernden Mitteln ausgewählt ist, die mit keinen anderen Gruppen in dem Gemisch aus Oligonucleotiden reagieren.
Das Verfahren (200) gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, bei dem das Verknüpfungsmittel ein Amin lieferndes Mittel ist, das aus aminmodifizierten Phosphoramiditen ausgewählt ist, die ein Aminoende und ein Phosphitende aufweisen, und bei dem der Schritt des Abspaltens (209) gleichzeitig das Aminoende an dem freien Ende des Oligonucleotid mit der Vollänge in ein primäres Amin umwandelt, das in dem Gemisch aus Oligonucleotiden reaktiver ist als sekundäre oder tertiäre Amine.
Das Verfahren (200) gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 5, bei dem der Schritt des Aufbringens (211) ohne ein separates Reinigen des Oligonucleotidgemischs gleichzeitig das Oligonucleotid mit der Vollänge, das die Freies-Ende-Verknüpfungsgruppe aufweist, reinigt.
Das Verfahren (200) gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, bei dem das Oligonucleotid-Array 90 oder mehr an Oligonucleotid mit der Vollänge aufweist.
Das Verfahren (200) gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7, bei dem die Verknüpfungsgruppe ein bevorzugtes Anhängungsverhältnis von mindestens 5:1 an der Oberfläche des Arrays im Vergleich zu anderen Gruppen in dem Oligonucleotidgemisch aufweist.
Das Verfahren (200) gemäß einem der Ansprüche 5, 6, 7 oder 8, bei dem der Schritt des Reagierens (208) ferner den Schritt des Stabilisierens (208c) der Phosphitgruppe an dem Phosphitende des aminmodifizierten Phosphoramidits durch Oxidieren der Phosphitgruppe zu einer Phosphatgruppe aufweist.
Das Verfahren (200) gemäß einem der Ansprüche 5, 6, 7, 8 oder 9, bei dem die Aminogruppe an dem aminmodifizierten Phosphoramidit Trifluoracetylamino aufweist.