DE1094743B

DE1094743B - Verfahren zur Herstellung von hydroxylierten Steroiden der 3-Keto-í¸-pregnadienreihe

Info

Publication number: DE1094743B
Application number: DEO5887A
Authority: DE
Inventors: Helen A Kroll; Joseph F Pagano; Richard W Thoma
Original assignee: Olin Corp
Current assignee: Olin Corp
Priority date: 1956-12-07
Filing date: 1957-12-04
Publication date: 1960-12-15

Description

Verfahren zur Herstellung von hydroxylierten Steroiden der 3-Keto-41,4-pregnadienreihe Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1-Dehydrosteroiden der 3-Keto-d 4-pregnenreihe. Diese Derivate sind bekannte Verbindungen, die entweder physiologisch wirksam oder zur Herstellung von physiologisch wirksamen Steroiden nach bekannten Verfahren brauchbar sind.
Es wurde gefunden, daß hydroxylierte Steroide der 3-Keto-d4-pregnenreihe (besonders hydroxylierte 44-Pregnen-3,20-dione) in die entsprechenden Ai,4-Pregnadienderivate übergeführt werden können, indem man die ersteren der Einwirkung von Enzymen einer neuen Bakterienart aussetzt, die hier als Bacterium cyclooxydans bezeichnet wird. Die Einwirkung der Enzyme kann erfolgen, indem entweder das Steroid, Sauerstoff oder die Enzyme von nichtsprossenden Zellen von Bacterium cyclo-oxydans in einem wäßrigen Nährstoffmedium zusammengebracht werden oder (bevorzugt) indem das Steroid einer durchlüfteten Kultur von Bacterium cyclo-oxydans zugesetzt wird.

Die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendete neue Bakterienart Bacterium cyclo-oxydans ist in die American Type Culture Collection, Washington, D. C., aufgenommen worden, wo sie die Bezeichnung Nr.12673 erhalten hat. Von allen bekannten, klassifizierten Bakterienarten ist Bacterium cyclo-oxydans dem Bacterium Zenkeri am ähnlichsten, von dem es wie folgt unterschieden werden kann:

Bacterium cyclo-oxydans I Bacterium Zenkeri

Tritt nicht in Ketten auf Tritt in Ketten auf

Verflüssigt Gelatine Verflüssigt Gelatine nicht

Lackmus wird reduziert keine Veränderung von

und Milch proteolysiert Lackmusmilch

Dürftiges, gelblichgraues Gutes, weißes Wachstum

Wachstum auf Kartoffeln auf Kartoffeln

Dünnes, blaugraues Wachs- Gutes, weißes Wachstum

tum auf Agarhängen auf Agarhängen

Das Bacterium cyclo-oxydans kann ferner durch die

in der folgenden Tabelle zusammengefaßten Eigen-

schaften gekennzeichnet werden

Stäbchen 0,5 bis 0,8 . 1,0 bis 2,0

tritt nicht in Ketten auf,

nach 2tägigem Bebrüten

auf einem Nährstoff-

Agarhang gebildet. Spon-

tan beweglich. Gram-

positiv oder Gramvari-

abel. Nicht säurefest.

Keine Sporenbildung.

Kartoffelhang Gutes, glattes, glänzendes,

durchscheinendes, weißes

Wachstum.

Bennetts-Agar Üppiges, glattes, glänzen-

(Hefeextrakt 1 g, des, flaches, undurch-

Rindfleischextrakt 1 g, sichtiges, weißes Wachs-

Proteinhydrolysat tum. Einzelne Kolonien,

(Handelsbezeichnung klein, mit baumartigem

NZ-Amin A) 2 g, Rand

Glucose 10 g, Agar 15 g,

1 1 destilliertes Wasser,

px 7,3)

Nährstoffagar Gutes, glattes, flaches,

(Rindfleischextrakt 3 g, durchscheinendes, weißes

Pepton 5 g, NaCl 8 g, Wachstum. Ablegerform.

Agar 15 g, 1 1 destilliertes

Wasser, px 7,3)

Nährstoffbrühe Kein Oberflächenwachs-

(Rindfleischextrakt 3 g, tum. Geringe Menge eines

Pepton 5 g, 1 1 destillier- kompakten, weißen Sedi-

tes Wasser, p$ 6,8) ments. Schwach trübe.

Gould-Agar Üppiges, glänzendes, glat-

(Glucose 10 g, tes, flaches, durchschei-

Hefeextrakt 2,5 g, nendes, weißes Wachs-

K, H P O4 1 g, Agar 20 g, tum. Ablegerform.

1 1 destilliertes Wasser)

Lackmusmilch Keine Veränderung nach

-- 1 Woche bei 25°C. Nach

einigen Wochen wird

Lackmus reduziert und

erfolgt Proteolyse.

Gelatine Wird nach 1 Woche bei

25°C teilweise verflüs-

sigt. Vollständige Ver-

flüssigung nach

2 Wochen.

Stärke Keine Hydrolyse.

Gutes Wachstum auf Gould>4gar bei 25, 30 und 372 C. Keine Zersetzung von Tyrosin.

Keine Reduktion von Nitrat.
Keine Bildung von Schwefelwasserstoff. Keine Bildung von Indol.
Keine Bildung von Säure oder Gas aus gewöhnlichen Zuckern oder Zuckeralkoholen (z. B. Glucose, Lactose, Rohrzucker, Maltose und Mannitol).
Die Bedingungen zum Züchten von Bacterium cyclooxydans für die Zwecke der vorliegenden Erfindung (die Bedingungen ausgenommen, die beim Zusetzen des zu dehydrierenden Steroids beachtet werden müssen) sind im allgemeinen die gleichen wie beim Züchten von Bakterien, die zur Herstellung von Antibiotika oder Vitaminen, z. B. von Vitamin Blz oder Bacitracin, verwendet werden sollen; Bacterium cyclo-oxydans wird daher in Berührung mit (in oder auf) einem geeigneten Nährstoffmedium in Gegenwart von Sauerstoff (Luft) gezüchtet.
Ein geeignetes Nährstoffmedium enthält im wesentlichen eine Quelle für stickstoffhaltige Faktoren, assimilierbaren Kohlenstoff und eine Energiequelle. Letztere kann ein Kohlenhydrat, wie Rohrzucker, Melasse, Glucose, Maltose, Stärke oder Dextrin, und/oder das Steroid selbst sein. Bevorzugt enthält das Medium jedoch außer dem Steroid noch assimilierbaren Kohlenstoff und eine Energiequelle.
Die Quelle für Stickstoffaktoren kann organischer (z. B. Sojabohnenmehl, Maiseinweichwasser, Fleischextrakt, Destillationsrückstände, Peptone und/oder Hefeextrakt) oder synthetischer Natur sein, d. h. aus einfachen, synthetisierbaren, organischen und anorganischen Verbindungen, wie Ammoniumsalzen, Alkalinitraten, Aminosäuren oder Harnstoff bestehen.
Zu den hydroxylierten Steroiden der 3-Keto-4 4-pregnenreihe, die nach dem Verfahren dieser Erfindung in die entsprechenden 1-Dehydroderivate übergeführt werden können, gehören Monohydroxyprogesterone, z. B. 11a-Hydroxyprogesteron, die 9a- und 12a-Halogen-1 lß-hydroxyprogesterone, Desoxycorticosteron und 21-Fluor-17a-hydroxyprogesteron; die Dihydroxyprogesterone, z. B. Corticosteron, die 9a- und 12a-Halogencorticosterone, Reichsteins Verbindung S, llß,17a-Dihydroxyprogesteron, Cortison, die 9a- und 12a-Halogencortisone, 21-Fluor-llß,17a-Dihydroxyprogesteron und 9,21-Difluor-llß,17a-Dihydroxyprogesteron; die Trihydroxyprogesterone, z. B. Hydrocortison, (44-Pregnenlla,17a,21-triol-3,20-dion) und die 9a- und 12a-Halogenhydrocortisone und die Tetrahydroxyprogesterone, z. B. 9a-Fluor-16a-hydroxy-hydrocortison, sowie die 21-Esterderivate jener Steroide, die eine 21ständige Hydroxylgruppe enthalten, z. B. Verbindung-S-acetat, Hydrocortison-21-acetat, 9a-Fluorhydrocortison-21-acetat und 9a-Fluorcortison-21-acetat. Von den 21-Esterderivaten werden diejenigen bevorzugt, deren Carbonsäurerest weniger als 10 Kohlenstoffatome enthält, wie Ester von niederen Fettsäuren, z. B. Essig- und Propionsäure, von monocyclischen Arylcarbonsäuren, z. B. Benzoe- und Toluylsäuren, von niederen aliphatischen gesättigten Carbonsäuren mit einem monocyclischen Arylsubstituenten, z. B. Phenylessigsäure und Phenylpropionsäuren, von Cycloalkan- und Cycloalkencarbonsäuren.
Verfahren zur Dehydrierung von 1,2-Dihydrosteroiden in 1-Stellung auf biologischem Wege sind bekannt. Nach dem in Helv. Chim. Acta, 38, S. 835 und 1502 (1955), beschriebenen Verfahren werden Mikroorganismen, wie Fusarium solani oder Calonectrica decora, verwendet, deren Kultur mit einem unmischbaren, nichtwäßrigen Lösungsmittel jedoch nicht extrahiert werden kann. Die nach dem in Journ. Am. Chem. Soc., 77, S. 4184 (1955), beschriebenen Verfahren verwendeten Organismen, und zwar Cornynebacterium simplex, sind verhältnismäßig temperaturempfindlich und können daher nur bei Temperaturen bis zu höchstens 30"C gezüchtet werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Kulturen von Bacterium cyclooxydans können demgegenüber nach einem Gegenstromverfahren leicht extrahiert werden. Ferner können die erfindungsgemäß verwendeten Organismen selbst bei Temperaturen über 37°C gezüchtet werden, so daß in einem Verfahrensgang wesentlich höhere Ausbeuten in kürzerer Zeit erhalten werden können.
Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel 1 41 , 4-Pregnadien-11 a-ol-3,20-dion (a) Gärung Das Oberflächenwachstum einer 3tägigen Agarhangkultur (Rindfleischextrakt 1,5 g, Hefeextrakt 3 g, Pepton 6 g, Glucose 1 g, Agar 20 g, destilliertes Wasser auf 11) von Bacterium cyclo-oxydans A. T. C. C. Nr. 12 673 wird in 5 ccm steriler physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Anteile von 1 ccm dieser Suspension werden verwendet, um vier 50-ccm-Anteile des folgenden Mediums anzuimpfen, das in 250 ccm fassenden konischen Kolben enthalten ist

Glucose ............................. 20 g

Pepton .............................. 5 g

Trypton (durch Trypsin erzeugtes Pepton) 5 g

Hefeextrakt ......................... 5 g

Ca C 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 01,

Destilliertes Wasser . . . . . . . . . . . . . . . auf 1 1

Das geimpfte Medium wird bei 25°C unter rotierendem Schütteln mit 280 Umdrehungen je Minute bei einem Radius von etwa 5 cm bebrütet. Nach 19 Stunden wird eine Übertragung von 6 Volumprozent auf 1950 ccm des folgenden Mediums vorgenommen, das in neununddreißig konischen Kolben enthalten ist, die jeweils 250 ccm fassen:

Hefeextrakt ......................... 1,0 g

Glucose ............................. 1,0 g

KHIP04 . . . . . .. .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . 1,0 g

Destilliertes Wasser . . . . . . . . . . . . . . . auf 1 1

Der pH-Wert wird mit 10°/oiger Natronlauge auf 7,0 eingestellt.

Darauf wird 20 Minuten im Autoklav auf 120°C erhitzt. Das Bebrüten wird, wie oben beschrieben, weitere 24 Stunden fortgesetzt, nachdem jedem der Kolben ein Anteil von 0,5 ccm einer Lösung von 488 mg l la-Hydroxyprogesteron in 19,5 ccm absolutem Methanol zugesetzt worden ist. 3 Stunden nach Zugabe des Steroids wird der Inhalt der Kolben vereinigt, der pH-Wert mit 12 n-Schwefelsäure von 6,7 auf etwa 3 eingestellt, worauf die gesamte Brühe in fließendem Strom 15 Minuten erhitzt und heiß durch ein Seitz-Klärfilter filtriert wird. Die Kolben, das Filter und die Zellen werden mit viermal je 50 ccm heißem Wasser gewaschen. Das Gesamtvolumen von Filtrat und Waschwässern beträgt etwa 1900 ccm. Die papierchromatographische Analyse zeigt, daß das Substrat vollständig umgesetzt worden ist und daß sich zwei Hauptprodukte gebildet haben.
(b) Abtrennung von d1.4-Pregnadien-lla-ol-3,20-dion und 41#4-Pregnadien-11a,20ß-diol-3-on Das vereinigte Filtrat und die Waschwässer (etwa 1900 ccm) werden mit viermal 600 ccm Chloroform extrahiert, worauf das Chloroform bis zur Trockne verdampft wird. Der Rückstand (etwa 540 mg) scheint - nach der papierchromatographischen Analyse - etwa gleiche Mengen d1,4-Pregnadien-lla-ol-3,20-dion und einer polareren Fraktion zu enthalten. Bei fraktioniertem Kristallisieren aus Aceton werden zwei reine Verbindungen erhalten. Die weniger polare Verbindung ist 41.4-Pregnadienl la-ol-3,20-dion, die nach einer weiteren Umkristallisation aus 95°/oigem Äthanol die folgenden Eigenschaften hat: Schmelzpunkt etwa 228 bis 230°C; [a]D = -f-93°(0,43 in Chloroform) ; An;äx. 246 mp. (s = 18 100) ; @n @x°' 2,94 5,89 #t, 6,05 @., 6,19 #t, 6,28 Analyse für C"H"03 (328,44). Berechnet ... C 76,79, H 8,59; gefunden ... C 77,05, H 8,36.
Die stärker polare Substanz, die als 41,4-Pregnadien-11a,20ß-diol-3-on identifiziert wurde, hatte nach dem Umkristallisieren aus Aceton die folgenden Eigenschaften: Schmelzpunkt etwa 227 bis 229°C; [a]D = -41° (0,52 in Chloroform) ; 247 m#t (e = 18 400).
Analyse für C21 H3003 (330,46) Berechnet ... C 76,32, H 9,15; gefunden ... C 76,71, H 8,68.
Beispiel 2 d 1, 4-Pregnadien-1 lß,17a,21-triol-3,20-dion (a) Gärung Wenn das Verfahren von Beispiel 1, Teil (a), wiederholt wird, jedoch das lla-Hydroxyprogesteron durch Hydrocortison ersetzt wird, wird ein Filtrat erhalten, das 1-Dehydrohydrocortison enthält.
(b) Abtrennung von dl#4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion Das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat (etwa 21 von der Gärung, bei der 450 mg Hydrocortison zugesetzt worden sind) wird mit viermal 500 ccm Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformauszüge werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Hexan gewaschen und aus 95°/oigem Äthanol umkristallisiert, wobei ein reines kristallines Produkt erhalten wird, das mit einem auf anderem Wege hergestellten 41,4-Pregnadien-llß,17a,21-triol-3,20-dion (Prednisolon) identisch ist. Beispiel 3 9a-Fluor-d 1,4-pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion (a) Gärung Wenn das Verfahren von Beispiel 1, Teil (a), wiederholt wird, j edoch das 11 a-Hydroxyprogesteron durch 9a-Fluorohydrocortison ersetzt wird, wird ein Filtrat erhalten, das 9a-Fluor-l-dehydrohydrocortison enthält.
(b) Abtrennung von 9a-Fluor-d 1.4-pregnadienl lß,17a,21-triol-3,20-dion Das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat (etwa 21) wird mit viermal 500 ccm Methylisobutylketon extrahiert, worauf die vereinigten Methylisobutylketon-Auszüge im Vakuum zur Trockne eingedampft werden. Der Rückstand wird mit Chloroform ausgelaugt. Nach dem Umkristallisieren des Rückstands aus Methanol wird ein reines 9a-Fluor-41. 4-pregnadien-1 lß,17a,21-triol-3,20-dion erhalten, das mit einer nach einem anderen Verfahren hergestellten Probe identisch ist.
Beispiel 4 d 1, 4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion Wenn in dem Verfahren von Beispiel 1 das 11 a-Hydroxyprogesteron durch Reichsteins Verbindung S (d 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion) ersetzt wird, wird d 1.4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion erhalten, das mit einer nach einem bekannten Verfahren hergestellten Probe identisch ist. Beispiel 5 , d h4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion Wenn das Verfahren von Beispiel 2 wiederholt wird, das Hydrocortison jedoch durch Cortison ersetzt wird, wird d1.4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion erhalten, das mit einer nach einem bekannten Verfahren hergestellten Probe des Prednisons identisch ist.
Beispiel 6 d 1,4-Pregnadien-1 lß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat Wenn das Verfahren von Beispiel 2 wiederholt wird, jedoch das Hydrocortison durch Hydrocortisonacetat ersetzt wird, wird ein d1#4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat erhalten, das mit einer nach einem bekannten Verfahren hergestellten Probe identisch ist.

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung von hydroxylierten Steroiden der 3-Keto-41>4-pregnadienreihe durch Bebrütung eines entsprechenden hydroxylierten Steroids der 3-Keto-44-pregnenreihe in Gegenwart von Sauerstoff mit Enzymen von Mikroorganismen und Abtrennung der entstandenen dehydrierten Steroide, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzyme solche von Bacterium cyclo-oxydans verwendet werden.