DE1094743B

DE1094743B - Process for the production of hydroxylated steroids of the 3-keto-í¸-pregnadiene series

Info

Publication number: DE1094743B
Application number: DEO5887A
Authority: DE
Inventors: Helen A Kroll; Joseph F Pagano; Richard W Thoma
Original assignee: Olin Corp
Current assignee: Olin Corp
Priority date: 1956-12-07
Filing date: 1957-12-04
Publication date: 1960-12-15

Description

Verfahren zur Herstellung von hydroxylierten Steroiden der 3-Keto-41,4-pregnadienreihe Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1-Dehydrosteroiden der 3-Keto-d 4-pregnenreihe. Diese Derivate sind bekannte Verbindungen, die entweder physiologisch wirksam oder zur Herstellung von physiologisch wirksamen Steroiden nach bekannten Verfahren brauchbar sind.Process for the preparation of hydroxylated steroids of the 3-keto-41,4-pregnadiene series The invention relates to a method for producing 1-dehydrosteroids of the 3-keto-d 4-pregnenzeile. These derivatives are known compounds that either physiologically active or for the production of physiologically active steroids are useful by known methods.

Es wurde gefunden, daß hydroxylierte Steroide der 3-Keto-d4-pregnenreihe (besonders hydroxylierte 44-Pregnen-3,20-dione) in die entsprechenden Ai,4-Pregnadienderivate übergeführt werden können, indem man die ersteren der Einwirkung von Enzymen einer neuen Bakterienart aussetzt, die hier als Bacterium cyclooxydans bezeichnet wird. Die Einwirkung der Enzyme kann erfolgen, indem entweder das Steroid, Sauerstoff oder die Enzyme von nichtsprossenden Zellen von Bacterium cyclo-oxydans in einem wäßrigen Nährstoffmedium zusammengebracht werden oder (bevorzugt) indem das Steroid einer durchlüfteten Kultur von Bacterium cyclo-oxydans zugesetzt wird.It has been found that hydroxylated steroids of the 3-keto-d4-pregnenlinie (particularly hydroxylated 44-pregnene-3,20-diones) into the corresponding Ai, 4-pregnadiene derivatives can be transferred by exposing the former to the action of enzymes one exposing a new type of bacteria, referred to here as Bacterium cyclooxydans. The action of the enzymes can be done by either the steroid, oxygen or the enzymes of non-sprouting cells of Bacterium cyclo-oxydans in one aqueous nutrient medium or (preferably) by adding the steroid is added to an aerated culture of Bacterium cyclo-oxydans.

Die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendete neue Bakterienart Bacterium cyclo-oxydans ist in die American Type Culture Collection, Washington, D. C., aufgenommen worden, wo sie die Bezeichnung Nr.12673 erhalten hat. Von allen bekannten, klassifizierten Bakterienarten ist Bacterium cyclo-oxydans dem Bacterium Zenkeri am ähnlichsten, von dem es wie folgt unterschieden werden kann: Bacterium cyclo-oxydans I Bacterium Zenkeri Tritt nicht in Ketten auf Tritt in Ketten auf Verflüssigt Gelatine Verflüssigt Gelatine nicht Lackmus wird reduziert keine Veränderung von und Milch proteolysiert Lackmusmilch Dürftiges, gelblichgraues Gutes, weißes Wachstum Wachstum auf Kartoffeln auf Kartoffeln Dünnes, blaugraues Wachs- Gutes, weißes Wachstum tum auf Agarhängen auf Agarhängen Das Bacterium cyclo-oxydans kann ferner durch die in der folgenden Tabelle zusammengefaßten Eigen- schaften gekennzeichnet werden Stäbchen 0,5 bis 0,8 . 1,0 bis 2,0 tritt nicht in Ketten auf, nach 2tägigem Bebrüten auf einem Nährstoff- Agarhang gebildet. Spon- tan beweglich. Gram- positiv oder Gramvari- abel. Nicht säurefest. Keine Sporenbildung. Kartoffelhang Gutes, glattes, glänzendes, durchscheinendes, weißes Wachstum. Bennetts-Agar Üppiges, glattes, glänzen- (Hefeextrakt 1 g, des, flaches, undurch- Rindfleischextrakt 1 g, sichtiges, weißes Wachs- Proteinhydrolysat tum. Einzelne Kolonien, (Handelsbezeichnung klein, mit baumartigem NZ-Amin A) 2 g, Rand Glucose 10 g, Agar 15 g, 1 1 destilliertes Wasser, px 7,3) Nährstoffagar Gutes, glattes, flaches, (Rindfleischextrakt 3 g, durchscheinendes, weißes Pepton 5 g, NaCl 8 g, Wachstum. Ablegerform. Agar 15 g, 1 1 destilliertes Wasser, px 7,3) Nährstoffbrühe Kein Oberflächenwachs- (Rindfleischextrakt 3 g, tum. Geringe Menge eines Pepton 5 g, 1 1 destillier- kompakten, weißen Sedi- tes Wasser, p$ 6,8) ments. Schwach trübe. Gould-Agar Üppiges, glänzendes, glat- (Glucose 10 g, tes, flaches, durchschei- Hefeextrakt 2,5 g, nendes, weißes Wachs- K, H P O4 1 g, Agar 20 g, tum. Ablegerform. 1 1 destilliertes Wasser) Lackmusmilch Keine Veränderung nach -- 1 Woche bei 25°C. Nach einigen Wochen wird Lackmus reduziert und erfolgt Proteolyse. Gelatine Wird nach 1 Woche bei 25°C teilweise verflüs- sigt. Vollständige Ver- flüssigung nach 2 Wochen. Stärke Keine Hydrolyse. Gutes Wachstum auf Gould>4gar bei 25, 30 und 372 C. Keine Zersetzung von Tyrosin.The new bacterium, Bacterium cyclo-oxydans, used in the practice of the present invention has been incorporated into the American Type Culture Collection, Washington, DC, where it has been designated No. 12673. Of all known, classified bacterial species, Bacterium cyclo-oxydans is most similar to Bacterium Zenkeri, from which it can be distinguished as follows: Bacterium cyclo-oxydans I Bacterium Zenkeri Do not appear in chains. Do not appear in chains Liquefies gelatin Does not liquefy gelatin Litmus is reduced by no change and milk proteolyzes litmus milk Poor, yellowish-gray, good, white growth Growth on potatoes on potatoes Thin, blue-gray wax. Good white growth tum on agar slopes on agar slopes The Bacterium cyclo-oxydans can also by properties summarized in the following table properties are marked Chopsticks 0.5 to 0.8. 1.0 to 2.0 does not appear in chains, after 2 days of incubation on a nutrient Agar slope formed. Spontaneous tan agile. Grief positive or grievous abel. Not acid-proof. No spore formation. Potato slope good, smooth, shiny, translucent, white Growth. Bennett's Agar Lush, smooth, shiny (Yeast extract 1 g, des, flat, impervious Beef extract 1 g, visible, white wax Protein hydrolyzate tum. Single colonies, (Trade name small, with tree-like NZ-Amin A) 2 g, rim Glucose 10 g, agar 15 g, 1 1 distilled water, px 7.3) Nutrient agar good, smooth, flat, (Beef extract 3 g, translucent, white Peptone 5 g, NaCl 8 g, growth. Offshoot form. Agar 15 g, 1 1 distilled Water, px 7.3) Nutrient broth No surface wax (Beef extract 3 g, tum. Small amount of a Peptone 5 g, 1 1 distilled compact, white sedi- tes water, p $ 6.8) ments. Slightly cloudy. Gould agar Lush, shiny, smooth (Glucose 10 g, tes, flat, translucent Yeast extract 2.5 g, nendes, white wax K, HP O4 1 g, agar 20 g, tum. Offshoot form. 1 1 distilled water) Litmus milk No change after - 1 week at 25 ° C. To some weeks will Litmus reduced and occurs proteolysis. Gelatin is used after 1 week 25 ° C partially liquefied sigt. Complete liquid after 2 weeks. Starch No hydrolysis. Good growth on Gould> 4gar at 25, 30 and 372 C. No decomposition of tyrosine.

Keine Reduktion von Nitrat.No reduction of nitrate.

Keine Bildung von Schwefelwasserstoff. Keine Bildung von Indol.No formation of hydrogen sulfide. No formation of indole.

Keine Bildung von Säure oder Gas aus gewöhnlichen Zuckern oder Zuckeralkoholen (z. B. Glucose, Lactose, Rohrzucker, Maltose und Mannitol).No acid or gas formation from common sugars or sugar alcohols (e.g. glucose, lactose, cane sugar, maltose and mannitol).

Die Bedingungen zum Züchten von Bacterium cyclooxydans für die Zwecke der vorliegenden Erfindung (die Bedingungen ausgenommen, die beim Zusetzen des zu dehydrierenden Steroids beachtet werden müssen) sind im allgemeinen die gleichen wie beim Züchten von Bakterien, die zur Herstellung von Antibiotika oder Vitaminen, z. B. von Vitamin Blz oder Bacitracin, verwendet werden sollen; Bacterium cyclo-oxydans wird daher in Berührung mit (in oder auf) einem geeigneten Nährstoffmedium in Gegenwart von Sauerstoff (Luft) gezüchtet.Conditions for growing Bacterium cyclooxydans for the purpose of the present invention (excluding the conditions involved in adding the to dehydrating steroid) are generally the same like growing bacteria that are used to make antibiotics or vitamins, z. B. of vitamin Blz or bacitracin are to be used; Bacterium cyclo-oxydans is therefore in contact with (in or on) a suitable nutrient medium in the presence bred from oxygen (air).

Ein geeignetes Nährstoffmedium enthält im wesentlichen eine Quelle für stickstoffhaltige Faktoren, assimilierbaren Kohlenstoff und eine Energiequelle. Letztere kann ein Kohlenhydrat, wie Rohrzucker, Melasse, Glucose, Maltose, Stärke oder Dextrin, und/oder das Steroid selbst sein. Bevorzugt enthält das Medium jedoch außer dem Steroid noch assimilierbaren Kohlenstoff und eine Energiequelle.A suitable nutrient medium essentially contains a source for nitrogenous factors, assimilable carbon and an energy source. The latter can be a carbohydrate such as cane sugar, molasses, glucose, maltose, starch or dextrin, and / or the steroid itself. However, the medium preferably contains besides the steroid still assimilable carbon and an energy source.

Die Quelle für Stickstoffaktoren kann organischer (z. B. Sojabohnenmehl, Maiseinweichwasser, Fleischextrakt, Destillationsrückstände, Peptone und/oder Hefeextrakt) oder synthetischer Natur sein, d. h. aus einfachen, synthetisierbaren, organischen und anorganischen Verbindungen, wie Ammoniumsalzen, Alkalinitraten, Aminosäuren oder Harnstoff bestehen.The source of nitrogen actuators can be organic (e.g. soybean meal, Maize soaking water, meat extract, distillation residues, peptones and / or yeast extract) or be synthetic in nature, d. H. from simple, synthesizable, organic and inorganic compounds such as ammonium salts, alkali nitrates, amino acids or urea.

Zu den hydroxylierten Steroiden der 3-Keto-4 4-pregnenreihe, die nach dem Verfahren dieser Erfindung in die entsprechenden 1-Dehydroderivate übergeführt werden können, gehören Monohydroxyprogesterone, z. B. 11a-Hydroxyprogesteron, die 9a- und 12a-Halogen-1 lß-hydroxyprogesterone, Desoxycorticosteron und 21-Fluor-17a-hydroxyprogesteron; die Dihydroxyprogesterone, z. B. Corticosteron, die 9a- und 12a-Halogencorticosterone, Reichsteins Verbindung S, llß,17a-Dihydroxyprogesteron, Cortison, die 9a- und 12a-Halogencortisone, 21-Fluor-llß,17a-Dihydroxyprogesteron und 9,21-Difluor-llß,17a-Dihydroxyprogesteron; die Trihydroxyprogesterone, z. B. Hydrocortison, (44-Pregnenlla,17a,21-triol-3,20-dion) und die 9a- und 12a-Halogenhydrocortisone und die Tetrahydroxyprogesterone, z. B. 9a-Fluor-16a-hydroxy-hydrocortison, sowie die 21-Esterderivate jener Steroide, die eine 21ständige Hydroxylgruppe enthalten, z. B. Verbindung-S-acetat, Hydrocortison-21-acetat, 9a-Fluorhydrocortison-21-acetat und 9a-Fluorcortison-21-acetat. Von den 21-Esterderivaten werden diejenigen bevorzugt, deren Carbonsäurerest weniger als 10 Kohlenstoffatome enthält, wie Ester von niederen Fettsäuren, z. B. Essig- und Propionsäure, von monocyclischen Arylcarbonsäuren, z. B. Benzoe- und Toluylsäuren, von niederen aliphatischen gesättigten Carbonsäuren mit einem monocyclischen Arylsubstituenten, z. B. Phenylessigsäure und Phenylpropionsäuren, von Cycloalkan- und Cycloalkencarbonsäuren.To the hydroxylated steroids of the 3-keto-4 4-pregnen series, which according to converted into the corresponding 1-dehydro derivatives by the process of this invention include monohydroxyprogesterones, e.g. B. 11a-hydroxyprogesterone, the 9a- and 12a-halo-1 lβ-hydroxyprogesterone, deoxycorticosterone and 21-fluoro-17a-hydroxyprogesterone; the dihydroxyprogesterones, e.g. B. corticosterone, the 9a- and 12a-halocorticosterones, Reichstein's compound S, llß, 17a-dihydroxyprogesterone, cortisone, the 9a- and 12a-halocortisones, 21-fluoro-11ß, 17a-dihydroxyprogesterone and 9,21-difluoro-11ß, 17a-dihydroxyprogesterone; the trihydroxyprogesterones, e.g. B. Hydrocortisone, (44-Pregnenlla, 17a, 21-triol-3,20-dione) and the 9a and 12a halohydrocortisones and the tetrahydroxyprogesterones, e.g. B. 9a-fluoro-16a-hydroxy-hydrocortisone, as well as the 21-ester derivatives of those steroids that contain a 21 hydroxyl group, e.g. B. Compound-S-acetate, hydrocortisone-21-acetate, 9a-fluorohydrocortisone-21-acetate and 9a-fluorocortisone-21-acetate. Of the 21 ester derivatives those whose carboxylic acid residue are less than 10 carbon atoms are preferred contains, such as esters of lower fatty acids, e.g. B. acetic and propionic acid, of monocyclic Aryl carboxylic acids, e.g. B. benzoic and toluic acids, of lower aliphatic saturated Carboxylic acids having a monocyclic aryl substituent, e.g. B. phenylacetic acid and phenylpropionic acids, from cycloalkanoic and cycloalkene carboxylic acids.

Verfahren zur Dehydrierung von 1,2-Dihydrosteroiden in 1-Stellung auf biologischem Wege sind bekannt. Nach dem in Helv. Chim. Acta, 38, S. 835 und 1502 (1955), beschriebenen Verfahren werden Mikroorganismen, wie Fusarium solani oder Calonectrica decora, verwendet, deren Kultur mit einem unmischbaren, nichtwäßrigen Lösungsmittel jedoch nicht extrahiert werden kann. Die nach dem in Journ. Am. Chem. Soc., 77, S. 4184 (1955), beschriebenen Verfahren verwendeten Organismen, und zwar Cornynebacterium simplex, sind verhältnismäßig temperaturempfindlich und können daher nur bei Temperaturen bis zu höchstens 30"C gezüchtet werden.Process for the dehydration of 1,2-dihydrosteroids in the 1-position by biological means are known. After that in Helv. Chim. Acta, 38, p. 835 and 1502 (1955), methods described are microorganisms such as Fusarium solani or Calonectrica decora, whose culture is used with an immiscible, non-aqueous However, solvent cannot be extracted. The after the in Journ. At the. Chem. Soc., 77, p. 4184 (1955), organisms used Cornynebacterium simplex, are relatively temperature-sensitive and can therefore only be grown at temperatures up to a maximum of 30 "C.

Die erfindungsgemäß verwendeten Kulturen von Bacterium cyclooxydans können demgegenüber nach einem Gegenstromverfahren leicht extrahiert werden. Ferner können die erfindungsgemäß verwendeten Organismen selbst bei Temperaturen über 37°C gezüchtet werden, so daß in einem Verfahrensgang wesentlich höhere Ausbeuten in kürzerer Zeit erhalten werden können.The cultures of Bacterium cyclooxydans used according to the invention on the other hand, can be easily extracted by a countercurrent method. Further the organisms used according to the invention can even at temperatures above 37.degree are grown, so that in one process, much higher yields in can be obtained in a shorter time.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.The following examples explain the process according to the invention.

Beispiel 1 41 , 4-Pregnadien-11 a-ol-3,20-dion (a) Gärung Das Oberflächenwachstum einer 3tägigen Agarhangkultur (Rindfleischextrakt 1,5 g, Hefeextrakt 3 g, Pepton 6 g, Glucose 1 g, Agar 20 g, destilliertes Wasser auf 11) von Bacterium cyclo-oxydans A. T. C. C. Nr. 12 673 wird in 5 ccm steriler physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Anteile von 1 ccm dieser Suspension werden verwendet, um vier 50-ccm-Anteile des folgenden Mediums anzuimpfen, das in 250 ccm fassenden konischen Kolben enthalten ist Glucose ............................. 20 g Pepton .............................. 5 g Trypton (durch Trypsin erzeugtes Pepton) 5 g Hefeextrakt ......................... 5 g Ca C 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 01, Destilliertes Wasser . . . . . . . . . . . . . . . auf 1 1 Das geimpfte Medium wird bei 25°C unter rotierendem Schütteln mit 280 Umdrehungen je Minute bei einem Radius von etwa 5 cm bebrütet. Nach 19 Stunden wird eine Übertragung von 6 Volumprozent auf 1950 ccm des folgenden Mediums vorgenommen, das in neununddreißig konischen Kolben enthalten ist, die jeweils 250 ccm fassen: Hefeextrakt ......................... 1,0 g Glucose ............................. 1,0 g KHIP04 . . . . . .. .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . 1,0 g Destilliertes Wasser . . . . . . . . . . . . . . . auf 1 1 Der pH-Wert wird mit 10°/oiger Natronlauge auf 7,0 eingestellt.Example 1 41, 4-Pregnadien-11 a-ol-3,20-dione (a) Fermentation The surface growth of a 3-day agar slope culture (beef extract 1.5 g, yeast extract 3 g, peptone 6 g, glucose 1 g, agar 20 g, Distilled water on 11) of Bacterium cyclo-oxydans ATCC No. 12 673 is suspended in 5 cc of sterile physiological saline solution. 1 cc portions of this suspension are used to inoculate four 50 cc portions of the following medium contained in 250 cc conical flasks Glucose ............................. 20 g Peptone .............................. 5 g Tryptone (trypsin produced peptone) 5 g Yeast extract ......................... 5 g Ca C 03. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.25 01, Distilled water . . . . . . . . . . . . . . . on 1 1 The inoculated medium is incubated at 25 ° C. with rotating shaking at 280 revolutions per minute with a radius of about 5 cm. After 19 hours, a transfer of 6 percent by volume to 1950 cc of the following medium is made, which is contained in thirty-nine conical flasks, each holding 250 cc: Yeast extract ......................... 1.0 g Glucose ............................. 1.0 g KHIP04. . . . . .. ... . . . . . . ... . . . . . . . . . 1.0 g Distilled water . . . . . . . . . . . . . . . on 1 1 The pH is adjusted to 7.0 with 10% sodium hydroxide solution.

Darauf wird 20 Minuten im Autoklav auf 120°C erhitzt. Das Bebrüten wird, wie oben beschrieben, weitere 24 Stunden fortgesetzt, nachdem jedem der Kolben ein Anteil von 0,5 ccm einer Lösung von 488 mg l la-Hydroxyprogesteron in 19,5 ccm absolutem Methanol zugesetzt worden ist. 3 Stunden nach Zugabe des Steroids wird der Inhalt der Kolben vereinigt, der pH-Wert mit 12 n-Schwefelsäure von 6,7 auf etwa 3 eingestellt, worauf die gesamte Brühe in fließendem Strom 15 Minuten erhitzt und heiß durch ein Seitz-Klärfilter filtriert wird. Die Kolben, das Filter und die Zellen werden mit viermal je 50 ccm heißem Wasser gewaschen. Das Gesamtvolumen von Filtrat und Waschwässern beträgt etwa 1900 ccm. Die papierchromatographische Analyse zeigt, daß das Substrat vollständig umgesetzt worden ist und daß sich zwei Hauptprodukte gebildet haben.This is followed by heating to 120 ° C. in an autoclave for 20 minutes. The incubation continues as described above for an additional 24 hours after each of the flasks a portion of 0.5 cc of a solution of 488 mg of 1 la-hydroxyprogesterone in 19.5 cc absolute methanol has been added. 3 hours after adding the steroid will be the contents of the flasks combined, the pH value with 12 N sulfuric acid of 6.7 set about 3, after which the entire broth is heated in a flowing stream for 15 minutes and filtered hot through a Seitz clarifying filter. The pistons that filter and the cells are washed four times with 50 cc hot water each time. The total volume of filtrate and washing water is about 1900 ccm. The paper chromatographic Analysis shows that the substrate has completely reacted and that two Have made major products.

(b) Abtrennung von d1.4-Pregnadien-lla-ol-3,20-dion und 41#4-Pregnadien-11a,20ß-diol-3-on Das vereinigte Filtrat und die Waschwässer (etwa 1900 ccm) werden mit viermal 600 ccm Chloroform extrahiert, worauf das Chloroform bis zur Trockne verdampft wird. Der Rückstand (etwa 540 mg) scheint - nach der papierchromatographischen Analyse - etwa gleiche Mengen d1,4-Pregnadien-lla-ol-3,20-dion und einer polareren Fraktion zu enthalten. Bei fraktioniertem Kristallisieren aus Aceton werden zwei reine Verbindungen erhalten. Die weniger polare Verbindung ist 41.4-Pregnadienl la-ol-3,20-dion, die nach einer weiteren Umkristallisation aus 95°/oigem Äthanol die folgenden Eigenschaften hat: Schmelzpunkt etwa 228 bis 230°C; [a]D = -f-93°(0,43 in Chloroform) ; An;äx. 246 mp. (s = 18 100) ; @n @x°' 2,94 5,89 #t, 6,05 @., 6,19 #t, 6,28 Analyse für C"H"03 (328,44). Berechnet ... C 76,79, H 8,59; gefunden ... C 77,05, H 8,36.(b) Separation of d1.4-Pregnadien-lla-ol-3,20-dione and 41 # 4-Pregnadien-11a, 20ß-diol-3-one The combined filtrate and the washing water (about 1900 ccm) are with four times 600 cc of chloroform is extracted, whereupon the chloroform is evaporated to dryness. According to the paper chromatographic analysis, the residue (about 540 mg) appears to contain about equal amounts of d1,4-pregnadien-lla-ol-3,20-dione and a more polar fraction. Fractional crystallization from acetone gives two pure compounds. The less polar compound is 41.4-Pregnadienl la-ol-3,20-dione, which after further recrystallization from 95% ethanol has the following properties: melting point about 228 to 230 ° C; [a] D = -f -93 ° (0.43 in chloroform); At; äx. 246 mp. (s = 18,100); @n @ x ° '2.94 5.89 #t, 6.05 @., 6.19 #t, 6.28 Analysis for C "H" 03 (328.44). Calculated ... C 76.79, H 8.59; Found ... C 77.05, H 8.36.

Die stärker polare Substanz, die als 41,4-Pregnadien-11a,20ß-diol-3-on identifiziert wurde, hatte nach dem Umkristallisieren aus Aceton die folgenden Eigenschaften: Schmelzpunkt etwa 227 bis 229°C; [a]D = -41° (0,52 in Chloroform) ; 247 m#t (e = 18 400).The more polar substance called 41,4-pregnadien-11a, 20ß-diol-3-one identified, after recrystallization from acetone, had the following properties: Melting point about 227 to 229 ° C; [a] D = -41 ° (0.52 in chloroform); 247 m # t (e = 18 400).

Analyse für C21 H3003 (330,46) Berechnet ... C 76,32, H 9,15; gefunden ... C 76,71, H 8,68.Analysis for C21 H3003 (330.46) Calculated ... C 76.32, H 9.15; found ... C 76.71, H 8.68.

Beispiel 2 d 1, 4-Pregnadien-1 lß,17a,21-triol-3,20-dion (a) Gärung Wenn das Verfahren von Beispiel 1, Teil (a), wiederholt wird, jedoch das lla-Hydroxyprogesteron durch Hydrocortison ersetzt wird, wird ein Filtrat erhalten, das 1-Dehydrohydrocortison enthält.Example 2 d 1,4-Pregnadien-1ß, 17a, 21-triol-3,20-dione (a) Fermentation If the procedure of Example 1, part (a) is repeated, but the IIa-hydroxyprogesterone is replaced by hydrocortisone, a filtrate is obtained, the 1-dehydrohydrocortisone contains.

(b) Abtrennung von dl#4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion Das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat (etwa 21 von der Gärung, bei der 450 mg Hydrocortison zugesetzt worden sind) wird mit viermal 500 ccm Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformauszüge werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Hexan gewaschen und aus 95°/oigem Äthanol umkristallisiert, wobei ein reines kristallines Produkt erhalten wird, das mit einem auf anderem Wege hergestellten 41,4-Pregnadien-llß,17a,21-triol-3,20-dion (Prednisolon) identisch ist. Beispiel 3 9a-Fluor-d 1,4-pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion (a) Gärung Wenn das Verfahren von Beispiel 1, Teil (a), wiederholt wird, j edoch das 11 a-Hydroxyprogesteron durch 9a-Fluorohydrocortison ersetzt wird, wird ein Filtrat erhalten, das 9a-Fluor-l-dehydrohydrocortison enthält.(b) Separation of dl # 4-pregnadiene-11β, 17a, 21-triol-3,20-dione Das filtrate combined with the wash water (about 21 from fermentation, at which 450 mg hydrocortisone have been added) is extracted with four times 500 ccm of chloroform. The United Chloroform extracts are evaporated to dryness in vacuo, the residue with hexane washed and recrystallized from 95% ethanol, a pure crystalline Product is obtained which is obtained with a 41,4-pregnadiene-llß, 17a, 21-triol-3,20-dione prepared in another way (Prednisolone) is identical. Example 3 9a-fluoro-d 1,4-pregnadiene-11β, 17a, 21-triol-3,20-dione (a) Fermentation If the procedure of Example 1, part (a) is repeated, however the 11 a-hydroxyprogesterone is replaced by 9a-fluorohydrocortisone, becomes a Obtained filtrate containing 9a-fluoro-1-dehydrohydrocortisone.

(b) Abtrennung von 9a-Fluor-d 1.4-pregnadienl lß,17a,21-triol-3,20-dion Das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat (etwa 21) wird mit viermal 500 ccm Methylisobutylketon extrahiert, worauf die vereinigten Methylisobutylketon-Auszüge im Vakuum zur Trockne eingedampft werden. Der Rückstand wird mit Chloroform ausgelaugt. Nach dem Umkristallisieren des Rückstands aus Methanol wird ein reines 9a-Fluor-41. 4-pregnadien-1 lß,17a,21-triol-3,20-dion erhalten, das mit einer nach einem anderen Verfahren hergestellten Probe identisch ist.(b) Separation of 9a-fluoro-d 1,4-pregnadiene-lß, 17a, 21-triol-3,20-dione The filtrate (about 21) combined with the washing water is mixed with four times 500 cc of methyl isobutyl ketone extracted, whereupon the combined methyl isobutyl ketone extracts in vacuo to dryness be evaporated. The residue is leached with chloroform. After recrystallization the residue from methanol becomes a pure 9a-fluoro-41. 4-pregnadiene-lβ, 17a, 21-triol-3,20-dione obtained which is identical to a sample prepared by a different process is.

Beispiel 4 d 1, 4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion Wenn in dem Verfahren von Beispiel 1 das 11 a-Hydroxyprogesteron durch Reichsteins Verbindung S (d 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion) ersetzt wird, wird d 1.4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion erhalten, das mit einer nach einem bekannten Verfahren hergestellten Probe identisch ist. Beispiel 5 , d h4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion Wenn das Verfahren von Beispiel 2 wiederholt wird, das Hydrocortison jedoch durch Cortison ersetzt wird, wird d1.4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion erhalten, das mit einer nach einem bekannten Verfahren hergestellten Probe des Prednisons identisch ist.Example 4 d 1,4-Pregnadiene-17a, 21-diol-3,20-dione When in the procedure from Example 1 the 11 a-hydroxyprogesterone by Reichstein's compound S (d 4-pregnen-17a, 21-diol-3,20-dione) is replaced, is obtained d 1.4-Pregnadiene-17a, 21-diol-3,20-dione, which with a sample prepared by a known method is identical. Example 5, i.e. h4-pregnadiene-17a, 21-diol-3,11,20-trione When the procedure of Example 2 is repeated but the hydrocortisone is replaced by cortisone, becomes d1.4-pregnadien-17a, 21-diol-3,11,20-trione obtained with a sample of prednisone prepared by a known method is identical.

Beispiel 6 d 1,4-Pregnadien-1 lß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat Wenn das Verfahren von Beispiel 2 wiederholt wird, jedoch das Hydrocortison durch Hydrocortisonacetat ersetzt wird, wird ein d1#4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat erhalten, das mit einer nach einem bekannten Verfahren hergestellten Probe identisch ist.Example 6 d 1,4-Pregnadiene-11, 17a, 21-triol-3,20-dione-21-acetate If the procedure of Example 2 is repeated, however, the hydrocortisone is through Hydrocortisone acetate is replaced, becomes a d1 # 4-pregnadiene-11ß, 17a, 21-triol-3,20-dione-21-acetate obtained identical to a sample prepared by a known method is.

Claims

PATENT CLAIM: Process for the production of hydroxylated steroids the 3-keto-41> 4-pregnadiene series by incubating a corresponding hydroxylated Steroids of the 3-keto-44-pregnenzeile in the presence of oxygen with enzymes from Microorganisms and separation of the resulting dehydrated steroids, characterized in that that the enzymes used are those of Bacterium cyclo-oxydans.