DE1693041C - Steroid Oxazoline und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Sieroid-Oxa.-.olineder Formel CII₁R

co _vl

C -

worin R entweder Wasserstoff, die Hydroxyl- oder Aceloxygruppe und R' Wasserstoff oder den Methylrest bedeutet.

Die neuen Verbindungen besitzen als entzündungshemmende und hormonähnlichc Mittel einen hohen Grad an pharm ikologischer Wirksamkeit.

Das erfindungsgemüße Verfahien zur Herstellung der neuen Stcroid-Oxazoline besteht darin, daß man ein Steroid-Oxazolin der Formel

CH,R CO

I /

t I

C R'

in der R und R' die oben angegebene Bedeutung haben, durch Fermentation mit Curvularia lunata NRRL 2380 b/w. Cunninghamclla blaekesleeana NRRL8688A bzw. Absidia orchidis ATCC^-6647 enzymatisch hydroxylieri

Zur Durchführung dieses Verfahrens züchtet man die genannten Mikroorganismen und läßt sie unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Nährmcdium auf ein Steroid-Oxazolin der vorstehenden Formel einwirken. Auf Grund der Oxydationswirkung der durch die Mikroorganismen gebildeten Enzyme wird hierbei in die 11-Stellung des Steroid-Oxazolins eine Hydroxygruppe eingeführt.

Ein geeignetes Nährmedium muß eine Kohletistoif- und eine Stickstoffquelle sowie mineralische Grundstoffe enthalten. Brauchbare Kohlcnstoffi|uellen sind Stärke, Dextrose. Saccharose. Galactose. Xylose. Glycerin und andere Kohlehydrate und mehrwertige Alkohole, sowie andere natürliche Kohlehydratquellen, wie Maisquellwasser. Baumwollsatmehl. Zu den brauchbaren Slicksloffquellcn gehören einige der obengenannten Stoffe, wie z. B. Maisqucllwasser, Baumwollsatmchl. andere Substanzen, wie Rindfleisehexlrakl, Mcfc, Peptone, Aminosäuren, im allgemeinen enzymatisch hydrolysierte Proteine und andere proteinhaltige Stoffe. Auch anorganische Stick stoffquellen, wie Harnstoff, Nitrate, Ammoniumsalze u. dgl., sind verwendbar.

Die erforderlichen Minerale sind entweder in den gleichen oben angeführten Stoffen, wenn sie in rohem Zustand verwendet werden, oder im Wasser, das zur Herstellung des Mediums verwendet wird, vorhanden. Soll das Medium einen Zusatz erhalten, wird eine geeignete Menge anorganischer Substanzen, wie Phosphat, Sulfat, Chlorid, Alkali- und Erdalkalimetalle. Eisen, Mangan, Kobalt zugesetzt, mn das Medium mil Kationen und Anionen zu versehen.

Das Steroid, das der I !-Hydroxylierung ausgesetzt werden soll, kann man vor oder nach Impfen des Mediums mit der Kultur des Mikroorganismus zusetzen.

Die Fermentierung wird dann bei einer Temperatur zwischen etwa 26 und 32 C 12 bis 12» Stunden fongesetzt. Nach Beendigung der Fermenlierung \sird gegebenenfalls das Medium vom Myzel ablillricrt. das 11-hydroxy lierte Steroid mit einem wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel, in dem sich das Steroid löst, extrahiert und anschließend der organische Extrakt im Vakuum bis zur Trockne oder /u einem kleinen Volumen eingedampft. Im letzteren Fall bildet sich durch den Zusatz eines mit dem zur Extraktion verwendeten Lösungsmittel :; ischhareii Lösungsmittels, in dem das Steroid jedoch unlöslich ist, zur konzentrierten Steroidlösiing ein Niederschlag des Produktes. Dieser kann anschließend chromatographisch oder durch ein anderes geeignetes Verfahren wie Umkrisiallisation. gereinigt werden.

Nach einer weiteren Verfahrensweise wird nach Erzielung eines guten Myzelwuchses in einem Medium der angeführten Zusammensetzung ein Teil des Myzels abgetrennt und in eine Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 7,0 und 7.5 übergeführt, wo es mit dem umzuwandelnden Steroid in Berührung gebracht wird. Das Steroid wird anschließend, wie oben beschrieben, durch Extraktion aus der Flüssigkeit isoliert.

Im Vergleich mit anderen bekannten, die gleichen pharmakologischen Eigenschaften besitzenden Sleroiden, wie Hydrocortison. zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen vine starke entzündungshemmende Wirksamkeit. Die Ergebnisse dieser Wirksamkeit, die bei Granulompcllets in Ratten ausgewertet wurden, sind aus TaOeIIe I ersichtlich. Die in IO%igem Gunimiarabikum gelösten oder aufgeschläinmtcn Produkte wurden männlichen, etwa 120 bis 150 g wiegenden Wistar-Ratten oral verabreicht.

Tabelle I

Verbindung des Beispiels

3
Hydrocortison

Doms

in ηιμ kg

per «»-,

Z.ihl der Γ Ii rf

Ahn.ihiue des (lunulonis in ".

3^l).6
34

1H.4
■»5

Es wurde festgestellt, d.iß die Verbindung des Beispiels 3 zudem eine gluconcogcnclischc Wirksamkeit aufwies. Die Versuche wurden entsprechend der

fco von Olsen u.a. \\\ Endocrinol 35 (1944). S. 40, beschriebenen Methode an surreclomisierten männlichen Wistar-Ratten durchgeführt. Vergleicht man die Ergebnisse der erlindungsgemäßcn Verbindung mit dem Ergebnis, das mit Hydrocortison unter den gleichen Versuchsbedingungen erziell wurde, stellt man ejne größere Wirksamkeit des ersleren fest. Die lolgende Tabelle Il faßt die in beiden Fällen gefundenen Ergebnisse zusammen.

I 693 041

Γίΐhelle II

ti Cs Hl¹J. (M

Hydrocoriison

Konirollversuche

in : Hiii Ιιιμ π;11

500
2000

500
2000

Zillll OlT KiIlL-Il

10
10
10
10
10

ι S.li.-lny prn HKl μ UlT K	'.)(ilUL'll-|l! I iL-w kill ;||U	1.14
12,84	t	2.34
3 3,71J	I	0.1J 7
7,04	-fc	1.43
20.05	(-	0.46
1.18	fc

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel I

Pregn-4-e»-11//.21-dinl-3.20-dion-[ 17u.J6.i-dl-2-methyloxazolin-21-acetal

Mehrere 500-ml-Erlenmeyerkolhen. von denen jeder 100 ml des folgenden Nährmediums enthielt:

Dextrose 10.0 g

Sojahohnenmehl 5.0 g

Pepton 5.0 g

Busumin Busch 3.0 g

KH₁PO, 5.0 g

NaCI 5.0 g

Silikonöl 0.1 ml

mit destilliertem Wasser /u I 1 aufgefüllt (wobei der pH-Wert vor der Sterilisation η.,ί NaC)H auf pH 68 eingestellt wird), werden mit einer 4 Tage alten Schrüg-Kultur von Curvularia lunata NRRL 2380 geimpft Nach 24stündiger Inkubationszeit bei 28 C auf einem rotierenden Schüttelgerät (250IJ Min.) wird ein gutes My/ehvachstum erzielt.

4 I eines Mediums der angegebenen Zusammensetzung werden in einem Vorfermentationsgefäß mit 5 Volumprozent (V V) der vorstehend erhaltenen Kultur geimpft und unter folgenden Bedingungen inkubiert: 1.5 1 Luft pro Liter Medium pro Minute (1.5 1 1 Min ). Rührgeschwindigkeit 8(K) U Min.. Temperatur 28 C. Zeit 24 Stunden

In einem neuen Fcrmentationsgefäß werden 4 I des gleichen, vorstehend beschriebenen Mediums mit 2(X) ml der bei der vorstehenden Fermentierung entstandenen Niihrbrühe geimpft Die Fcrmcniierung wird unter gleichen Bedingungen durchgeführt wie in der vorhergehenden Stufe Nach 24 Stunden wird das Myzel durch Filtration abgetrennt

Das isolierte, feuchte Myzel »Gewicht etwa 3(KIg) wird in 4 I eines Phosphatpuffers M 15 bei einem pH-Wert von 7.3 in einem Fermentationsbehäller aufgeschlämmt und die Aufschlämmung 10 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit ν,οη 8(K) Ü Min. gerührt. Die Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 1,51 pro Liter Flüssigkeit pro Minute zugeführt und die Temperatur auf 28 C eingestellt.

Prcgn-4-cn-2l-ol-3,20-dion-[l7-i.l6.(-d]-2'-meth>'_;-oxazolin-21-acetal wird in einer Menge, die 0.5% (Oew./Vol.) des Mediums entspricht, in 40 ml Aceton gelöst, dem Medium zugesetzt und die Masse 24 Stunden lang den oben angeführten Rühr-, Luftzufuhr- und Temperaturbedingungen ausgesetzt. An dieser Stelle wird die Umsetzung durch Zuführung von Chloroform gestoppt.

Das Gemisch wird nitriert, das Myzel mehrmals mit Chloroform gewaschen und das Filirat mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten, heim Waschen erhaltenen C'hlornformanieile und -extrakte werden im Vakuum zu einem kleiner. Volumen eingedampft. Anschließend wird zur Bildung eines Niederschlages Petroläiher zugesetzt. Das Rohprodukt wird durch Gegenstromveri-'ilimg mit einem Gemisch aus Methanol :Wasser: Chloroform : Ligroin im Verhältnis

to 2:1:2:1 gereinigt. Die Ausheule beträgt 0.5 g Pregn-4-en -' 11 /i,21 -diol-3.20-dion -117«.I(vi-d]-2'-met hyloxazoMn, das mit lissigsäureanhydrid in Pyridin das 21-Acetat bildet. Schmelzpunkt 224 bis 225 C, [,<] : + 108 (c = 0,5, ClICI₁).

if. Die Identität der erhaltenen Vet bindung wird festgestellt, indem man sie der Wirkung des Enzyms aussetzt, das während der Fermentierung von Corynebaclerium simplex SCH 2141 unter den Bedingungen gebildet wurde, die allgemein bei Einführung einer Doppelbindung in die I(2)-Siellung des Steroidkerns angewendet werden. Durch dieses Verfahren erhält man das bekannte Pregna-1.4-dien-11 ,.'.21 -diol-3.20-dion-[ 17«. 16.i-d ]-2'-methy lo\azolin-2! -acetat. Schmelzpunkt 256 bis 257 C / _x 241 bis 243 (CH₁OHl

Die zur Durchführung des in diesem Beispiel beschriebenen Verfahrens notwendige Ausgangsverbindung wird durch folgende Verfahrensschritte hergestellt. Eine Mischung aus 5 g Pregn-5-cn-3,;-ol-20-on-[i7.i.l6.i-d]-2'-niethyloxazolin. 40 ml Tetrahydrofuran. 40 ml Methanol. 7.5 g Calciumoxyd und 0.11g Azo-bis-isobutyronitril wird unter kräftigem Rohren nach und nach einer Lösung von 5 g Jod in 25 ml Tetrahydrofuran und 13 ml Methanol versetzt. Das Gemisch wird anschließend filtriert das Fiitrat im Vakuum bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 80 ml Methylenchlorid gelost. Die organische Lösung wird zunächst mit Natnuinihiosulfat und anschließend mit Wasser gewaschen und dann im Vakuum bis zur Trockne eingedampft Dieser Rückstand (das 21-Jodderivat des Steroidsi wird in 40 ml Aceton gelöst und einer auf 50 bis 60 C erwärmten Lösung aus 28 ml Essigsäure. 14 ml Aceton und 50 ml Triäthylamin zugesetzt Anschließend wird das Gemisch 90 Minuten am Rückfluß erhitzt

I>as Aceton wird abdestilliert und dann die Mischung nach und nach mit 350 mi warmem Wasser versetzt Nach der Abkühlung wird der gebildete Niederschlag abgetrennt und gewaschen Die Ausbeute betraut 4.8 g Pregn-5-en-3/;.2l-diol-20-on [17.i.l6.i-d]-2 -mcthvlo\azolin-21-acetat.Schmelzpunkt 232bis234 C.[<«] : 20.4 (c - 0.5. t HCI,)

Nach bekannten Verfahren wird an dem gewonnenen Steroid unter Verwendung von Aluminiumisopropylal und Cyclohexanon in Toluol eine Oppenaucr-Oxydation durchgeführt Aus 35 g des Ausgangs-Pregn-5-ens werden 30 g (Ausbeute 86¹O) Pregn-4-en-21 - öl 3.20- dion - [ I7„.|6., - d] - 2 - melhyloxazohn-21-acetal gewonnen. Schmelzpunkt 204 bis 206 C. [><]': +86 (<=0.5. CHCl,). El^ 401.8. >.„„„ 240 μ

fio (CH₁OlI).

Beispiel 2

Pregn-4-en-11 f/-ol-3,20-dion-[ 17«.16.i-d]-oxazolin

Die Herstellung erfolgt genau wie im Beispiel I beschrieben, wobei Prcgn-4cn-3,20-dion-[17.i,l6ii-d]-oxazolinalsAusgiingsverbindungundC'unninghamella blackcsleeana NRRL 8688A als Fcrmenlierungsorganismus verwendet wird.

IXr Schmelzpunkt des gewonnenen Siemid-Oxa-/olins liegt bei I¹JS bis 2(M) C.

Beispiel 3

l'regn-4-en-11/ί.21-diol-3.2()-dion-[ I Tu.16n-d]-2-melhyloxazolin

Die Herstellung erfolgt genau wie im Beispiel I beschrieben, wobei als Ausgangsvcibindung Pregn-4-en-2l-ol-3,20-dion-[l7u,l6ii-d]-2'-methyIoxazo|in und Absidia orchidis ATCC 6647 als Fermentiert'.ngsorganismus verwendet wird,

Der Schmelzpunkt des gewonnenen Sleroidoxazoliiis liegt bei 235 C.

Claims (1)

1. Patentansprüche:
   I. Sieroid-Oxazoline der allgemeinen Formel

   C-R'

   25

   worin R Wasserstoff, die Hydroxyl- odcrAcctoxygruppe und R' Wasserstoff oder den Mclhylrcsl darstellt.
   2. Prcgn-4-cn- 11//.2I -diol - 3.20-dion -[17,j.

   ! 6«-d]-2-methyloxazolin.

   λ Verfahren /ur Herstellung eines Sicntid-Oxazolins tier aligemeiiv-Ίι I-'orniel

   CILK
   CO

   110-

   C R'

   in der R Wasserstoff, die Hydroxyl- oder Aceloxygruppe und R' Wasserstoff oder den Methylrest darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Steroid-Oxazolin der allgemeinen Formel

   CH₁R

   CO

   C R'

   in der R und R' die angegebene Bedeutung haben, durch Fermentation mit Curvularia lunata NRRL 2380 bzw. Cunninghamella blackesleeana NRRL 8688 A bzw. Absidia orchidis ATCC 6647 enzymatisch hydror.ylicrt.