-
Verfahren zur Reinigung von Bacitracin Die Erfindung bezieht sich
auf ein Verfahren zur Gewinnung praktisch reinen, festen Bacitracins durch Ionenaustausch.
Das antibiotische Bacitracin wird durch Züchtung des Organismus Bacillus subtilis
auf einem Nährboden unter aeroben Bedingungen in weitgehend derselben Weise wie
Penicillin hergestellt. In dem gärenden Medium liegt das Bacitracin nur in verhältnismäßig
kleinen Mengen vor, d. h. in der Größenordnung von 50 bis 100 Einheiten je ml. Die
Abtrennung und Gewinnung dieser kleinen Materialmenge aus einem großen Volumen eines
Mediums von komplexem Charakter bietet zahlreiche Schwierigkeien.
-
Frühere Verfahren zur Gewinnung von Bacitracin sind in der USA.-Patentschrift
2 582 921 beschrieben.
-
Gemäß den Angaben dieser Patentschrift wird das urspriingliche Bacitracingärungsmedium
zuerst praktisch von dem erzeugenden Organismus befreit, auf einen Wert von ungefähr
4 angesäuert und dann - mit einem Koagulationsmittel, wie Ferri- oder Aluminiumchlorid,;
behandelt. Das Koagulat wird dann. durch geeignete Mittel abgetrennt und das geklärte
Gärmedium darauf mit einem Zeolith vermischt, welcher das Bacitracin absorbiert.
Die Flüssigkeit wird dann abgegossen und das Bacitracin aus dem Zeolith mit einem
Alkali eluiert, um eine alkalische Bacitracinlösung herzustellen. Die Bacitracinlösung
wird darauf mit Säure neutralisiert und getrocknet, um ein Bacitracin vermischt
mit einem Salz zu gewinnen, oder die alkalische Bacitracinlösung kann mit einer
Säure neutralisiert werden, die ein Anion enthält, welches das Kation des Alkalis
ausfällt, worauf der Niederschlag entfernt und die Bacitracinlösung eingetrocknet
werden kann, um salzfreies, festes Bacitracin zu erhalten.
-
Frühere Verfahren zur Gewinnung von Bacitracin werden auch durch
die USA.-Patentschrift 2 556 375 erläutert. Mit dieser Methode wird Bacitracin aus
Gärfiüssigkeiten in Form eines Farbstoffsalzes durch Reaktion des Bacitracins mit
dem als Polargelb 5 G bekannten Farbstoff ausgefällt, der Niederschlag gewonnen,
das Bacitracin-Polargelb-5 G-Salz in verdünntem Alkali aufgelöst, das Bacitracin-Farbstoff-Salz
aus der wäßrigen Lösung mit Butylalkohol extrahiert und die alkoholische Lösung
mit einer Säure behandelt, um das Polargelb 5 G in die organische Phase zu extrahieren
und das mineralsaure Salz von Bacitracin in die wäßrige Phase zu treiben, aus der
es durch Trocknungsmethoden, z. B. Eindampfen, Gefriertrocknung usw., gewonnen werden
kann.
-
Es wurde nun ein neues Verfahren für die Reinigung von Bacitracin
gefunden, das zu hohen Ausbeuten an Bacitracin mit hoher Potenz führt. Ferner liefert
das neue Verfahren Bacitracin von geringerer Giftigkeit, was für pharmazeutische
Zwecke sehr er-
wünscht ist. Die Erfindung besteht im wesentlichen darin, daß man
eine wäßr.ige Bacitracinlösung durch ein stark saures Kationenaustauschharz und
ein schwach basisches Anionenaustaushharz gehen läßt und die anfallende Lösung trocknet,
um getrocknetes, festes Bacitracin zu erhalten.
-
Das neue Verfahren kann angewandt werden, um Bacitracin unmittelbar
aus dem Nährmedium zu gewinnen, worin es erzeugt wird. Daran schließt sich die Entfernung
der wasserunlöslichen Feststoffe und Aufarbeitung der wäßrigen Lösung durch Veränderung
des p-Wertes, um Verunreinigungen auszufällen. Wenn eine derartige wäßrige Lösung
als Ausgangsmaterial beim vorliegenden Verfahren verwendet wird, hat das Fertigerzeugnis,
das aus getrocknetem festem Bacitracin besteht, jedoch eine Potenz von etwa 10 bis
30Einheiten je mg. Wenn die obengenannte wäßrige Bacitracinlösung teilweise gereinigt
und konzentriert wird, um die Bacitracinmenge je Volumeinheit zu steigern, kann
die Potenz des fertigen getrockneten Produktes auf -einen Wert zwischen etwa 50
und 70 Einheiten je mg beträchtlich gesteigert werden. Wegen dieses Unterschiedes
in der Potenz des Fertigerzeugnisses wird vorzugsweise die erhaltene wäßrige Bacitracinlösung
teilweise gereinigt und konzentriert, indem man wasserunlösliche Feststoffe entfernt
und das Nährmedium, in dem Bacitracin erzeugt wird, aufbessert. Diese Reinigung
und Konzentrierung kann durch irgendwelche Mittel vorgenommen werden, wie z. B.
durch das Verfahren der USA.-Patentschrift
2 609 324. Eine andere
geeignete Methode zur Erzielung teilweise gereinigter, konzentrierter, wäßriger
Bacitracinlösungen ist in der USA.-Patentschrift 2 582 921 beschrieben.
-
Bei der Durchführung des neuen Verfahrens zur Gewinnung und Reinigung
von Bacitracin wird eine wäßrige Lösung und Bacitracin mit einem p-Wert zwischen
2 und 10 durch ein Kationenaustauschharz und ein Anionenaustauschharz in der freien
Säure-bzw. freien Basenform geschickt. Die wäßrige Bacitracinlösung kann mit derartigenAustauschharzen
in jeder gewünschten Reihenfolge oder auch gleichzeitig im sogenannten Einbettverfahren
in Berührung gebracht werden. Da Bacitracin bei ríiedrigem pgWert unbeständig ist
und 10% der Aktivität bei einem pz von 1,6 verlorenging, wenn man es 4 Stunden bei
270 C stehenläßt, soll das Bacitracin nicht über wesentliche Zeiträume stehenbleiben,
wenn es sich zunächst mit dem Kationharz in Berührung befindet, bevor es mit dem
Anionharz in Berührung ist und der pgWert wieder gegen neutral verschoben wird.
Das Umgekehrte ist nicht zutreffend, da Bacitracin bei alkalischem pH-Wert beständig
ist. Wenn die Einbetttechnik angewandt wird, - besteht kein Problem, da Kationen
und Anionen aus der Bacitracinlösung gleichzeitig entfernt werden. Bacitracin kann
in Lösung mit den Austausch harzen in jeder zweckmäßigen Weise in Berührung kommen.
Vorzugsweise verwendet man aber eine Säule aus den Harzen und läßt die wäßrige Bacitracinlösung
durch die Säule fließen. Dann trocknet man die anfallende wäßrige Bacitracinlösung
zusammen mit dem Waschwasser aus der Harzsäule, um getrocknetes, festes Bacitracin
zu erhalten. Die Lösung kann durch alle üblichen Mittel, z. B. Gefriertrocknung
unter Vakuum oder Sprühtrocknung, getrocknet werden.
-
Die Kationenaustauschharze, die man beim vorliegenden Verfahren verwendet,
können alle stark sauren Kationenaustauschharze, z. B. die Kationenaustauschharze
vom Sulfonsäuretyp usw., sein. Die stark sauren Sulfonsäurekationenaustauschharze
enthalten ringförmige Sulfonsäuregruppen oder Methylensulfonsäuregruppen, z. B.
Phenolformaldehydharze mit ringförmigen Sulfonsäuregruppen, oder man kann sulfonierte
aromatische Kohlenwasserstoffpolymere, wie sulfonierte Polystyrolharze, verwenden.
Solche Kationenaustauschharze sind in den USA.-Patentschriften 2 204 539, 2228 159
und 2 366 007 beschrieben. Beispielsweise ist ein solches Harz als Amberlite IR-120,
hergestellt von der Rohm & Haas Corp., Philadelphia, Pennsylvania, USA., bekannt.
-
Die anderen Austauschharze, die hier verwendet werden, umfassen solche
der Gattung von schwachen freien Aminen oder der schwachen Mischaminphenolformaldehydanionenaustauschharze,
wie Amberlite IR-4B und Amberlite IR-45, die beide ebenfalls von der Rohm &
Haas Corp. hergestellt werden.
-
Die Beschreibung des vorliegenden Verfahrens entsprechend den obigen
Angaben umfaßt die Benutzung sogenannter Einbetfflarze, wie z. B. das folgende Einlettharz,
das von der Rohm & Haas Corp. hergestellt wird: Amberlite MB-4, eine Mischung
aus gleichen Teilen Amberlite IR-120 (stark sulfonsaures Harz) und Amberlite IR-45
(schwaches Anionenaustauschharz). Dieses Harz und seine Benutzungsweise sind in
der Drudcschrift mit dem Titel »AmberliteMonobed Deionization«, Rohm &Haas Corp.
(Juni 1950), beschrieben.
-
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, jedoch
nicht zur Beschränkung auf die be-
sonderen Mengen, Verhältnisse oder darin enthaltenen
Materialien. Es sollen alle Äquivalente in den Rahmen der Erfindung eingeschlossen
sein, die in der Beschreibung und den Ansprüchen angegeben sind.
-
Beispiel i Ein Anteil von 3000 ml eines mit Holzkohle behandelten
wäßrigen Bacitracinkonzentrates, das bei Prüfung 1253 Einheiten je ml und einen
pHWert von 7,0 zeigte, wurde durch eine Säule von Amberlite MB - 4, einem Einschichtionenaustauschharz,
gegeben, das aus gleichen Teilen Amberlite IR-120, einem starken Sulfonsäurekationenaustauschharz,
und Amberlite IR-45, einem schwachen Mischaminanionenaustauschharz, bestand. Das
Volumen des Auslaufes einschließlich des Waschwassers betrug 4200ml, die bei Prüfung
813 Einheiten je ml zeigten. Dieser Auslauf wurde dann durch Vakuumkonzentration
im einmaligen Durchgang auf ein Volumen von 1320 ml eingeengt, die bei der Prüfung
2308 Einheiten je ml zeigten. Diese konzentrierte wäßrige Lösung wurde dann filtriert
und unter Vakuum durch Ausfrieren getrocknet, um 48 g trocknes, festes, praktisch
reines Bacitracin zu erhalten, das 65,5 Einheiten je mg bei einer Gesamausbeute
von 83,60/0 aus dem mit Kohle behandelten wäßrigen Konzentrat für das durch Gefrieren
getrocknete Bacitracinprodukt zeigte. Der LD,,-Wert des bei der Gefriertrocknung
erhaltenen Bacitracins betrug ungefähr 600 Einheiten je 20 g Maus.
-
Beispiel 2 Ein Anteil eines mit Kohle behandelten wäßrigen Bacitracinkonzentrates
von 3000 ml, der bei einer Prüfung 936 Einheiten je ml und einen pH-Wert von 4,0
zeigte, wurde durch eine Säule von Amberlite M B-4, einem Einschichtionenaustauschharz,
wie im Beispiel 1 beschrieben, geschickt. Das Volumen des Auslaufes aus dem Ionenaustauschharz
einschließlich Waschwasser betrug 3520 ml mit 796 Einheiten je ml.
-
Dieser Auslauf wurde dann durch einmaligen Durchgang im Vakuum auf
eine Raummenge von 1160 mol mit 2740 Einheiten je ml konzentriert. Diese konzentrierte
Lösung wurde darauf filtriert und unter Vakuum durch Ausfrieren getrocknet, um 36
g eines trocknen, festen, praktisch reinen Bacitracins mit 65,5 Einheiten je mg
bei einer Gesamtausbeute aus dem mit Kohle behandelten wäßrigen Konzentrat von 82,9
O/o zu erhalten. Der LDs0-Wert des nach der Ausfriertrocknung erhaltenen Bacitracins
betrug ungefähr 450 Einheiten je 20 g Maus.
-
Beispiel 3 Ein Anteil eines mit Kohle behandelten wäßrigen Bacitracinkonzentrates
von 2000 ml mit einem pa von 7,2 wurde durch eine Säule gegeben, die Amberlite MB-1,
ein Einschichtionenaustauschharz, enthielt, das aus einem Teil Amberlite IR - 120,
einem starken Sulfonsäurekationenaustauschharz, und 3 Teilen Amberlite IRA - 400,
einem starken quaternären Ammoniumhydroxydanionenaustauschharz, bestand.
-
Die Raummenge des Auslaufes einschließlich Waschwasser betrug 2620
ml mit 416 Einheiten je ml. Dieser Auslauf wurde dann durch einmaligen Durchgang
im Vakuum auf ein Volumen von 870ml mit 813 Ein heiten je ml konzentriert, und das
anfallende Konzentrat wurde filtrier;t. Ein Anteil des filtrierten wäßrigen Konzentrates
von 287 ml wurde dann unter Vakuum durch Ausfrieren getrocknet, um 5 g trocknes,
festes, praktisch reines Bacitracin mit einem Wert von
63,8 Einheiten
je mg bei einer Gesamtausbeute von 76,8 ovo desjenigen Anteiles des wäßrigen Konzentrates
zu erhalten, der durch Ausfrieren getrocknet war.
-
Beispiel 4 Eine Menge von 56,81 eines mit Kohle behandelten wäßrigen
Bacitracinkonzentrates mit einem Wert von 1335 Einheiten je ml und einem pBWert
von 7,5 wurde durch eine Kolonne geschickt, die Amberlite MB-4, ein Einschichtionenaustauschharz,
wie im Beispiel 1 beschrieben, enthielt. Der Auslauf von 58,6 1 mit einem Wert von
1225 Einheiten je ml wurde durch einmaligen Durchgang im Vakuum auf ein Volumen
von 4,9 1 mit einem Wert von 11 920 Einheiten je ml konzentriert.
-
Dieses wäßrige Konzentrat wurde dann filtriert und durch Versprühen
getrocknet, um 647 g trocknes, festes Bacitracin mit einem Wert von 63,5 Einheiten
je mg bei einer Gesamtausbeue von 54,2°/o des mit Kohle behandelten Konzentrates
an durch Versprühen getrocknetem Bacitracinprodukt zu erhalten. Ein Anteil dieses
Sprühtrocknungsproduktes wurde in entionisiertem Wasser aufgelöst, filtriert, in
Fläschchen gefüllt und unter Vakuum durch Ausfrieren getrocknet. Der LDs0-Wert des
Bacitracins, das man nach der Ausfriertrocknung erhielt, betrug ungefähr 555 Einheiten
je 20 g Maus.
-
Beispiel 5 Ein Anteil von 3000 ml eines mit Kohle behandelten wäßrigen
Bacitracinkonzentrates mit einem Wert von 1237 Einheiten je ml und einem Wert von
7,4 wurde durch eine Säule von Amberlite MB-4, einem Einschichtionenaustauschharz,
wie im Beispiel 1 beschrieben, geschickt. Der Auslauf von 3320 ml mit 1005 Einheiten
je ml wurde durch einmaligen Durchgang im Vakuum auf ein Volumen von 900 ml mit
einem Wert von 2987 Einheiten je ml konzentriert.
-
Dieses wäßrige Konzentrat wurde dann filtriert und unter Vakuum durch
Ausfrieren getrocknet, um 45 g trocknes, festes, praktisch reines Bacitracin mit
einem
Wert von 55,9 Einheiten je ml bei einer Gesamtausbaute von 67,8 ovo des mit
Kohle behandelten wäßrigen Konzentrates an durch Ausfrieren getrocknetem Bacitracinprodukt
zu erhalten.
-
Beispiel 6 Ein Anteil von 385 ml des in Beispiel verwendeten, mit
Kohle behandelten wäßrigen Bacitracinkonzentrates von einem Wert von 1237 Einheiten
je ml wurde unter Vakuum durch Ausfrieren unmittelbar ohne weitere Behandlung getrocknet.
Diese Arbeitsweise führte zu 8,5 g eines trocknen, festen Bacitracinproduktes mit
einem Wert von 37,2 Einheiten je mg.
-
PATENTANSPRCHE: 1. Verfahren zur Reinigung von Bacitracin, dadurch
gekennzeichnet, daß man ein wäßriges, gegebenenfalls teilweise gereinigtes Bacitracinkonzentrat
mit einem Wert von 2 bis 10 über ein stark saures Kationenaustauschharz und ein
schwach basisches Anionenaustauschharz schickt und die anfallende Lösung durch Versprühen
oder Lyopkilisieren zur Trockne bringt.