DE1029372B

DE1029372B - Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclinen aus ihren Loesungen

Info

Publication number: DE1029372B
Application number: DEF18801A
Authority: DE
Inventors: Dr Fritz Lindner; Dr Josef Schmidt-Thome; Dr Karl Kuehn; Dr Alfons Soeder; Dr August Steigler; Dr Karl-Heinz Wallhaeusser
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1955-11-05
Filing date: 1955-11-05
Publication date: 1958-05-08

Description

Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclinen aus ihren Lösungen Im Patent 952632 ist ein Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclinen aus ihren Lösungen beschrieben, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Tetracycline aus ihrer wäßrigen Lösung durch Zugabe von Ferriionen und grenzflächenaktiven sauren Schwefelsäureestern oder Sulfonsäuren in einem pH-Bereich von 1 bis 4 ausfällt, den gebildeten Niederschlag in verdünnter Säure aufschlämmt, ihn in Gegenwart eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels und eines Stoffes, der ein größeres Komplexbildungsvermögen zum Ferriion aufweist als Tetracyclin, zerlegt, die organische Lösungsmittelschicht abtrennt, das Lösungsmittel daraus abdestilliert, den Rückstand in einem niedermolekularen aliphatischen Alkohol löst und durch Zugabe einer Mineralsäure die Tetracycline als Salze kristallin abscheidet und gegebenenfalls durch Umkristallisieren weiterreinigt.
Bei der Weiterbearbeitung dieses Gebiets wurde nun gefunden, daß man besonders vorteilhaft verfahren kann, wenn man die saure, aufgeschlossene und filtrierte Kulturlösung zunächst mit einem Anionenaustauscher behandelt und erst anschließend die im Patent 952632 beschriebene Fällung ausführt und daraus die Tetracycline gewinnt.
Als Anionenaustauscher eignen sich stark basische Polystyrolharze vom Typ der quaternärenAmmoniumverbindungen (»Amberlite IR-400«), schwachbasische Phenolformaldehyd-Polyamine (»Amberlite IR-4B«), quaternäre Ammoniumsalzverbindungen vom Typ [R,RiR2, R,N+],A-, in denen einer der Reste R, R1, R, oder R3 vom Polystyrol stammt, das seinerseits mit Divinylbenzol vernetzt ist (»Dowex 1« und j»Dowex2«), ferner Polykondensate aus Phenol und Formaldehyd (»Wofatit M« und »Lewatit MN«).
Ionenaustauscher sind schon mehrmals vorteilhaft zur Reinigung und Anreicherung von Antibiotika aus ihren Lösungen eingesetzt worden. Man kann die Ionenaustauscher stets für diesen Zweck verwenden, wenn das Antibiotikum basische oder saure Eigenschaften besitzt, weil hier durch eine Änderung des pH-Werts die Möglichkeit der Adsorption und Elution gegeben ist (vgl. britische Patentschrift 669348).
In den USA.-Patentschriften 2538479, 2643997 und der britischen Patentschrift 638664 ist eine weitere Verwendungsmöglichkeit eines Ionenaustauschers zur Reinigung beschrieben. Sie besteht darin, daß der Ionenaustauscher zur Neutralisation der sauren Antibiotikalösung verwandt wird. Diese Arbeitsweise bietet den Vorteil, daß zusätzliche Salze aus der Lösung ferngehalten werden.
Die in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebene Arbeitsweise unterscheidet sich grundsätzlich von den obengenannten Anwendungsmöglichkeiten eines Ionenaustauschers. Hier wird der Anionenaustauscher weder zur Adsorption der Tetracycline noch zur Neutralisation einer tetracyclinhaltigen Lösung verwendet, sondern man behandelt die sauren, tetracyclinhaltigen Kulturlösungen mit einem Anionenaustauscher, um Störungen, die bei der Ausfällung der Tetracycline aus Fermentationslösungen mit Ferriionen und Dodecylschwefelsäure auftreten können, zu vermeiden.
Durch die Behandlung der sauren Kulturlösung mit dem Anionenaustauscher werden vor allem Stoffe entfernt, die auf Zusatz von Ferriionen zur sauren, aufgeschlossenen Kulturlösung ausfallen. Es handelt sich hierbei im besonderen um in der Kulturlösung vorhandene Phosphationen. Sie bilden auch in saurer Lösung mit Eisen(III)-ionen und Tetracyclin einen Niederschlag, der Phosphat-, Ferriionen und Tetracyclin enthält. Dieser Niederschlag hat die Eigenschaft, daß er der Zerlegung mit einem Polyphosphat widersteht, weil die Affinität des Polyphosphats zum Ferriion nicht ausreicht, um aus dem Komplex das Ferriion herauszulösen. Zur Zerlegung des genannten Niederschlages muß man einen stärkeren Komplexbildner, z. B. Äthylendiamintetraessigsäure, einsetzen, was eine erhebliche Verteuerung des Verfahrens bedeutet.
Bei Gegenwart von Phosphationen ist der Eisen- und der Dodecylsulfatverbrauch erhöht und die Niederschlagsmenge dementsprechend größer als in phosphatfreien Kulturlösungen.
Es war überraschend und nicht vorauszusehen, daß mit Hilfe eines so einfachen Verfahrensschrittes, wie ihn die Behandlung der Kulturlösung mit einem Anionenaustauscher darstellt, die geschilderten Schwierigkeiten so leicht zu beheben sind. _ Der Anionenaustauscher wird vor der Verwendung in die S 04 oder Cl-Ionenform übergeführt. Dies kann mit wäßriger Säure oder einer Salzlösung, z. B. einer wäßrigen Lösung von Natriumsulfat öder Kochsalz, erreicht werden. Anschließend wäscht man ihn mit verdünnter, wäßriger Säure aus, bis die ablaufende Flüssigkeit einen pH-Wert von 1 .bis 3,5 aufweist.: Nach dieser-Vorbehandlung des Anionenaustauschers wird die saure, geklärte Kulturlösung, die einen pH-Wert von 1 bis 3,5 aufweist, mit dem Anionenaustauscher in Berührung gebracht. Für diesen Zweck wählt man vorteilhaft eine Ionenaustauschersäule und läßt die Kulturlösung durch diese laufen. Ein Ausrühren der Kulturlösung reit dem Anionenaustauscher führt gleichfalls zum Ziel, bedingt aber einen Mehreinsatz an Ionenaustauscher und eine längere Verweilzeit. Die Menge des Anionenaustauschers ist abhängig von den auszutauschenden Begleitsubstanzen und der Verweilzeit der Kulturlösungen mit dem Ionenaustauscher. Sie beträgt etwa 1 bis 5 0/0, bezogen auf das Volumen der Kulturlösung. Der pH-Wert der Kulturlösung wird auf 1 bis 3,5 eingestellt. Vorzugsweise arbeitet man bei einem pH-Wert von 1,5 bis 2,5. Von den Anionenaustauschern werden unter den angeführten Arbeitsbedingungen die Tetracycline nicht adsorbiert.
Während des Durchlaufs der Kulturlösung wird mit einer Eisen(III)-ionenlösung geprüft, ob die Ionenaustauschersäule richtig arbeitet. Zu diesem Zweck versetzt man eine kleine Probe der ablaufenden Lösung mit Eisen-(III)-ionen. Man wählt auf 1 Mol Tetracyclin etwa 2 bis 3 Mol Eisen(III)-ionen. - Die Lösung nimmt sofort- die dunkle Farbe der Eisen(III)-tetracyclinkomplexverbindung an. Bei richtiger Leistung der Säule muß die Lösung zumindest 10 bis 15 Minuten klar bleiben, d. h., es darf keine Trübung oder Ausflöckung auftreten. Bei Eintritt der beschriebenen Merkmale ist die Säule erschöpft und muß regeniert werden.
Das Regenerieren der Säule wird mit starker Schwefel-oder Salzsäure vorgenommen. Gleichfalls verwertbar für diesen Zweck sind wäßrige Salzlösungen der genannten Mineralsäuren, z. B. eine 10%ige Kochsalzlösung. Die benötigten Mengen betragen etwa 5 bis 10%, bezogen auf das Volumen der durchgelaufenen Kulturlösung. Man wäscht anschließend die Säule mit verdünnter Schwefel-oder Salzsäure nach, bis der p11-Wert der ablaufenden Flüssigkeit einen Wert von 1 bis 3 zeigt. Nach dieser Behandlung ist die Säule gebrauchsfertig und kann zur Klärung weiterer Kulturlösungen eingesetzt werden.
Beispiel 1 501 Tetracyclingärlösung werden mit 20%iger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 1,5 eingestellt und 4 Stunden gerührt; hierauf wird die Lösung unter Zusatz von 2,5 kg eines Filterhilfsmittels mittels einer Filterpresse vom Mycel befreit. Man erhält etwa 451 klares, saures Kulturfiltrat.
Ein Glasrohr mit einem Durchmesser von etwa 5 cm und einer Länge von 80 cm wird mit 1 kg »Aberlite IR-400 « gefüllt und der Ionenaustauscher mit 10%iger wäßriger Schwefelsäure in die S 04 Ionenform übergeführt. Anschließend gibt man destilliertes Wasser durch die Säule, bis das ablaufende Wasser einen pH-Wert von 1,5 bis 2 aufweist. Nach dieser Vorbehandlung ist die Säule gebrauchsfertig.
451 aufgeschlossenes, saures Kulturfiltrat mit einem Gehalt von 1,5 g Tetracyclin je Liter Kulturlösung läßt man durch die gebrauchsfertige Anionenaustauschersäule laufen. Die Durchlaufgeschwindigkeit wird so eingestellt, daß für die angegebene Menge Kulturfiltrat 3 bis 5 Stunden benötigt werden. Zur Überprüfung auf richtige Arbeit der Säule werden jeweils 10 ccm der durchlaufenden Kulturlösung entnommenundmit 0,06 ccm einer 10%igen Eisen(III)-chloridlösung versetzt.
Die Lösung zeigt bei richtiger Arbeit der Säule die tiefe Farbe der Eisen(III)-tetracyclinkomplexverbindung. Tritt eine Ausfällung oder Trübung nach der Zugabe der Eisen(III)-chloridlösung ein, so ist die Säule erschöpft und muß regeneriert werden.
Man erhält etwa 431 klares, ausgetauschtes, saures Kulturfiltrat. Der Tetracyclingehalt der Lösung hat sich gegenüber der Ausgangslösung nicht geändert.
Nach dem Gebrauch wird die Säule mit 51 Wasser nachgewaschen und anschließend mit 5 bis 8 1 10%iger Schwefelsäure behandelt. Man läßt Wasser durch die Säule laufen, bis das ablaufende Wasser einen pH-Wert von 1 bis 2 aufweist. Nach dieser Vorbehandlung ist die Säule für weitere Aufarbeitungen einsatzfähig.
101 saures, mit einem Anionenaustauscher behandeltes Kulturfiltrat, das einen Gehalt von 15 g Tetracyclin (1500 y/ccm) aufweist, wird mit 30 ccm 20%iger Eisen-(III)-chloridlösung versetzt und gut durchgerührt. Nach 10 Minuten gießt man unter mäßigem Rühren 360 ccm einer 5%igen Dodecylsulfatlösung in die klare, tiefgefärbte eisenhaltige Lösung, fügt 30 g eines Filterhilfsmittels hinzu und zentrifugiert den Niederschlag ab. Der Tetracyclingehalt der überstehenden Lösung beträgt 28 y/ccm.
Der Niederschlag wird in 500 ccm Butanol suspendiert und durch starkes Durchmischen in Lösung gebracht. Hierfür sind etwa 15 Minuten erforderlich. Zu der buta-, nolischen Lösung gibt man 20 g eines Hexanatriumtetrapolyphosphats (»Polyron«), das in 200 ccm Wasser gelöst ist. Es ist zweckmäßig, die Polyphosphatlösung vorher mit starker Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 einzustellen. Das kräftige Rühren wird 2 bis 3 Stunden fortgesetzt. Das Gemisch zeigt nun eine rötlichgelbe Farbe. Man entnimmt eine kleine Probe und prüft wie folgt auf Vollständigkeit der Zerlegung: Die geschleuderte Probe darf nur noch einen geringen Niederschlag in der Zwischenschicht aufweisen. Die Farbe der Zwischenschicht ist schwach grau und darf nicht schokoladenbraun sein. Im zuletzt genannten Fall ist die Zerlegung noch nicht beendet, und das Durchmischen muß fortgeführt werden.
Nach Beendigung der Zerlegung trägt man 40 g Natriumsulfat in die Lösung ein, rührt noch etwa 10 ,Minuten und trennt die Schichten mittels einer Zentrifuge. Die Butanolphase wird aufgearbeitet und die wäßrige Phase noch einmal nach Zugabe von 5 g des obengenannten Polyphosphates mit 500 ccm Butanol unter Rühren 1 Stunde nachbehandelt. Die Schichten werden getrennt und die erhaltene zweite Butanolphase zur Zerlegung eines neuen Ansatzes eingesetzt. Der pH-Wert wird während der Zerlegung auf 2 gehalten.
Der Butanolextrakt wird mit dem gleichen Volumen Tetrachlorkohlenstoff versetzt, in 75 ccm 1 n- und 425 ccm n/100-Schwefelsäure eingetragen und nach der Durchmischung werden 20 g geschmolzenes Olelyamin zugefügt. Nach guter Durchmischung werden die Schichten getrennt und die organische Schicht mit weiteren 250 ccm n/100-Schwefelsäure extrahiert. Die Schichtentrennung kann im Scheidetrichter oder besser mit einer Zentrifuge ausgeführt werden. In die vereinigten, wäßrigen Schichten trägt man 1 g des Dinatriumsalzes der Äthylendiamintetraessigsäure ein und stellt unter Rühren und Kühlen mit starker Natronlauge den p11-Wert auf 4,4 bis 4,6 ein. Nach 10stündigem Stehen wird die auskristallisierte Tetracyclinbase abgesaugt, mit Wasser nachgewaschen und unter vermindertem Druck bei 50°C getrocknet. Ausbeute: 13,1 g. Das Produkt weist einen Tetracyclingehalt von 92 bis 95 % auf.
Beispiel 2 501 Oxytetracyclingärlösung «-erden mit 20%iger Schwefelsäure auf einen PH-Wert von 1,5 eingestellt, 2 Stunden gerührt und die Lösung unter Zusatz von 2 kg eines Filterhilfsmittels mittels einer Filterpresse vom Mycel befreit. Man erhält etwa 44 bis 461 klares, saures Kulturfiltrat.
Verwandt wird die im Beispiel l beschriebene Säule. Die Füllung wird mit 1 kg »Lewatit MN« vorgenommen, das mit starker Salzsäure in die Cl-Ionenform übergeführt wird. Mittels Wasser wird der PH-Wert der Säule auf 1 bis 3 eingestellt.
Man läßt 451 aufgeschlossenes, saures Kulturfiltrat mit einem Gehalt von 1 g Oxytetracyclin je Liter Kulturlösung durch die vorbehandelte »Lewatit-MN«-Säule laufen, wozu etwa 3 bis 5 Stunden benötigt werden. Die Überprüfung der Säule auf richtige Arbeit nimmt man wie im Beispiel 1 vor. Erhalten werden 441 Oxytetracyclinlösung, deren 0xytetracyclingehalt keine meßbare Veränderung erfahren hat.
Nach dem Gebrauch wird die Säule mit Wasser nachgewaschen. Mit 3 bis 5110%iger Kochsalzlösung, die man langsam durch die Säule laufen läßt, werden die Trübungsstoffe von der Säule entfernt und mit verdünnter Salzsäure der pH-Wert der Säule auf etwa 2 eingestellt.
101 aufgeschlossenes und mit einemAnionenaustauscher wie vorstehend behandeltes Kulturfiltrat mit einem Gehalt von 10 g Oxytetracyclin (1000 y/ccm) werden mit 30 ccm 20%iger Eisen(III)-chloridlösung versetzt und gut durchgemischt. Nach 10 Minuten gießt man 360 ccm 5%ige Dodecylsulfatlösung unter mäßigem Rühren ein und schleudert nach weiteren 10 Minuten den Niederschlag ab. Die Aktivität der Mutterlauge beträgt Der Niederschlag wird in 400 ccm Butanol suspendiert und mit einer Auflösung von 24 g Hexanatriumtetrapolyphosphat (»Polyrom) in 200 ccm Wasser versetzt. Durch Zugabe von 20%iger Schwefelsäure wird der pH-Wert der Lösung auf 2 eingestellt und 2 bis 3 Stunden innig durchmischt. Nach Beendigung der Zerlegung werden 40 g Kochsalz eingetragen und die Schichten getrennt. Die wäßrige Phase wird nochmals mit 100 ccm Butanol extrahiert und das Butanol nach dem Abtrennen mit der Hauptmenge vereinigt. Aus den Butanolextrakten gewinnt man das Oxytetracyclin.
Die vereinigten Butanolschichten werden im Vakuum auf 200 ccm eingeengt (Druck: 3 bis 5 mm; Außenheizung: 40°C), und der ausgefallene Niederschlag wird mit einer Nutsche abfiltriert. Der Niederschlag wird mit etwa 50 ccm Butanol ausgewaschen und verworfen. Das Waschbutanol wird zur Hauptmenge gegeben und die Butanollösung im Vakuum auf etwa 5 bis 10 ccm eingeengt. Man versetzt den dicken Sirup mit 150 ccm Methanol und tropft in die klare Lösung unter Rühren und Eiswasserkühlung 50 ccm 10n methanolische Salzsäure ein. Nach 10stündigem Stehen wird das kristalline Oxytetracyclinhydrochlorid abgesaugt und mit wenig Isopropylalkohol und Äther ausgewaschen. Nach der Trocknung unter vermindertem Druck bei 40 bis 50°C wiegt das Hydrochlorid 9,1 g. Der Gehalt an Oxytetracyclin beträgt 87 bis 90 0/0.

Claims

PATENTANSPRUCH= Abänderung des Verfahrens zur Gewinnung von Tetracyclinen aus ihren Lösungen durch Zugabe von Ferriionen und grenzflächenaktiven sauren Schwefelsäureestern oder Sulfonsäuren in einem pH-Bereich von 1 bis 4 zu den wäßrigen Lösungen der Tetracycline, Aufschlämmen des gebildeten Niederschlags in verdünnter Säure, Zerlegen derselben in Gegenwart eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels mit einem Stoff, der ein größeres Komplexbildungsvermögen zum Ferriion hat als die Tetracycline, Abtrennen der organischen Lösungsmittelschicht, Abdestillieren des Lösungsmittels, Lösen des Rückstandes in einem niedermolekularen aliphatischen Alkohol, Abscheiden der Tetracycline als kristalline Salze durch Zugabe einer Mineralsäure und gegebenenfalls weitere Reinigung durch Umkristallisieren nach Patent 952632, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kulturlösung nach dem sauren Aufschluß, jedoch vor der Ausfällung der Tetracycline in bekannter Weise mit einem Anionenaustauscher behandelt. In Betracht gezogene Druckschriften: USA.-Patentschriften Nr. 2 660 558, 2643997, 2538479; britische Patentschrift Nr. 638664; J. Chem. Soc. 1954, S. 28 bis 34.