DE1067020B

DE1067020B - Method for introducing hydroxyl groups into steroids

Info

Publication number: DE1067020B
Application number: DENDAT1067020D
Authority: DE
Inventors: -Chem Dr Alfred Schubert Dipl -Chem Rudolf Siebert und Dipl -Chem Gerhard Langbein Jena Dipl
Original assignee: VEB Jenapharm
Current assignee: Jenapharm GmbH and Co KG
Publication date: 1959-10-15

Description

,1,1

BUNDESREPUBLIK. DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC. GERMANY

DEUTSCHESGERMAN

kl. 12 ο 25/05kl. 12 ο 25/05

INTERNAT. Kl. C 07 CINTERNAT. Class C 07 C.

PATENTAMTPATENT OFFICE

AUSLEGESCHRIFT 1067 020EXPLOITATION PAPER 1067 020

V12658 IVb/12oV12658 IVb / 12o

ANMELDETAG! 25.JUNI1957REGISTRATION DAY! JUNE 25, 1957

BEKANNTMACHUNG DER ANMELDUNG UND AUSCABE DER AXJSLEGESCHKIFT:NOTICE THE REGISTRATION AND AUSCABE THE AXJSLEGESCHKIFT:

15.OKTOBER19S9OCTOBER 15, 19S9

Die Erfindung betrifft die Herstellung von hydroxylierten Steroiden auf mikrobiellem Wege.The invention relates to the preparation of hydroxylated Steroids by microbial means.

Es ist bekannt, daß Sauerstoff auf mikrobiellem Wege in Steroide eingeführt werden kann. Besondere Bedeutung erlangte die Einführung des Sauerstoffs in die Stellung 11 sowie in die Stellung 17. Es ist möglich, auf diesem Wege Hydroxylierungen durchzuführen, die sonst nur durch außerordentlich schwierige chemische Synthesen über viele Zwischenstufen erreicht werden.It is known that oxygen can be introduced into steroids by microbial routes. Special meaning obtained the introduction of oxygen in position 11 as well as in position 17. It is possible on carry out hydroxylations in this way, which otherwise can only be achieved through extremely difficult chemical syntheses involving many intermediate stages.

Diese Synthesen sind deshalb besonders vorteilhaft, weil die Steroide als Heilmittel äußerst wichtig sind.These syntheses are particularly beneficial because the steroids are extremely important as remedies.

Bis jetzt sind mikrobielle Hydroxylierungen in den Stellungen 1, 2, 9, 12, 18 und 19 noch nicht bekanntgeworden; es ist deshalb von großer Wichtigkeit, die Hydroxyherungen in diesen Stellungen auf mikrobieUem Wege zu versuchen, weil die Möglichkeit besteht, weitere wirksame Heilmittel darzustellen. Bei vielen mikrobiellen Hydroxylierungen tritt der bemerkenswerte Nachteil ein, daß die Einführung der Sauerstoffunktion nicht spezifisch erfolgt, sondern daß gleichzeitig an mehreren Stellen des Moleküls eine oder zwei Hydroxylgruppen eingeführt werden, so daß ein Gemisch verschiedener hydroxylierter Steroide entsteht, aus dem nur sehr schwer einheitliche Verbindungen isoliert werden können. Es ist deshalb bei der mikrobiellen Umsetzung von vornherein wichtig, daß die gewünschte Hydroxylierung möglichst einheitlich, d. h. mit hohen Ausbeuten vorgenommen werden kann.So far, microbial hydroxylations in positions 1, 2, 9, 12, 18 and 19 have not yet become known; It is therefore of great importance to try the hydroxylings in these positions by microbial means, because there is the possibility of further effective remedies. In many microbial hydroxylations there is the notable disadvantage that the introduction of the oxygen function does not take place specifically, but that one or two hydroxyl groups are introduced at several points on the molecule at the same time, so that a mixture of different hydroxylated steroids is formed from which compounds are difficult to form can be isolated. It is therefore important from the outset in the microbial conversion that the desired hydroxylation can be carried out as uniformly as possible, ie with high yields.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Einführung von einer oder zwei Sauerstoffunktion en in ein Steroidmolekül, wobei die erste Hydroxylgruppe in den 5-Ring des Steroidmoleküls und gegebenenfalls die zweite Hydroxylgruppe in den Ring C des Steroidmoleküls eingeführt wird.The invention relates to a process for introducing one or two oxygen functions into one Steroid molecule, with the first hydroxyl group in the 5-ring of the steroid molecule and optionally the second Hydroxyl group is introduced into ring C of the steroid molecule.

Erfindungsgemäß führt man Hydroxylgruppen in Steroide, die in 17-Steilung keine OH-Gruppe besitzen, ein durch aerobe Behandlung mit Enzymen von Calonectria decora. Es ist zwar bekannt, für die Dehydrierung von Steroiden die Enzyme des Schimmelpilzes CaIonectria decora zu verwenden. Die Nacharbeitung der Versuche mit Calonectria decora (Centraalbureau voor Schimmelcultures Baarn [Niederlande]) hat jedoch ergeben, daß in keinem Falle eine Dehydrierung stattfindet. Das erfindungsgemäße Verfahren ist demgegenüber außerordentlich überraschend, und der eintretende Effekt der Hydroxylierung war nicht vorauszusehen. Je nach dem Steroid, .das als Ausgangssubstanz verwendet wird, erhält man Stoffe, die eine OH-Gruppe in 12- und/oder 15-Stellung des Steroidgerüstes haben. So erfolgt die Einführung der OH-Gruppen beispielsweise beim Progesteron, ll/3-Hydroxypregnendion-(3,20), AlIopregnandion-(3,20) in 12- und 15-Stellung, beim 15a-Hydroxyprogcsteron, 14a-Hydroxyprogesteron und bei den analogen in 4,5-Stellung hydrierten Pregnan- oder AUopregnanverbindungen in 12-Stcllung, beim lla-Hydroxy-Verfahren zur Einführung
von Hydroxylgruppen in SteroideAccording to the invention, hydroxyl groups are introduced into steroids which have no OH group in the 17-position by aerobic treatment with enzymes from Calonectria decora. It is known to use the enzymes of the mold CaIonectria decora for the dehydration of steroids. The reworking of the experiments with Calonectria decora (Centraalbureau voor Schimmelcultures Baarn [Netherlands]) has shown, however, that in no case does dehydration take place. In contrast, the process according to the invention is extremely surprising, and the effect of the hydroxylation could not be foreseen. Depending on the steroid used as the starting substance, substances are obtained which have an OH group in the 12- and / or 15-position of the steroid structure. For example, the OH groups are introduced in progesterone, II / 3-hydroxypregnendione (3.20), AlIopregnandione (3.20) in the 12 and 15 positions, in 15a-hydroxyprogcsterone, 14a-hydroxyprogesterone and in the analogous pregnane or auopregnane compounds hydrogenated in the 4,5-position in the 12-position, in the IIIa-hydroxy process for introduction
of hydroxyl groups in steroids

Anmelder:Applicant:

VEB Jenapharm,
Jena, Otto-Schott-StraßeVEB Jenapharm,
Jena, Otto-Schott-Strasse

Dipl.-Chem. Dr. Alfred Schubert,Dipl.-Chem. Dr. Alfred Schubert,

Dipl.-Chem. Rudolf SiebertDipl.-Chem. Rudolf Siebert

und Dipl.-Chem. Gerhard Langbein, Jena,and Dipl.-Chem. Gerhard Langbein, Jena,

sind als Erfinder genannt wordenhave been named as inventors

progesteron, 11-Ketoprogesteron Desoxycorticosteron, 9a-Hydroxyprogestcron, lla-Hydroxyallopregnandion-progesterone, 11-ketoprogesterone deoxycorticosterone, 9a-Hydroxyprogestcron, lla-Hydroxyallopregnandione-

(3,20) und Pregnantrion-(3,6,20) in 15-Stellung.(3.20) and pregnantrione (3,6,20) in the 15-position.

Besonders ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren hervorzuheben, daß nicht nur, wie bisher bekannt wurde, vorzugsweise Steroide, die das Δ ⁴-3-Ketosystem besitzen, in dieser Weise umgesetzt werden, sondern daß auch Ver-It should be emphasized in particular in the process according to the invention that not only, as was previously known, preferably steroids which have the Δ ⁴ -3-keto system, are implemented in this way, but that also

bindungen ohne Doppelbindung ini Ring A oder B, die der Pregnan- oder Allopregnanreme angehören, von dem Pilzstamm hydroxyliert werden. Diese spezielle Hydroxy-Eerungi bei der einmal der King D und/oder der Ring C substituiert wird, wurde bisher noch nicht beschrieben.bonds without a double bond ini ring A or B, the belong to the pregnan or allopregnan cream of which Fungal strain are hydroxylated. This special Hydroxy-Eerungi in which the King D and / or the ring C is substituted once, has not yet been described.

Nach dem Verfahren kann die 15-Stellung selektiv hydroxyliert werden, wenn am Pregnanskelett, beispielsweise an C 21, eine Oxy-, Acetoxy- oder Propionoxygruppe steht. In diesem Fall tritt in der 12-Stellung keine Hydroxylierung ein.According to the method, the 15-position can be selectively hydroxylated if on the pregnancies skeleton, for example at C 21, an oxy, acetoxy or propionoxy group. In this case, nothing occurs in the 12 position Hydroxylation.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden viele neue Verbindungen hergestellt, die durch kein anderes Verfahren zugänglich sind.The process according to the invention produces many new compounds which no other Procedures are accessible.

Die Aufarbeitung der mit dem Schimmelpilz Calonectria decora umgesetzten Steroide erfolgt nach den üblichenThe steroids reacted with the mold Calonectria decora are processed according to the usual methods

Methoden, nämlich Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Methylenchlorid oder Essigester. Die Substanzen kristallisieren in den meisten Fällen beim Abdampfen des Lösungsmittels aus. Ihre Isolation kann vorteilhafterweise auch durch Chromato-Methods, namely extraction with an organic solvent such as chloroform, or methylene chloride Ethyl acetate. In most cases, the substances crystallize out when the solvent evaporates. Her Isolation can advantageously also be achieved by means of

graphic an Kieselsäuregel erfolgen.graphic on silica gel.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Schimmelpilz Calonectria decora aus dem Centraalbureau voor Schimmelcultures Baarn (Niederlande) verwendet.When carrying out the method according to the invention, the mold Calonectria decora is from the Centraalbureau voor Schimmelcultures Baarn (Netherlands) used.

909 638/389909 638/389

3 43 4

Auf Grund des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Das Kulturnitrat wird 4mal mit der Hälfte seines VolumesDue to the method according to the invention, the culture nitrate is 4 times with half of its volume

wirtschaftlich günstige und einfache Methode zur Ein- mit Methylenchlorid extrahiert. Das Mycel wird miteconomically favorable and simple method for being extracted with methylene chloride. The mycelium is with

führung von Sauerstoff in der 15-Stellung und/oder Aceton gewaschen, getrocknet, gepulvert und ebenfallsguidance of oxygen in the 15-position and / or acetone washed, dried, powdered and also

12-Stellung des Steroidaloleküls gegeben. Besonders mehrmals mit Methylenchlorid extrahiert. Sämtliche12-position of the steroidal molecule given. Extracted several times with methylene chloride in particular. All

hervorzuheben ist die Tatsache, daß die Reaktion sehr 5 Extrakte werden vereinigt, mit Natriumsulfat getrocknetnoteworthy is the fact that the reaction is very 5 extracts are combined, dried with sodium sulfate

einheitlich und mit hohen Ausbeuten (etwa 90%) ver- und eingeengt. Man erhält 45 g eines Kristallisats. Durchconcentrated and concentrated uniformly and with high yields (about 90%). 45 g of crystals are obtained. By

läuft. Abkühlen der Mutterlauge erhält man weitere 5 g undruns. Cooling of the mother liquor gives a further 5 g and

Beispiel 1 ^^e* einer Chromatographie der Mutterlaugen rund 5 g.Example 1 ^ ^e * of a chromatography of the mother liquors around 5 g.

Die Kristalle werden aus Aceton umkristallisiert. ManThe crystals are recrystallized from acetone. Man

Von einem Malzagarröhrchen mit einer Kultur von 10 erhält 12/i,l 5<z-Dioxyprogesteron mit Fp. = 218° C;From a malt agar tube with a culture of 10, 12/1, l 5 <z-dioxyprogesterone with melting point = 218 ° C .;

Calonectria decora wird ein Flöckchen Mycel (der Pilz [a]f = -f-139° in Chloroform, bildet leicht Chlamydosporen) auf einen 500-ml-Schüttel-Calonectria decora becomes a flake of mycelium (the fungus [a] f = -f-139 ° in chloroform, easily forms chlamydospores) on a 500 ml shaking

kolben geimpft und mit 200 ml einer Nährlösung, be- Analyse: C₂₁H₃₀O₄.Flask inoculated and loaded with 200 ml of a nutrient solution, analysis: C ₂₁ H ₃₀ O ₄ .

stehend aus Berechnet ... C 72,81 %, H 8,73 %;from Calculated ... C 72.81%, H 8.73%;

5 % Glukose, ¹⁵ S^efunden ··· C 72,51%, H 8,90%. 0,2 % NaNO₃,
0,1 % KH₂PO₄,5% glucose, ¹⁵ ^found ··· C 72.51%, H 8.90%. 0.2% NaNO ₃ ,
0.1% KH ₂ PO ₄ ,

0,05 % KCl, Beispiel 20.05% KCl, Example 2

0,05 °/o MgSO₄ · 7 H₂O, _ao Mit einer wie im Beispiel 1 gewonnenen Schüttelkultur0.05% MgSO ₄ · 7 H ₂ O, _ao With a shaking culture obtained as in Example 1

0,002 °/₀ FeSO₄-7 H₂O und von Calonectria decora wird ein 6-1-Rührgefäß mit 410.002 ° / ₀ FeSO ₄ -7 H ₂ O and from Calonectria decora a 6-1 stirred vessel with 41

0,5 % konzentriertem Maisquellwasser. Nährlösung beimpft, bestehend aus0.5% concentrated corn steep water. Inoculates nutrient solution, consisting of

Der Kolben wird auf einer Schüttelmaschine 4 Tage 2,5 °/₀ Glukose,The piston is on a shaker for 4 days 2.5 ° / ₀ glucose,

geschüttelt. Nach dieser Zeit ist dickes, gallertartiges 25 0,1 °/o NaNO₃,shaken. After this time thick, gelatinous 25 0.1% NaNO ₃ ,

Mycel entstanden. Damit wird ein 6-1-Rührgefäß mit 41 °,05 °/o KH₂PO₄,Mycelium emerged. A 6-1 stirred vessel with 41 °, 05 ° / o KH ₂ PO ₄ ,

Nutzinhalt der gleichen Nährlösung beimpft. Die Be- 0,025 °/₀ KCl,Inoculated contents of the same nutrient solution. The loading 0.025 ° / ₀ KCl,

lüftung geschieht mit 1001 Luft/Stunde durch den 0,025% MgSO₄ ■ 7 H₂O,ventilation is done with 1001 air / hour through the 0.025% MgSO ₄ ■ 7 H ₂ O,

Rührer, an dessen unterem Ende eine Fritte zur Vertei- 0,001 % FeSO₄ · 7 H₂O,Stirrer, at the lower end of which a frit to distribute 0.001% FeSO ₄ · 7 H ₂ O,

lung der Luft angebracht ist. Es wird mit 200 Umdr./Min. 30 0,25 % konzentriertem Maisquellwasser, gerührt. Nach 2 Tagen ist der Inhalt des Rührgefäßesment of air is appropriate. It is at 200 rev / min. 30 0.25% concentrated corn steep water, touched. After 2 days the contents of the mixing vessel are

gut gewachsen und wird auf einen Versuchstank mit Es wird 24 Stunden lang mit 200 Umdr./Min. gerührtgrown well and is placed on a test tank with 200 rpm for 24 hours. touched

2001 Inhalt und 1201 einer Nährlösung geimpft, be- und mit 1001 Luft/Stunde belüftet. Hierauf werden 2 g2001 content and 1201 of a nutrient solution inoculated, fed and ventilated with 1001 air / hour. Thereupon 2 g

stehend aus lla-Oxyprogesteron und 2 g Tween 80 in Aceton gelöst,standing from lla-oxyprogesterone and 2 g Tween 80 dissolved in acetone,

35 einige Minuten zum Sieden erhitzt und zu der Kultur35 heated to the boil for a few minutes and added to the culture

2,5 % Glukose, gegeben. Nach weiteren 24 Stunden Rühren und Belüften2.5% glucose, given. After stirring and venting for a further 24 hours

0,1 % NaNO₃, wird aufgearbeitet. Man läßt die Kulturflüssigkeit durch0.1% NaNO ₃ is worked up. The culture liquid is passed through

0,05 % KH₈PO₄, einen Homogenisator kufen. Anschließend wird 4mal mit0.05% KH ₈ PO ₄ , run a homogenizer. Then 4 times with

0,025 % K Cl, Chloroform, und zwar mit der Hälfte des Volumens der0.025% K Cl, chloroform, with half the volume of the

0,025% MgSO₄-7 H₂O, ₄₀ Kulturflüssigkeit, extrahiert. Die Extrakte werden ver-0.025% MgSO ₄ -7 H ₂ O, ₄₀ % culture liquid, extracted. The extracts are

0,001% FeSO₄-7 H₂O, einigt, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt.0.001% FeSO ₄ -7 H ₂ O, combined, dried with sodium sulfate and concentrated.

0,25 % Maisquellwasser. Falls auch durch Animpfen des Sirups keine Kristallisation zu erreichen ist, wird chromatographiert.0.25% corn steep water. If there is no crystallization due to inoculation of the syrup is to be achieved, is chromatographed.

Es wird gerührt, und die Blasen der zugeführten Luft Eine Säule wird mit 450 g scharf getrocknetem Kieselwerden durch Zerschlagen an Prallflächen zerkleinert. 45 säuregel beschickt und mit Chloroform befeuchtet. Der Nach 24 Stunden werden 60 g Progesteron, in 11 Aceton Extrakt wird mehrmals mit Chloroform eingedampft, in gelöst, zugegeben. Nach weiteren 24 Stunden Rühren und 400 ml Chloroform gelöst und auf die Säule gegeben. Belüften wird der Tank abgebaut. Durch Zentrifugieren Die einzelnen Eluate betragen 400 ml. Stufenweise wird das Mycel von der Kulturflüssigkeit abgetrennt. werden 5 % Aceton zum Chloroform gegeben:It is stirred, and the bubbles of the supplied air. A column is filled with 450 g of sharply dried silica crushed by smashing against impact surfaces. 45 acid gel and moistened with chloroform. Of the After 24 hours, 60 g of progesterone in 11 acetone extract is evaporated several times with chloroform, in dissolved, added. After stirring for a further 24 hours, 400 ml of chloroform were dissolved and added to the column. The tank is dismantled when it is ventilated. By centrifugation. The individual eluates are 400 ml. Gradually the mycelium is separated from the culture fluid. 5% acetone are added to the chloroform:

5% Aceton 95% Chloroform Öl5% acetone 95% chloroform oil

10% Aceton 90% Chloroform Antischaummittel10% acetone 90% chloroform antifoam agent

15% Aceton 85% Chloroform Tween 8015% acetone 85% chloroform Tween 80

20% Aceton 80% Chloroform20% acetone 80% chloroform

25% Aceton 75% Chloroform25% acetone 75% chloroform

usw. bis 60% Aceton 40% lla,15a-Dioxyprogesteron.etc. up to 60% acetone 40% lla, 15a-dioxyprogesterone.

Das lla,15a-Dioxyprogesteron wird aus Essigester 60 Pilzes Calonectria decora werden 60 g Desoxycorticoumkristallisiert. Man erhält eine Substanz mit Fp. = 182 steronacetat, in Aceton gelöst, zugegeben. Nach bis 183° C; [α] £ = + 180° in Methanol. 24 Stunden Rühren und Belüften wird der Tank abgebautThe lla, 15a-dioxyprogesterone is recrystallized from ethyl acetate 60 Calonectria decora fungus, 60 g of deoxycortico are recrystallized. A substance with melting point = 182 sterone acetate dissolved in acetone is obtained. To up to 183 ° C; [α] £ = + 180 ° in methanol. The tank is dismantled for 24 hours of stirring and aeration

. , r TT D ^un(i ^ Kulturlösung wie im Beispiel 1 aufgearbeitet.. , r TT D ^{un (i} ^ culture solution worked up as in Example 1.

υ w Γ70Β1.1 tjö «ο/ ^{Aus den} vereinigten stark eingeengten Extrakten kri-υ w Γ70Β1.1 tjö «ο / ^{From the} combined, strongly concentrated extracts critically

Berechnet... C72,81%, Η8,Λ$%; _{6g sta}vji_siereil 29,5g lSa-Desoxycorticosteron in prismengefunden ... C72,51%, H8,90%. förmigen Kristallen aus. Durch Chromatographieren derCalculated ... C72.81%, Η8, Λ $%; _{6g sta} vji _siereil 29.5g lSa-deoxycorticosterone found in prisms ... C72.51%, H8.90%. shaped crystals. By chromatographing the

Mutterlauge werden noch 2 bis 3 g der gleichen SubstanzMother liquor is still 2 to 3 g of the same substance

Beispiel 3 gewonnen. Nach dem Umkristallisieren aus Aceton be-Example 3 won. After recrystallization from acetone,

Die Versuchsanordnung ist dieselbe wie bei Beispiel 1. trägt der Schmelzpunkt 224 bis 226° C; [α]" = H- 200° Zu 1201 einer gut gewachsenen submersen Kultur des 70 in Äthanol.The experimental setup is the same as in Example 1, the melting point is 224 to 226 ° C; [α] "= H-200 ° To 1201 of a well-grown submerged culture of the 70 in ethanol.

Analyse C₂₁H₃₀O₄.Analysis C ₂₁ H ₃₀ O ₄ .

Berechnet ... C 72,81 °/₀, H 8,73 %;
gefunden ... C 72,87 %, H 8,75 %.Calculated ... C 72.81 ° / _0, H 8.73%;
found ... C 72.87%, H 8.75%.

Example 4

Die Versuchsanordnung ist dieselbe wie bei Beispiel 2. Als Substrat werden zu 41 einer submersen Kultur von Calonectria decora 2 g Ketoprogestcron und 2 g Emulgierungsmittel, bekannt unter dem Handelsnamen Tween 80, in Aceton gelöst, zugegeben. Nach dem Extrahieren werden die Extrakte vereinigt und stark eingeengt, zuletzt im Vakuum. Man erhält aus dem Sirup über 60 °/₀ des Umsatzproduktes.The experimental setup is the same as in Example 2. 2 g of ketoprogestcrone and 2 g of emulsifying agent, known under the trade name Tween 80, dissolved in acetone, are added as substrate to a submerged culture of Calonectria decora. After extraction, the extracts are combined and strongly concentrated, finally in vacuo. Is obtained from the syrup over 60 ° / ₀ of the sales product.

Das lSa-Oxy-11-ketoprogesteron wird durch Umkristallisieren in Aceton gereinigt. Der Schmelzpunkt beträgt 224bis 228° C; [α] j? = + 257° in Äthanol.The lSa-oxy-11-ketoprogesterone is made by recrystallization purified in acetone. The melting point is 224 to 228 ° C; [α] j? = + 257 ° in ethanol.

Analyse C₈₁H₂₉O₄.Analysis C ₈₁ H ₂₉ O ₄ .

Berechnet ... C 73.23 %, H 8,19%;
gefunden ... C 73,14 %, H 8,35 %.Calculated ... C 73.23%, H 8.19%;
found ... C 73.14%, H 8.35%.

Example 5

Die Versuchsanordnung ist dieselbe wie bei Beispiel 2. Zu 41 einer gut gewachsenen Kultur von Calonectria decoraThe experimental set-up is the same as in Example 2. To 41 of a well-grown culture of Calonectria decora

ίο werden 2 g Pregnenolon und 2 g »Tween 80«, in Aceton gelöst, zugegeben. Die Lösung wird einige Zeit zum Sieden erhitzt. Nach 48 Stunden Rühren und Belüften wird der Ansatz entsprechend Beispiel 2 aufgearbeitet. Einen Teil des Pregnenolons erhält man bereits beim Eindampfen der Extrakte zurück'. Es wird abfiltriert und das Filtrat mit Kieselsäuregel chromatographiert wie im Beispiel 2: Fraktion:ίο are 2 g of pregnenolone and 2 g of "Tween 80" in acetone dissolved, added. The solution is heated to boiling for some time. After 48 hours of stirring and ventilation, the Approach according to Example 2 worked up. Part of the pregnenolone is obtained when evaporating the extracts back '. It is filtered off and the filtrate is chromatographed with silica gel as in Example 2: Fraction:

100 % Chloroform100% chloroform

95°/₀ Chloroform95 ° / ₀ chloroform

90% Chloroform90% chloroform

85% Chloroform85% chloroform

usw. bis20°/₀ Chloroformetc. to 20 ° / ₀ chloroform

5°/o Aceton 10°/₀ Aceton 15°/o Aceton 80% Aceton Öl5 ° / o acetone 10 ° / ₀ acetone 15 ° / o acetone 80% acetone oil

AntischaummittelAntifoam agents

Tween 80Tween 80

wenig Pregnenolonlittle pregnenolone

12/9,15a-Dioxyprogesteron12 / 9,15a-dioxyprogesterone

Die Substanz, die aus den Fraktionen 20 % Chloroform und 80% Aceton erhalten wird, hat nach Umkristallisation in Aceton einen Schmelzpunkt von 218° C und [α] 5,° = + 140° in Chloroform. Die Substanz ist mit der im Beispiel 1 erhaltenen identisch.The substance obtained from the fractions of 20% chloroform and 80% acetone has after recrystallization in acetone a melting point of 218 ° C and [α] 5, ° = + 140 ° in chloroform. The substance is with that obtained in Example 1 identical.

Analyse C₂₁H₃₁O₄.Analysis C ₂₁ H ₃₁ O ₄ .

Berechnet
gefundenCalculated
found

C 72,81 %,
C 72,56%,C 72.81%,
C 72.56%,

H 8,73%;
H 8,80%.H 8.73%;
H 8.80%.

3535

Example 6

Die Versuchsanordnung ist dieselbe wie im Beispiel 2. Als Substrat wird 11/9-Hydroxyprogesteron eingesetzt. Nach der Chromatographie erhält man HjS,15a-Dihydroxyprogesteron, welches nach dem Umkristallisieren in Aceton bei 173bis 175°Cschmilzt; [α]κ = + 230° in CHCl₃.The experimental set-up is the same as in Example 2. 11/9 hydroxyprogesterone is used as the substrate. Chromatography gives HjS, 15a-dihydroxyprogesterone which, after recrystallization in acetone, melts at 173 to 175 ° C; [α] κ = + 230 ° in CHCl ₃ .

Example 7

Bei Einsatz von Pregnandion-(3,20) oder Allopregnandion-(3,20) erhält man die in 12/3- und 15a-Stellung hydroxylierten Steroide der Normal- oder Alloreihe. Das Umsatzprodukt der Normalform schmilzt bei 225 bis 231° C, und der Drehwert beträgt [a]_D = + 56°in CHCl₃; das Umsatzprodukt der Alloform schmilzt bei 253 bis 257° C, und der Drehwert beträgt [α] _D = + 70° in Methanol.When using pregnandione (3.20) or allopregnandione (3.20) one obtains the steroids of the normal or allore series which are hydroxylated in the 12/3 and 15a position. The conversion product of the normal form melts at 225 to 231 ° C., and the rotation value is [a] _D = + 56 ° in CHCl ₃ ; the conversion product of the alloform melts at 253 to 257 ° C., and the rotation value is [α] _D = + 70 ° in methanol.

Example 8

Analog wie im Beispiel 7 werden auch lla-Hydroxypregnandion-(3,20) und lla-Hydroxyallopregnandion-(3,20) von dem Pilz umgesetzt, und zwar wird in diesen Fällen nur in 15-Steilung eine Hydroxylgruppe eingeführt. Der Schmelzpunkt der Normalform des Umsatzproduktes beträgt 175 bis 177° C, der Drehwert [a]j> = 109° CAnalogously to example 7, Ila-hydroxypregnandione (3.20) and IIIa-hydroxyallopregnandione- (3,20) converted by the fungus, namely in these Cases only introduced a hydroxyl group in the 15-position. The melting point of the normal form of the conversion product is 175 to 177 ° C, the rotation value [a] j> = 109 ° C

dion-(3,20) schmilzt bei 208 bis 210° C; [a] %° = + 105° in CHCl₃.dione- (3.20) melts at 208-210 ° C; [a]% ° = + 105 ° in CHCl ₃ .

Example 9

Durch die Einwirkung des Pilzes Calonectria decora wird bei Einsatz von 14a-Hydroxyprogesteron nur die 12/5-Stellung hydroxyliert. Das entstandene 12/J,14a-Dihydroxyprogesteron hat nach dem Umkristallisieren in Aceton einen Schmelzpunkt von 241 bis 242° C und einen Drehwert von [a]/> = + 127° in CHCl₃.Due to the action of the fungus Calonectria decora, only the 12/5 position is hydroxylated when 14a-hydroxyprogesterone is used. The resulting 12 / J, 14a-dihydroxyprogesterone has, after recrystallization in acetone, a melting point of 241 to 242 ° C. and a rotation value of [a] /> = + 127 ° in CHCl ₃ .

Example 10

Setzt man mit dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 9a-Hydroxyprogesteron der Einwirkung der Fermente des Pilzes Calonectria decora aus, so erhält man 9ot,15a-Dihydroxyprogesteron mit Schmelzpunkt 240 bis 242° C; [a]D= +131° in CHCl₃.If 9a-hydroxyprogesterone is exposed to the ferments of the fungus Calonectria decora using the same method as in Example 1, 9ot, 15a-dihydroxyprogesterone with a melting point of 240 to 242 ° C. is obtained; [a] D = + 131 ° in CHCl ₃ .

-I-109° in CHCl₃. Das lla.lSa-Dihydroxyallopregnan--I-109 ° in CHCl ₃ . The lla.lSa-dihydroxyallopregnan-

Example 11

Hydroxyliert man nach Beispiel 1 15a-Hydroxyprogesteron mit Calonectria decora, so erhält man I2ß,15a-Dihydroxyprogesteron mit Schmelzpunkt 218° C; [a)_D = + 139° in CHCl₃.If 15a-hydroxyprogesterone is hydroxylated with Calonectria decora according to Example 1, then I2β, 15a- dihydroxyprogesterone with a melting point of 218 ° C is obtained; [a) _D = + 139 ° in CHCl ₃ .

Claims

Patent claims:

1. Method of introducing hydroxyl groups in steroids by the action of microorganisms, characterized in that one steroids which in 17-position do not have any O Η groups, in known Way subjected to aerobic treatment with enzymes of Calonectria decora and the obtained Refurbished products in a known manner.

2. The method according to claim 1, characterized in that that the mushroom strain Calonectria decora from the Centraalbureau voor Schimmelcultures Baarn (Netherlands) used.

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& 909 638/389 10.59 & 909 638/389 10.59