DE1049859B

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Publication number: DE1049859B
Application number: DENDAT1049859D
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Publication date: 1959-02-05

Description

Verfahren zur Einführung einer Hydroxylgruppe in die 12-Stellung von Reichsteins Verbindung S Es ist bereits bekannt, daß man auf biochemischem Wege Hydroxylgruppen als Substituenten an den verschiedensten Stellen in das Molekül von Steroiden einführen kann. Jedoch ist eine Einführung in die 12-Stellung allein auf diesem Wege bisher nicht beschrieben. 'Man kennt lediglich eine gleichzeitige Einführung von Hyoxylgruppen in die 12- und 15-Stellung (vgl. Chem. Ber., Bd. 90, 1957, S. 2576ff).Method of introducing a hydroxyl group into the 12-position of Reichstein's compound S It is already known that one biochemically Hydroxyl groups as substituents in various places in the molecule of steroids can introduce. However, an introduction to the 12-position is alone not previously described in this way. 'You only know one at a time Introduction of hyoxyl groups in the 12- and 15-position (cf. Chem. Ber., Vol. 90, 1957, pp. 2576ff).

Es wurde nun gefunden, daß bei der Incubation von Reichsteins Verbindung S (4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion) mit dem Pilz Coniothyrium hellebori, Rasse 078, aus der Klasse Fungi imperfecti und der Reihe Sphaeropsidales neben dem als Hauptprodukt in 50°/oiger ausbeute entstehenden Hydrocortison (4-Pregnen-11f,17a,21-triol-3,20-dion) in mindestens 25°'oiger -ausbeute auch 4-Pregnen-12ß,17a,21-triol-3,20-dion gebildet wird.It has now been found that with the incubation of Reichstein's connection S (4-Pregnen-17a, 21-diol-3,20-dione) with the fungus Coniothyrium hellebori, breed 078, from the Fungi imperfecti class and the Sphaeropsidales series as well as the main product Hydrocortisone (4-pregnen-11f, 17a, 21-triol-3,20-dione) produced in 50% yield 4-Pregnen-12ß, 17a, 21-triol-3,20-dione were also formed in at least 25% yield will.

Dieser Befund ist um so überraschender, als nach den Angaben der britischen Patentschrift 749 -l14 bei der Incubation des gleichen Ausgangsmaterials mit nahestehenden Pilzen der gleichen Klasse und Reihe als Nebenprodukt ausschließlich 11-epi-Hydrocortison zu erwarten war.This finding is all the more surprising as according to the information provided by the British Patent 749-114 on the incubation of the same starting material with related ones Mushrooms of the same class and series as a by-product exclusively 11-epi-hydrocortisone was to be expected.

Bei dem erfindungsgemäßen `'erfahren fallen Haupt-und Nebenprodukt der Kulturfiltratextrakte zunächst als kristallines Gemisch an. Seine vollständige Ruftrennung durch Kristallisation ist schwierig und verlustreich. Acetyliert man das nicht weiter aufzutrennende Gemisch unter normalen milden Bedingungen, so entstehen vorwiegend die Monoacetate beider Verbindungen, die sich ebenfalls nur schwer trennen lassen. Acetyliert man dagegen das Gemisch bei höherer Temperatur, so bildet sich neben dem 21-Monoacetat des Hydrocortisons das 12f3,21 -Diacetat des -1-Pregnen-12ß,17a,21-triol-3,20-dions. Die Trennung dieser Verbindung durch Kristallisation, Gegenstromverteilung oder Verteilungsclironiatographie bereitet nun keine Schwierigkeiten und gelingt praktisch quantitativ.In the case of the `` 'experience according to the invention, the main product and the by-product fall the culture filtrate extracts initially as a crystalline mixture. Its full Call separation through crystallization is difficult and lossy. One is acetylated the mixture, which cannot be further separated under normal mild conditions, is formed mainly the monoacetates of both compounds, which are also difficult to separate permit. On the other hand, if the mixture is acetylated at a higher temperature, it is formed in addition to the 21-monoacetate of hydrocortisone, the 12f3,21 -diacetate of -1-pregnen-12ß, 17a, 21-triol-3,20-dione. The separation of this compound by crystallization, countercurrent distribution or Distribution clironiatography does not present any difficulties and works in practice quantitatively.

Das auf diese ""eise rein erhältliche 4-Pregnen-12ß,17a,21-triol-3,20-dion-12@,21-diacetat ist ein wertvolles Ausgangsprodukt für Synthesen in der Steroidreihe, insbesondere zur Herstellung pharmazeutisch interessanter Verbindungen.4-Pregnen-12ß, 17a, 21-triol-3,20-dione-12 @, 21-diacetate, which can be obtained purely in this way is a valuable starting product for syntheses in the steroid series, in particular for the production of pharmaceutically interesting compounds.

Beispiel Es werden 2,4 1 einer Nährlösung hergestellt, die pro Liter folgende Bestandteile enthält: 50 g Dextrose, 10 g Biomalz, 2 g Natriumnitrat, I g prim. Kaliumphosphat, 0,5 g Kaliunichlorid, 0,5 g 1lagnesiunisulfat, 0,02 g Eisensulfat.Example 2.4 1 of a nutrient solution are prepared per liter contains the following ingredients: 50 g dextrose, 10 g organic malt, 2 g sodium nitrate, I. g prim. Potassium phosphate, 0.5 g potassium chloride, 0.5 g magnesium sulfate, 0.02 g iron sulfate.

,je 1,21 der Lösung werden in einen Laborfermenter von 2 1 Inhalt gegeben und hierin 30 Minuten bei 120'C und 1 atü im :@utoklav sterilisiert. Die Fermenter bestehen aus einem Glasgefäß mit einem Deckel aus rostfreiem Stahl; sie sind ausgerüstet mit einem Turbinenrührer, Zugabestutzen, Lufteinleitungsrohr und Luftableitung. Jeder Fermenter wird mit etwa 1 -Milliarde Sporen des Coniothyrium hellebori, Rase 078, in Form einer wäßrigen Suspension beimpft und dann 48 Stunden bei 25'C mit 500 Up- gerührt. Inzwischen wird in einem Stahlfermenter mit 50 1 Fassungsvermögen eine Lösung von 1,5 kg Dextrose, 30 g prim. Kaliumphosphat und 90 g --'"-atriumnitrat in 30 1 Leitungswasser bereitet und diese 40 Minuten bei 120°C und 1 atü sterilisiert. , 1.21 each of the solution are placed in a laboratory fermenter with a capacity of 2 liters and sterilized in the autoclave for 30 minutes at 120 ° C and 1 atm. The fermenters consist of a glass jar with a stainless steel lid; they are equipped with a turbine stirrer, addition nozzle, air inlet pipe and air outlet. Each fermenter is inoculated with about 1 billion spores of Coniothyrium hellebori, Rase 078, in the form of an aqueous suspension and then stirred for 48 hours at 25 ° C. at 500 rpm. In the meantime, a solution of 1.5 kg dextrose, 30 g prim. Potassium phosphate and 90 g - '"- atrium nitrate in 30 liters of tap water and these sterilized for 40 minutes at 120 ° C and 1 atm.

Die Kulturen aus den beiden Laborfermentern werden steril entnommen, gemischt und von der -Mischung 1,6 1 zur Beimpfung des 50-1-Fermenters verwendet.The cultures from the two laboratory fermenters are removed sterile, mixed and used from the mixture 1.6 1 for inoculating the 50-1 fermenter.

Nach 24stündigem Rühren unter Durchleiten von 1 bis 2 cbm Luft je Stunde (25'C) werden 5 g Reichsteins Verbindung S in 40 ccm sterilem Dimetliylformamid zugegeben. Die gleiche Menge wird noch zweimal jeweils im Abstand von 24 Stunden zugesetzt. 24 Stunden nach der letzten Zugabe wird die Kultur dem Fermenter entnommen, filtriert und das Kulturfiltrat in einem -westfalia,:-Zentrifugalextraktor i-ierni@il mit je 41 Methylisobutylketon extrahiert. Nach chromatograpliischer Analyse enthält der Extrakt 7,9 g Hy#drocortison und 3,9 g 4-Pregnen-l2ß,17a,21-triol-3,20-dion.After stirring for 24 hours while passing 1 to 2 cbm of air through each Hour (25'C) 5 g of Reichstein's compound S in 40 ccm of sterile dimethylformamide admitted. The same amount is given twice, each time with an interval of 24 hours added. 24 hours after the last addition, the culture is removed from the fermenter, filtered and the culture filtrate in a -westfalia,: - centrifugal extractor i-ierni @ il extracted with 41 methyl isobutyl ketone each. Contains according to chromatographic analysis the extract 7.9 g of hydrocortisone and 3.9 g of 4-pregnene-12β, 17a, 21-triol-3,20-dione.

Der Extrakt wird im Vakuum bis auf etwa 150 ccni eingedampft. Beim Abkühlen kristallisiert die erste Fraktion aus, das Filtrat wird wieder eingedampft und durch Kühlen weitere Kristallfraktionen gewonnen, die vereinigt und getrocknet werden. Alan erhält auf diese Weise 11 g eines Produktes, das 66°;a H@,drocortison und 27°;ä 4-Pregnen-12@,17a,21-triol-3,20-dion enthält.The extract is evaporated in vacuo to about 150 ccni. At the The first fraction crystallizes out when cooling, the filtrate is evaporated again and further crystal fractions obtained by cooling, which are combined and dried will. Alan receives in this way 11 g of a product which is 66 °; a Contains H @, drocortisone and 27 °; ä 4-Pregnen-12 @, 17a, 21-triol-3,20-dione.

Das Rohprodukt wird zweimal aus @@tliy#leticlilorid umkristallisiert, wodurch man 7 g chrornatographisch reines Hydrocortison vom F.212 bis 215`C erhält. Die Mutterlaugen werden eingedampft und der Rückstand finit 10 ccm Pyridin aufgenommen, 5 ccm @ssigs<iureanhydrid zugesetzt und das Gemisch 8 Stunden auf 50` C erhitzt. Das Reaktionsprodukt wird nach üblicher Aufarbeitung auf cire Säule gegeben, die 20 g mit .äthy@eng@ykol imprägniertes CeIite, d. h. eine unter diesem Handelsnamen bekannte Mischung verschiedener Kieselerden, enthält. Eluierung mit einem Gemisch aus 3 Teilen CycloheNan und 1 Teil Methylenchlorid ergibt 3,5 g kristallines Material. Durch L'mkristallisieren aus «wenig @s-äßrigcni Methanol erhält man 3 g 4-Pregnen-12p,17a, 21-triol-3,20-dion-12f3,21-diacetat. F. 155 bis 157'C; F_38 17 000 _-a],, _ -f- 122° (Chlf.) Die Elementaranalyse bestätigt die Zusammensetzung der Verbindung. Der Mischschmelzpunkt mit einem authentischen Präparat (J. Chem. Soc., 1955, S. 870) gibt keine Depression. Die Infrarotspektren beider Substanzen sind praktisch identisch.The crude product is recrystallized twice from @@ tliy # leticlilorid, whereby 7 g of chromatographically pure hydrocortisone from F.212 to 215`C are obtained. The mother liquors are evaporated and the residue is finely taken up 10 cc of pyridine, 5 cc of acetic acid anhydride is added and the mixture is heated to 50 ° C. for 8 hours. After the usual work-up, the reaction product is applied to a cire column which contains 20 g of celite impregnated with ethy @ eng @ ycol, ie a mixture of different silicas known under this trade name. Elution with a mixture of 3 parts of CycloheNan and 1 part of methylene chloride gives 3.5 g of crystalline material. By crystallizing from a little @ s-aqueous methanol, 3 g of 4-pregnene-12p, 17a, 21-triol-3,20-dione-12f3,21-diacetate are obtained. M.p. 155 to 157'C; F_38 17 000 _-a] ,, _ -f- 122 ° (Chlf.) The elemental analysis confirms the composition of the compound. The mixed melting point with an authentic preparation (J. Chem. Soc., 1955, p. 870) gives no depression. The infrared spectra of both substances are practically identical.

Claims

l '. \ TEXTANsri; ccile: I. Method of introducing a hydroxyl group into the 12-position of Reichstein's compound S, that characterized by being richest; Ver bond S in a known manner of the action of the Enzymes of the fungus Coniothyrium hellebori from the Class Fungi iniperfecti and the series Sphaerop- @ ida @ e: in an n-aqueous medium in the presence subject to oxygen and the mixture of the standing hydroxylated steroids and separates. 2. The method according to claim 1, characterized draws that the separated mixture of the hydrosylated steroids, if necessary after removal separation of the main amount of as the main product Hydrocortisone formed by crystallization from. @ tliy, -lenclilorid, before further separation acetylation at elevated temperature throws and the resulting 4-pregnen-12ß, 17a, 21-triol-3,20-dione-12β, 21-diacetate from the one next to it resulting hydrocortisone-21-monoacetate in it with- partly separated by partition chromatography.