DE1067020B - Verfahren zur Einführung von Hydroxylgruppen in Ste roide - Google Patents

Description

,1

BUNDESREPUBLIK. DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

kl. 12 ο 25/05

INTERNAT. Kl. C 07 C

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT 1067 020

V12658 IVb/12o

ANMELDETAG! 25.JUNI1957

BEKANNTMACHUNG DER ANMELDUNG UND AUSCABE DER AXJSLEGESCHKIFT:

15.OKTOBER19S9

Die Erfindung betrifft die Herstellung von hydroxylierten Steroiden auf mikrobiellem Wege.

Es ist bekannt, daß Sauerstoff auf mikrobiellem Wege in Steroide eingeführt werden kann. Besondere Bedeutung erlangte die Einführung des Sauerstoffs in die Stellung 11 sowie in die Stellung 17. Es ist möglich, auf diesem Wege Hydroxylierungen durchzuführen, die sonst nur durch außerordentlich schwierige chemische Synthesen über viele Zwischenstufen erreicht werden.

Diese Synthesen sind deshalb besonders vorteilhaft, weil die Steroide als Heilmittel äußerst wichtig sind.

Bis jetzt sind mikrobielle Hydroxylierungen in den Stellungen 1, 2, 9, 12, 18 und 19 noch nicht bekanntgeworden; es ist deshalb von großer Wichtigkeit, die Hydroxyherungen in diesen Stellungen auf mikrobieUem Wege zu versuchen, weil die Möglichkeit besteht, weitere wirksame Heilmittel darzustellen. Bei vielen mikrobiellen Hydroxylierungen tritt der bemerkenswerte Nachteil ein, daß die Einführung der Sauerstoffunktion nicht spezifisch erfolgt, sondern daß gleichzeitig an mehreren Stellen des Moleküls eine oder zwei Hydroxylgruppen eingeführt werden, so daß ein Gemisch verschiedener hydroxylierter Steroide entsteht, aus dem nur sehr schwer einheitliche Verbindungen isoliert werden können. Es ist deshalb bei der mikrobiellen Umsetzung von vornherein wichtig, daß die gewünschte Hydroxylierung möglichst einheitlich, d. h. mit hohen Ausbeuten vorgenommen werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Einführung von einer oder zwei Sauerstoffunktion en in ein Steroidmolekül, wobei die erste Hydroxylgruppe in den 5-Ring des Steroidmoleküls und gegebenenfalls die zweite Hydroxylgruppe in den Ring C des Steroidmoleküls eingeführt wird.

Erfindungsgemäß führt man Hydroxylgruppen in Steroide, die in 17-Steilung keine OH-Gruppe besitzen, ein durch aerobe Behandlung mit Enzymen von Calonectria decora. Es ist zwar bekannt, für die Dehydrierung von Steroiden die Enzyme des Schimmelpilzes CaIonectria decora zu verwenden. Die Nacharbeitung der Versuche mit Calonectria decora (Centraalbureau voor Schimmelcultures Baarn [Niederlande]) hat jedoch ergeben, daß in keinem Falle eine Dehydrierung stattfindet. Das erfindungsgemäße Verfahren ist demgegenüber außerordentlich überraschend, und der eintretende Effekt der Hydroxylierung war nicht vorauszusehen. Je nach dem Steroid, .das als Ausgangssubstanz verwendet wird, erhält man Stoffe, die eine OH-Gruppe in 12- und/oder 15-Stellung des Steroidgerüstes haben. So erfolgt die Einführung der OH-Gruppen beispielsweise beim Progesteron, ll/3-Hydroxypregnendion-(3,20), AlIopregnandion-(3,20) in 12- und 15-Stellung, beim 15a-Hydroxyprogcsteron, 14a-Hydroxyprogesteron und bei den analogen in 4,5-Stellung hydrierten Pregnan- oder AUopregnanverbindungen in 12-Stcllung, beim lla-Hydroxy-Verfahren zur Einführung
von Hydroxylgruppen in Steroide

Anmelder:

VEB Jenapharm,
Jena, Otto-Schott-Straße

Dipl.-Chem. Dr. Alfred Schubert,

Dipl.-Chem. Rudolf Siebert

und Dipl.-Chem. Gerhard Langbein, Jena,

sind als Erfinder genannt worden

progesteron, 11-Ketoprogesteron Desoxycorticosteron, 9a-Hydroxyprogestcron, lla-Hydroxyallopregnandion-

(3,20) und Pregnantrion-(3,6,20) in 15-Stellung.

Besonders ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren hervorzuheben, daß nicht nur, wie bisher bekannt wurde, vorzugsweise Steroide, die das Δ ⁴-3-Ketosystem besitzen, in dieser Weise umgesetzt werden, sondern daß auch Ver-

bindungen ohne Doppelbindung ini Ring A oder B, die der Pregnan- oder Allopregnanreme angehören, von dem Pilzstamm hydroxyliert werden. Diese spezielle Hydroxy-Eerungi bei der einmal der King D und/oder der Ring C substituiert wird, wurde bisher noch nicht beschrieben.

Nach dem Verfahren kann die 15-Stellung selektiv hydroxyliert werden, wenn am Pregnanskelett, beispielsweise an C 21, eine Oxy-, Acetoxy- oder Propionoxygruppe steht. In diesem Fall tritt in der 12-Stellung keine Hydroxylierung ein.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden viele neue Verbindungen hergestellt, die durch kein anderes Verfahren zugänglich sind.

Die Aufarbeitung der mit dem Schimmelpilz Calonectria decora umgesetzten Steroide erfolgt nach den üblichen

Methoden, nämlich Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Methylenchlorid oder Essigester. Die Substanzen kristallisieren in den meisten Fällen beim Abdampfen des Lösungsmittels aus. Ihre Isolation kann vorteilhafterweise auch durch Chromato-

graphic an Kieselsäuregel erfolgen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Schimmelpilz Calonectria decora aus dem Centraalbureau voor Schimmelcultures Baarn (Niederlande) verwendet.

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Auf Grund des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Das Kulturnitrat wird 4mal mit der Hälfte seines Volumes

wirtschaftlich günstige und einfache Methode zur Ein- mit Methylenchlorid extrahiert. Das Mycel wird mit

führung von Sauerstoff in der 15-Stellung und/oder Aceton gewaschen, getrocknet, gepulvert und ebenfalls

12-Stellung des Steroidaloleküls gegeben. Besonders mehrmals mit Methylenchlorid extrahiert. Sämtliche

hervorzuheben ist die Tatsache, daß die Reaktion sehr 5 Extrakte werden vereinigt, mit Natriumsulfat getrocknet

einheitlich und mit hohen Ausbeuten (etwa 90%) ver- und eingeengt. Man erhält 45 g eines Kristallisats. Durch

läuft. Abkühlen der Mutterlauge erhält man weitere 5 g und

Beispiel 1 ^^e* einer Chromatographie der Mutterlaugen rund 5 g.

Die Kristalle werden aus Aceton umkristallisiert. Man

Von einem Malzagarröhrchen mit einer Kultur von 10 erhält 12/i,l 5<z-Dioxyprogesteron mit Fp. = 218° C;

Calonectria decora wird ein Flöckchen Mycel (der Pilz [a]f = -f-139° in Chloroform, bildet leicht Chlamydosporen) auf einen 500-ml-Schüttel-

kolben geimpft und mit 200 ml einer Nährlösung, be- Analyse: C₂₁H₃₀O₄.

stehend aus Berechnet ... C 72,81 %, H 8,73 %;

5 % Glukose, ¹⁵ S^efunden ··· C 72,51%, H 8,90%. 0,2 % NaNO₃,
0,1 % KH₂PO₄,

0,05 % KCl, Beispiel 2

0,05 °/o MgSO₄ · 7 H₂O, _ao Mit einer wie im Beispiel 1 gewonnenen Schüttelkultur

0,002 °/₀ FeSO₄-7 H₂O und von Calonectria decora wird ein 6-1-Rührgefäß mit 41

0,5 % konzentriertem Maisquellwasser. Nährlösung beimpft, bestehend aus

Der Kolben wird auf einer Schüttelmaschine 4 Tage 2,5 °/₀ Glukose,

geschüttelt. Nach dieser Zeit ist dickes, gallertartiges 25 0,1 °/o NaNO₃,

Mycel entstanden. Damit wird ein 6-1-Rührgefäß mit 41 °,05 °/o KH₂PO₄,

Nutzinhalt der gleichen Nährlösung beimpft. Die Be- 0,025 °/₀ KCl,

lüftung geschieht mit 1001 Luft/Stunde durch den 0,025% MgSO₄ ■ 7 H₂O,

Rührer, an dessen unterem Ende eine Fritte zur Vertei- 0,001 % FeSO₄ · 7 H₂O,

lung der Luft angebracht ist. Es wird mit 200 Umdr./Min. 30 0,25 % konzentriertem Maisquellwasser, gerührt. Nach 2 Tagen ist der Inhalt des Rührgefäßes

gut gewachsen und wird auf einen Versuchstank mit Es wird 24 Stunden lang mit 200 Umdr./Min. gerührt

2001 Inhalt und 1201 einer Nährlösung geimpft, be- und mit 1001 Luft/Stunde belüftet. Hierauf werden 2 g

stehend aus lla-Oxyprogesteron und 2 g Tween 80 in Aceton gelöst,

35 einige Minuten zum Sieden erhitzt und zu der Kultur

2,5 % Glukose, gegeben. Nach weiteren 24 Stunden Rühren und Belüften

0,1 % NaNO₃, wird aufgearbeitet. Man läßt die Kulturflüssigkeit durch

0,05 % KH₈PO₄, einen Homogenisator kufen. Anschließend wird 4mal mit

0,025 % K Cl, Chloroform, und zwar mit der Hälfte des Volumens der

0,025% MgSO₄-7 H₂O, ₄₀ Kulturflüssigkeit, extrahiert. Die Extrakte werden ver-

0,001% FeSO₄-7 H₂O, einigt, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt.

0,25 % Maisquellwasser. Falls auch durch Animpfen des Sirups keine Kristallisation zu erreichen ist, wird chromatographiert.

Es wird gerührt, und die Blasen der zugeführten Luft Eine Säule wird mit 450 g scharf getrocknetem Kieselwerden durch Zerschlagen an Prallflächen zerkleinert. 45 säuregel beschickt und mit Chloroform befeuchtet. Der Nach 24 Stunden werden 60 g Progesteron, in 11 Aceton Extrakt wird mehrmals mit Chloroform eingedampft, in gelöst, zugegeben. Nach weiteren 24 Stunden Rühren und 400 ml Chloroform gelöst und auf die Säule gegeben. Belüften wird der Tank abgebaut. Durch Zentrifugieren Die einzelnen Eluate betragen 400 ml. Stufenweise wird das Mycel von der Kulturflüssigkeit abgetrennt. werden 5 % Aceton zum Chloroform gegeben:

5% Aceton 95% Chloroform Öl

10% Aceton 90% Chloroform Antischaummittel

15% Aceton 85% Chloroform Tween 80

20% Aceton 80% Chloroform

25% Aceton 75% Chloroform

usw. bis 60% Aceton 40% lla,15a-Dioxyprogesteron.

Das lla,15a-Dioxyprogesteron wird aus Essigester 60 Pilzes Calonectria decora werden 60 g Desoxycorticoumkristallisiert. Man erhält eine Substanz mit Fp. = 182 steronacetat, in Aceton gelöst, zugegeben. Nach bis 183° C; [α] £ = + 180° in Methanol. 24 Stunden Rühren und Belüften wird der Tank abgebaut

. , r TT D ^un(i ^ Kulturlösung wie im Beispiel 1 aufgearbeitet.

υ w Γ70Β1.1 tjö «ο/ ^{Aus den} vereinigten stark eingeengten Extrakten kri-

Berechnet... C72,81%, Η8,Λ$%; _{6g sta}vji_siereil 29,5g lSa-Desoxycorticosteron in prismengefunden ... C72,51%, H8,90%. förmigen Kristallen aus. Durch Chromatographieren der

Mutterlauge werden noch 2 bis 3 g der gleichen Substanz

Beispiel 3 gewonnen. Nach dem Umkristallisieren aus Aceton be-

Die Versuchsanordnung ist dieselbe wie bei Beispiel 1. trägt der Schmelzpunkt 224 bis 226° C; [α]" = H- 200° Zu 1201 einer gut gewachsenen submersen Kultur des 70 in Äthanol.

Analyse C₂₁H₃₀O₄.

Berechnet ... C 72,81 °/₀, H 8,73 %;
gefunden ... C 72,87 %, H 8,75 %.

Beispiel 4

Die Versuchsanordnung ist dieselbe wie bei Beispiel 2. Als Substrat werden zu 41 einer submersen Kultur von Calonectria decora 2 g Ketoprogestcron und 2 g Emulgierungsmittel, bekannt unter dem Handelsnamen Tween 80, in Aceton gelöst, zugegeben. Nach dem Extrahieren werden die Extrakte vereinigt und stark eingeengt, zuletzt im Vakuum. Man erhält aus dem Sirup über 60 °/₀ des Umsatzproduktes.

Das lSa-Oxy-11-ketoprogesteron wird durch Umkristallisieren in Aceton gereinigt. Der Schmelzpunkt beträgt 224bis 228° C; [α] j? = + 257° in Äthanol.

Analyse C₈₁H₂₉O₄.

Berechnet ... C 73.23 %, H 8,19%;
gefunden ... C 73,14 %, H 8,35 %.

Beispiel 5

Die Versuchsanordnung ist dieselbe wie bei Beispiel 2. Zu 41 einer gut gewachsenen Kultur von Calonectria decora

ίο werden 2 g Pregnenolon und 2 g »Tween 80«, in Aceton gelöst, zugegeben. Die Lösung wird einige Zeit zum Sieden erhitzt. Nach 48 Stunden Rühren und Belüften wird der Ansatz entsprechend Beispiel 2 aufgearbeitet. Einen Teil des Pregnenolons erhält man bereits beim Eindampfen der Extrakte zurück'. Es wird abfiltriert und das Filtrat mit Kieselsäuregel chromatographiert wie im Beispiel 2: Fraktion:

100 % Chloroform

95°/₀ Chloroform

90% Chloroform

85% Chloroform

usw. bis20°/₀ Chloroform

5°/o Aceton 10°/₀ Aceton 15°/o Aceton 80% Aceton Öl

Antischaummittel

Tween 80

wenig Pregnenolon

12/9,15a-Dioxyprogesteron

Die Substanz, die aus den Fraktionen 20 % Chloroform und 80% Aceton erhalten wird, hat nach Umkristallisation in Aceton einen Schmelzpunkt von 218° C und [α] 5,° = + 140° in Chloroform. Die Substanz ist mit der im Beispiel 1 erhaltenen identisch.

Analyse C₂₁H₃₁O₄.

Berechnet
gefunden

C 72,81 %,
C 72,56%,

H 8,73%;
H 8,80%.

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Beispiel 6

Die Versuchsanordnung ist dieselbe wie im Beispiel 2. Als Substrat wird 11/9-Hydroxyprogesteron eingesetzt. Nach der Chromatographie erhält man HjS,15a-Dihydroxyprogesteron, welches nach dem Umkristallisieren in Aceton bei 173bis 175°Cschmilzt; [α]κ = + 230° in CHCl₃.

Beispiel 7

Bei Einsatz von Pregnandion-(3,20) oder Allopregnandion-(3,20) erhält man die in 12/3- und 15a-Stellung hydroxylierten Steroide der Normal- oder Alloreihe. Das Umsatzprodukt der Normalform schmilzt bei 225 bis 231° C, und der Drehwert beträgt [a]_D = + 56°in CHCl₃; das Umsatzprodukt der Alloform schmilzt bei 253 bis 257° C, und der Drehwert beträgt [α] _D = + 70° in Methanol.

Beispiel 8

Analog wie im Beispiel 7 werden auch lla-Hydroxypregnandion-(3,20) und lla-Hydroxyallopregnandion-(3,20) von dem Pilz umgesetzt, und zwar wird in diesen Fällen nur in 15-Steilung eine Hydroxylgruppe eingeführt. Der Schmelzpunkt der Normalform des Umsatzproduktes beträgt 175 bis 177° C, der Drehwert [a]j> = 109° C

dion-(3,20) schmilzt bei 208 bis 210° C; [a] %° = + 105° in CHCl₃.

Beispiel 9

Durch die Einwirkung des Pilzes Calonectria decora wird bei Einsatz von 14a-Hydroxyprogesteron nur die 12/5-Stellung hydroxyliert. Das entstandene 12/J,14a-Dihydroxyprogesteron hat nach dem Umkristallisieren in Aceton einen Schmelzpunkt von 241 bis 242° C und einen Drehwert von [a]/> = + 127° in CHCl₃.

Beispiel 10

Setzt man mit dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 9a-Hydroxyprogesteron der Einwirkung der Fermente des Pilzes Calonectria decora aus, so erhält man 9ot,15a-Dihydroxyprogesteron mit Schmelzpunkt 240 bis 242° C; [a]D= +131° in CHCl₃.

-I-109° in CHCl₃. Das lla.lSa-Dihydroxyallopregnan-

Beispiel 11

Hydroxyliert man nach Beispiel 1 15a-Hydroxyprogesteron mit Calonectria decora, so erhält man I2ß,15a-Dihydroxyprogesteron mit Schmelzpunkt 218° C; [a)_D = + 139° in CHCl₃.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Einführung von Hydroxylgruppen in Steroide durch Einwirkung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man Steroide, die in 17-Stellung keine O Η-Gruppen besitzen, in bekannter Weise einer aeroben Behandlung mit Enzymen von Calonectria decora unterwirft und die erhaltenen Produkte in bekannter Weise aufarbeitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Pilzstamm Calonectria decora aus dem Centraalbureau voor Schimmelcultures Baarn (Niederlande) verwendet.

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