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Verfahren zur Einführung einer Hydroxylgruppe in die 12-Stellung von
Reichsteins Verbindung S Es ist bereits bekannt, daß man auf biochemischem Wege
Hydroxylgruppen als Substituenten an den verschiedensten Stellen in das Molekül
von Steroiden einführen kann. Jedoch ist eine Einführung in die 12-Stellung allein
auf diesem Wege bisher nicht beschrieben. 'Man kennt lediglich eine gleichzeitige
Einführung von Hyoxylgruppen in die 12- und 15-Stellung (vgl. Chem. Ber., Bd. 90,
1957, S. 2576ff).
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Es wurde nun gefunden, daß bei der Incubation von Reichsteins Verbindung
S (4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion) mit dem Pilz Coniothyrium hellebori, Rasse 078,
aus der Klasse Fungi imperfecti und der Reihe Sphaeropsidales neben dem als Hauptprodukt
in 50°/oiger ausbeute entstehenden Hydrocortison (4-Pregnen-11f,17a,21-triol-3,20-dion)
in mindestens 25°'oiger -ausbeute auch 4-Pregnen-12ß,17a,21-triol-3,20-dion gebildet
wird.
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Dieser Befund ist um so überraschender, als nach den Angaben der britischen
Patentschrift 749 -l14 bei der Incubation des gleichen Ausgangsmaterials mit nahestehenden
Pilzen der gleichen Klasse und Reihe als Nebenprodukt ausschließlich 11-epi-Hydrocortison
zu erwarten war.
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Bei dem erfindungsgemäßen `'erfahren fallen Haupt-und Nebenprodukt
der Kulturfiltratextrakte zunächst als kristallines Gemisch an. Seine vollständige
Ruftrennung durch Kristallisation ist schwierig und verlustreich. Acetyliert man
das nicht weiter aufzutrennende Gemisch unter normalen milden Bedingungen, so entstehen
vorwiegend die Monoacetate beider Verbindungen, die sich ebenfalls nur schwer trennen
lassen. Acetyliert man dagegen das Gemisch bei höherer Temperatur, so bildet sich
neben dem 21-Monoacetat des Hydrocortisons das 12f3,21 -Diacetat des -1-Pregnen-12ß,17a,21-triol-3,20-dions.
Die Trennung dieser Verbindung durch Kristallisation, Gegenstromverteilung oder
Verteilungsclironiatographie bereitet nun keine Schwierigkeiten und gelingt praktisch
quantitativ.
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Das auf diese ""eise rein erhältliche 4-Pregnen-12ß,17a,21-triol-3,20-dion-12@,21-diacetat
ist ein wertvolles Ausgangsprodukt für Synthesen in der Steroidreihe, insbesondere
zur Herstellung pharmazeutisch interessanter Verbindungen.
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Beispiel Es werden 2,4 1 einer Nährlösung hergestellt, die pro Liter
folgende Bestandteile enthält: 50 g Dextrose, 10 g Biomalz, 2 g Natriumnitrat, I
g prim. Kaliumphosphat, 0,5 g Kaliunichlorid, 0,5 g 1lagnesiunisulfat, 0,02 g Eisensulfat.
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,je 1,21 der Lösung werden in einen Laborfermenter von 2 1
Inhalt gegeben und hierin 30 Minuten bei 120'C und 1 atü im :@utoklav sterilisiert.
Die Fermenter bestehen aus einem Glasgefäß mit einem Deckel aus rostfreiem Stahl;
sie sind ausgerüstet mit einem Turbinenrührer, Zugabestutzen, Lufteinleitungsrohr
und Luftableitung. Jeder Fermenter wird mit etwa 1 -Milliarde Sporen des Coniothyrium
hellebori, Rase 078, in Form einer wäßrigen Suspension beimpft und dann 48 Stunden
bei 25'C mit 500 Up- gerührt. Inzwischen wird in einem Stahlfermenter mit 50 1 Fassungsvermögen
eine Lösung von 1,5 kg Dextrose, 30 g prim. Kaliumphosphat und 90 g --'"-atriumnitrat
in 30 1 Leitungswasser bereitet und diese 40 Minuten bei 120°C und 1 atü sterilisiert.
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Die Kulturen aus den beiden Laborfermentern werden steril entnommen,
gemischt und von der -Mischung 1,6 1 zur Beimpfung des 50-1-Fermenters verwendet.
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Nach 24stündigem Rühren unter Durchleiten von 1 bis 2 cbm Luft je
Stunde (25'C) werden 5 g Reichsteins Verbindung S in 40 ccm sterilem Dimetliylformamid
zugegeben. Die gleiche Menge wird noch zweimal jeweils im Abstand von 24 Stunden
zugesetzt. 24 Stunden nach der letzten Zugabe wird die Kultur dem Fermenter entnommen,
filtriert und das Kulturfiltrat in einem -westfalia,:-Zentrifugalextraktor i-ierni@il
mit je 41 Methylisobutylketon extrahiert. Nach chromatograpliischer Analyse enthält
der Extrakt 7,9 g Hy#drocortison und 3,9 g 4-Pregnen-l2ß,17a,21-triol-3,20-dion.
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Der Extrakt wird im Vakuum bis auf etwa 150 ccni eingedampft. Beim
Abkühlen kristallisiert die erste Fraktion aus, das Filtrat wird wieder eingedampft
und durch Kühlen weitere Kristallfraktionen gewonnen, die vereinigt und getrocknet
werden.
Alan erhält auf diese Weise 11 g eines Produktes, das 66°;a
H@,drocortison und 27°;ä 4-Pregnen-12@,17a,21-triol-3,20-dion enthält.
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Das Rohprodukt wird zweimal aus @@tliy#leticlilorid umkristallisiert,
wodurch man 7 g chrornatographisch reines Hydrocortison vom F.212 bis 215`C erhält.
Die Mutterlaugen werden eingedampft und der Rückstand finit 10 ccm Pyridin aufgenommen,
5 ccm @ssigs<iureanhydrid zugesetzt und das Gemisch 8 Stunden auf 50` C erhitzt.
Das Reaktionsprodukt wird nach üblicher Aufarbeitung auf cire Säule gegeben, die
20 g mit .äthy@eng@ykol imprägniertes CeIite, d. h. eine unter diesem Handelsnamen
bekannte Mischung verschiedener Kieselerden, enthält. Eluierung mit einem Gemisch
aus 3 Teilen CycloheNan und 1 Teil Methylenchlorid ergibt 3,5 g kristallines Material.
Durch L'mkristallisieren aus «wenig @s-äßrigcni Methanol erhält man 3 g 4-Pregnen-12p,17a,
21-triol-3,20-dion-12f3,21-diacetat. F. 155 bis 157'C; F_38 17 000 _-a],,
_ -f- 122° (Chlf.) Die Elementaranalyse bestätigt die Zusammensetzung der Verbindung.
Der Mischschmelzpunkt mit einem authentischen Präparat (J. Chem. Soc.,
1955, S. 870)
gibt keine Depression. Die Infrarotspektren beider Substanzen
sind praktisch identisch.