CH369129A - Verfahren zur Einführung einer Hydroxylgruppe in die 12-Stellung von Reichsteins Verbindung S - Google Patents

Description

  Verfahren zur     Einführung    einer     Hydroxylgruppe    in die     12-Stellung     von     Reichsteins        Verbindung    S    Es ist bereits     bekannt,    dass man auf biochemi  schem Wege     Hydroxylgruppen    als     Substituenten    an  den verschiedensten Stellen in das Molekül von     Ste-          roiden    einführen kann. Jedoch ist eine Einführung     in     die     12-Stellung    allein auf diesem Wege bisher nicht  beschrieben.

   Man kennt lediglich eine     gleichzeitige     Einführung von     Hydroxylgruppen    in die 12- und     15-          Stellung    (vergleiche     Chem.        Ber.,    Band 90, 1957, Seite  2576 ff.)  Es wurde nun gefunden, dass bei der     Inkubation     von     Reichsteins    Verbindung S     (4-Pregnen-17a,    21  diol-3,20-dion) mit dem Pilz     Coniothyrium        hellebori,     Rasse 078, aus der Klasse Fungi     imperfecti    und,

   der  Reihe     Sphaeropsidales    neben dem als Hauptprodukt  in     50o/aiger    Ausbeute entstehenden     Hydrocortison          (4-Pregne@n-11ss,17a-21-triol-3,20-dion)    in     mindestens          25        %        iger        Ausbeute        auch        4-Pregnen-12ss,17a,21-triol-          3,20-dion    gebildet wird.  



  Dieser Befund ist um so überraschender, als nach  den Angaben der Britischen Patentschrift Nummer  749 414 bei der Inkubation des gleichen Ausgangs  materials mit nahestehenden     Pilzen    der     gleichen     Klasse und Reihe als Nebenprodukt     ausschliesslich          11-epi-Hydrocortison    zu     erwarten    war.  



  Bei dem erfindungsgemässen Verfahren     fallen     Haupt- und Nebenprodukt der     Kulturfiltratextrakte          zunächst    als kristallines Gemisch an. Seine vollstän  dige     Auftrennung    durch Kristallisation ist     schwierig     und verlustreich.     Acetyliert    man das nicht weiter auf  zutrennende Gemisch unter normalen     milden    Bedin  gungen, so entstehen vorwiegend die Monoacetate  beider Verbindungen, die sich ebenfalls nur schwer  trennen lassen.

       Acetyli.ert    man dagegen das Gemisch  bei höherer Temperatur, so bildet sich neben dem     21-          Monoacetat    des     Hydrocortisons    das     12ss,21-Diacetat     des     4-Pregnen-12ss,17a-21-trio-3,20-dions.    Die Tren-         nung    dieser Verbindung durch     Kristallisation,    Gegen  stromverteilung oder     Verteilungschromatographie    be  reitet nun     keine    Schwierigkeiten und gelingt praktisch  quantitativ  Das auf diese Weise rein erhältliche     4-Pregnen-          12ss,

  17a    - 21-     triol    -     3,20-dion-12ss,21-diacetat    ist ein       wertvolles    Ausgangsprodukt für     Synthesen    in der       Steroidreihe,    insbesondere zur Herstellung pharma  zeutisch     interessanter        Verbindungen.     



  <I>Beispiel</I>  Es werden 2,41 einer Nährlösung hergestellt, die  pro Liter folgende Bestandteile enthält:  50 g Dextrose, 10 g     Biomalz,    2 g     Natriumnitrat,     1 g     prim.        Kaliumphosphat,    0,5 g     Kaliumchlorid,     0,5 g     Magnesiumsulfat,    0,02 g Eisensulfat.  



  Je 1,2 1 der Lösung werden in einen     Laborfer-          menter    von 2 1     Inhalt    gegeben und hierin 30     Minuten     bei 120  und 1 atü im     Autoklaven        sterilisiert.    Die       Fermenter    bestehen aus einem Glasgefäss     mit    einem  Deckel aus rostfreiem     Stahl;    sie sind ausgerüstet mit  einem     Turbinenrührer,        Zugabestutzen,        Lufteinlei-          tungsrohr    und Luftableitung.

   Jeder     Fermenter    wird  mit etwa 1 Milliarde Sporen des     Coniothyrium        helle-          bori,    Rasse 078, in Form     einer        wässrigen    Suspension       beimpft    und dann 48 Stunden bei     25     mit 500 U. p. M.  gerührt. Inzwischen wird in     einem        Stahlfermenter    mit  50 1 Fassungsvermögen eine Lösung von 1,5 kg Dex  trose, 30 g     prim.        Kaliumphosphat    und 90 g Natrium  nitrat in 30 1 Leitungswasser bereitet und diese 40  Minuten bei 120  und 1 atü sterilisiert.

   Die Kulturen  aus den beiden     Laborfermentern    werden steril ent  nommen, gemischt und von der Mischung 1,6 1     zur          Beimpfung    des.     50-1=Fermenfiers        verwendet.     



  Nach     24stündigem    Rühren     unter    Durchleiten von  1-2     m3        Luft/Stunde    (25 ) werden 5 g     Reichsteins              Verbindung    S in 40     cm3    sterilem     Dimethylformamid     zugegeben.

   Die gleiche Menge wird noch     zweimal     jeweils     im    Abstand von 24 Stunden     zugesetzt.    24  Stunden nach der letzten Zugabe wird die Kultur dem       Fermenter        entnommen,        filtriert    und das     Kulturfiltrat     in einem      Westfalia -Zentrifugalextraktor    viermal mit  je 41     Methylisobutylketon    extrahiert.

   Nach     chromato-          graphischer    Analyse enthält der Extrakt 7,9g     Hy-          drocortison    und 3,9 g     4-Pregnen-12ss,17a,21-triol-          3,20-dion.     



  Der Extrakt wird im Vakuum bis auf etwa  150     cm3    eingedampft. Beim Abkühlen kristallisiert  die erste Fraktion aus, das     Filtrat    wird wieder ein  gedampft und durch Kühlen weitere Kristallfraktionen  gewonnen, die vereinigt und getrocknet werden.  



  Man     erhält    auf diese Weise 11 g eines Produktes,       das        66        %        Hydrocortison        und        27        0/a        4-Pregnen-12ss,          17a,21-triol-3,20-dion    enthält. Das Rohprodukt wird  zweimal aus     Äthylenchlorid,        umkristallisiert,        wodurch     man 7 g     chromatographisch    reines     Hydrocortison     vom F.     212-2.15     erhält.

   Die     Mutterlaugen    werden  eingedampft und der Rückstand mit 10     em3        Pyridin          aufgenommen,    5     cm3        Essigsäureanhydrid    zugesetzt  und das Gemisch 8 Stunden auf 50  erhitzt.

   Das  Reaktionsprodukt wird nach üblicher Aufarbeitung  auf eine Säule gegeben, die 20 g mit     Äthylenglykol          imprägniertes         Celite ,    das heisst eine unter diesem  Handelsnamen bekannte Mischung verschiedener Kie  selerden, enthält.     Eluierung    mit einem Gemisch aus  3 Teilen     Cyclohexan    und 1 Teil     Methylenchlorid    er  gibt 3,5 g     kristallines    Material.

   Durch     Umkristalli-          sieren    aus wenig     wässrigem    Methanol erhält man 3 g  4 -     Pregnen        -12ss,17a,21-        triol    - 3,20     -dion-12ss,21-di-          acetat.       F. 155-157 ;     E238    17 000;     [a]D=    + l22  (Chloro  form).  



  Die Elementaranalyse bestätigt die Zusammen  setzung     der    Verbindung. Der Mischschmelzpunkt mit  einem     authentischen,    Präparat (J.     Chem.        Soc.   <I>1955,</I>  870) gibt     keine    Depression. Die     JR-Spektren    beider  Substanzen sind praktisch identisch.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Einführung einer Hydroxylgruppe in die 12-Stellung von Reichsteins Verbindung S, da durch gekennzeichnet, dass man Reichsteins Verbin dung S der Einwirkung der Enzyme des Pilzes Conio- thyrium hellebori aus der Klasse Fungi imperfecti und der Reihe Sphaeropsidales in einem wässrigen Medium in Gegenwart von Sauerstoff unterwirft und das Ge misch der entstandenen hydroxylierten Steroide ab

   scheidet und auftrennt. UNTERANSPRUCH Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn zeichnet, d'ass man das abgeschiedene Gemisch der hydroxylierten Steroide, gegebenenfalls nach Abtren nung der Hauptmenge des als Hauptprodukt entstan denen Hydirocortisons durch Kristallisation aus Äthy- lenchlorid, vor der weiteren Auftrennung einer Ace- tylierung bei erhöhter Temperatur unterwirft und das hierbei entstandene 4-Pregnen-12ss,

   17a-21-triol-3,20- dion-12ss,21-diacetat von dem daneben entstandenen Hydrocortison-21-monoacetat dann mittels Vertei- lungschromatographie abtrennt.