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Verfahren zur Gewinnung von reinem Desmethylchlortetracyclin Die Erfindung
betrifft ein neues, verbessertes Verfahren zum Reinigen von Desmethylchlortetracyclin,
wobei hohe Ausbeuten an Produkten von hoher Reinheit erhalten werden.
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Die Desmethyltetracycline, Desmethyltetracyclin selbst und Desmethylchlortetracyclin
(7-Chlordesmethyltetracyclin) gehören einer neuen Familie von Tetracyclinantibiotica
an. Diese Desmethyltetracycline werden von bestimmten Mutanten von Streptomyces
aureofaciens gebildet, die sich von einem Chlortetracyclin erzeugenden Stamm streptomyces
aureofaciens A-377 ableiten, welcher bei dem Northern Regional Research Laboratory,
Peoria, Illinois, unter der Hinterlegungsnummer NRRL 2209 hinterlegt wurde. Die
neuen Desmethyltetracyclin erzeugenden Stämme werden durch Behandlung des Stammes
Streptomyces aureofaciens A-377 mit mutagenen Mitteln erhalten. Kulturen der neuen
Desmethyltetracyclin erzeugenden Stämme von Streptomyces aureofaciens sind bei der
American Type Culture Collection, Washington, D. C., unter den ATCC-Hinterlegungsnummern
12551, 12552, 12553 und 12554 hinterlegt.
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Desmethylchlortetracyclin hat im Vergleich zu dem bekannten, mit einem
breiten Wirkungsspektrum ausgestatteten Antibioticum Tetracyclin in weit geringeren
Mengen in hervorragender Weise wesentlich stärkere antibiotische Wirksamkeit gegen
empfindliche Organismen; es besitzt in überraschender Weise größere Stabilität in
Körperflüssigkeiten; es wird weniger rasch durch die Niere ausgeschieden. Im Körper
wird daher nach seiner Injektion über eine längere Zeit hinaus ein therapeutisch
wirksamer Desmethylchlortetracyclinblutspiegel aufrechterhalten.
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Desmethylchlortetracyclin wird jedoch fast immer zusammen mit geringen
Mengen Desmethyltetracyclin und einer epimeren Form von Desmethylchlortetracyclin,
7-Chlor-6-desmethyl-4-epitetracyclin, die ebenfalls Fermentationsprodukte sind,
gebildet. Man muß dann diese Antibiotica trennen oder wenigstens Desmethylchlortetracyclin
in einer hochgereinigten und von Desmethyltetracyclin und der epimeren Form von
Desmethylchlortetracyclin freien Form gewinnen. Diese Antibiotica können zwar papierchromatographisch
wirksam getrennt werden; das ist aber in technischem Maßstab nicht günstig, und
es wurde daher versucht, ein technisch anwendbares Verfahren zur Gewinnung von praktisch
reinem Desmethylchlortetracyclin zu entwickeln.
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Eines der besten Verfahren zur Reinigung von Chlortetracyclin und
Tetracyclin ist das von Winterb o tto m beschriebene Verfahren. Bei diesem Verfahren
wird rohes Chlortetracyclin z. B. in einem hydroxylgruppenhaltigen organischen Lösungsmittel,
z. B, einem niederen Alkanol, unter Verwendung einer stickstoffhaltigen Base, z.
B. Triäthylamin, die dazu dient, das Chlortetracyclin zu neutralisieren und löslich
zu machen, gelöst. Die nicht gelösten Verunreinigungen werden abfiltriert, und durch
Wiedereinstellung des pH-Werts des Filtrats mit Salzsäure auf den gewünschten Wert
wird gereinigtes Chlortetracyclinhydrochlorid gefällt.
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Dieses Verfahren ist zwar zur Reinigung von Chlortetracyclin oder
Tetracyclin hervorragend geeignet, da ein therapeutisch wertvolles Produkt von hoher
Qualität gewonnen wird, es hat aber bestimmte Nachteile, da hydroxylgruppenhaltige
organische Lösungsmittel und organische Basen verwendet werden müssen, so daß die
Kosten des Reinigungsverfahrens hoch sind. Außerdem, und das ist bezüglich Desmethylchlortetracychn
von größter Wichtigkeit, bewirkt das Umkristallisieren von Desmethylchlortetracyclin
aus den von Winterbottom vorgeschlagenen organischen Lösungsmitteln, z. B. Butanol
und 2-Äthoxyäthanol, keine wesentliche Verminderung der Menge an Desmethyltetracychn
oder des Epimeren von Desmethylchlortetracyclin. Wenn man daher dieses Verfahren
auf die Umkristallisation von
Desmethylehlortetracyclin anwendet,
enthält das Endprodukt einen zu hohen Prozentsatz dieser anderen unerwünschten Antibiotica.
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Die Erfindung betrifft nun ein verbessertes Verfahren zum Reinigen
von Desmethylchlortetracyclin, wobei eine Desmethylchlortetracyclin-Harnstoffsulfat-Komplexverbindung
- aus wäßrigen Rohdesmethylchlortetracyclin enthaltenden Lösungen gebildet wird
und aus diesen hochgereinigtes Desmethylchlortetracyclinhydrochlorid oder ein anderes
Säuresalz oder neutrales Desmethylchlortetracyclin leicht gebildet werden kann.
Das Endprodukt hat eine hohe Wirksamkeit, .gute Farbe und ist praktisch frei von
Desmethyltetracyclin und dem Epimeren von Desmethylchlortetracyclin.
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Die neue Komplexverbindung wird gebildet, indem man rohes, dunkelgefärbtes
Desmethylchlortetracyclin mit vorzugsweise etwa 3 bis etwa 20 Äquivalenten einer
10°/oigen bis vollständig gesättigten (60°/o Gewicht/Volumen) wäßrigen Harnstofflösung
pro Äquivalent Desmethylchlortetracyclin in Berührung bringt. Dann werden Sulfationen,
vorzugsweise als Schwefelsäure, vorzugsweise in einem Überschuß von 1 Moläquivalent
zugegeben, um den pH-Wert auf etwa 0,5 bis 2,0, vorzugsweise etwa 0,5 bis 1,0, einzustellen,
worauf die Desmethylchlortetracyclin-Harnstoffsulfat-Komplexverbindung gefällt wird
und die dunkelgefärbten Verunreinigungen, Desmethyltetracychn und 7-Chlor-6-desmethyl-4-epitetracyclin
in Lösung bleiben. Die Komplexverbindung wird abfiltriert, mit Alkohol gewaschen
und getrocknet.
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Die Desmethylchlortetracyclin-Harnstoffsulfat-Komplexverbindung besteht
aus 2 Mol Harnstoff zu 1 Mol saurem Sulfat pro Mol Desmethylehlortetracyclin.
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Hochgereinigtes Desmethylchlortetracyclin kann aus dieser Komplexverbindung
leicht wiedergewonnen werden, indem man sie in Wasser aufschlämmt und die Suspension
mit einer Säure, wie Salzsäure, auf einen pH-Wert zwischen 0,1 und 1,0 ansäuert,
worauf gereinigte, hellgelbe Kristalle des Hydrochlorids mit hoher biologischer
Wirksamkeit erhalten werden.
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Die Desmethylchlortetracyclin-Harnstoffsulfat-Komplexverbindung kann
auch in neutrales Desmethylchlortetracyclin umgewandelt werden, indem man sie in.
Wasser aufschlämmt und den pH-Wert mit einer wäßrigen Base, wie Ammoniumhydroxyd,
unter Bildung von gereinigtem neutralem Desmethylchlortetracyclin auf etwa 3 bis
6 einstellt.
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Aus der deutschen Auslegeschrift 1045 392 ist es bekannt, Tetracyclin
bei einem pH-Wert von 2,5 bis 6,0 mit wäßriger Harnstofflösung in eine schwerlösliche
Komplexverbindung zu überführen und aus dieser, z. B. durch Behandlung mit Säure,
das freie Tetracyclin-Antibioticum zu gewinnen.
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Beim pH-Wert von 2,5 bis 6,0 bildet sich jedoch ein Desmethylchlortetracyclin
- Harnstoffsulfat- Komplex nicht, so daß es nicht gelingt, Desmethylchlortetracychn
über das Harnstoff'addukt zu reinigen, wenn man in diesem pn-Bereich arbeitet.-Die
folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 1/2 g Desmethylchlortetracyclin-Base
wurde in 4 ml 0,25 n-Schwefelsäure aufgelöst, hierzu wurden 0,5 g H2NCONH2 und anschließend
1 ml 3,6 n H2S04 gegeben. Der pH-Wert betrug 2,0. Nach 1/2 Stunde wurde das entstandene
kristalline Produkt abfiltriert und mit 1,5 ml Alkohol (Gemisch aus 98 °/o Äthanol
und 2 °/o Butanol) gewaschen. Es wurden 0,55 g getrocknetes Produkt erhalten, welches
17,50/, Harnstoff enthielt; die spektrophotometrische Prüfung ergab 750 »y/mg Desmethylchlortetracyclin.
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Beispiel 2 2,4g Desmethylchlortetracyclinhydrochlorid wurden in 3,6
ml gesättigter wäßriger Harnstofflösung gelöst; dann wurden 2 ml 18 n-Schwefelsäure
zugegeben. Der pH-Wert betrug l,32.` Nach 3/4 Stunden wurden die entstandenen Kristalle
abfiltriert, mit Alkohol (Gemisch aus 98 °/o Äthanol und 2 °/o Butanol) gewaschen
und im Vakuum getrocknet. Die Prüfung der getrockneten Desmethylchlortetracyclin-Harnstoffsulfat-Komplexverbindung
ergab 730 y/mg Desmethylchlortetracyclin, mikrobiologisch; die Verbindung enthielt
17,4°/o Harnstoff und 13,7°/o Sulfat. Ausbeute 1,1 g. Beispiel 3 4 g braunes rohes
Desmethylchlortetracyclinhydrochlorid (875 y/mg Desmethylchlortetracyclin, mikrobiologisch)
wurden in 15 Minuten mit 5 ml gesättigter wäßriger Harnstofflösung verrührt. Es
trat praktisch vollständige Auflösung ein. 0,5 ml 36 n-Schwefelsäure wurden dann
tropfenweise zugegeben, wobei die Harnstofflösung in einem Wasserbad gekühlt wurde.
Durch die rasche Kristallisation des Produkts wurde die Mischung dick. 2 ml gesättigte
wäßrige Harnstoff> lösung wurden noch zugegeben, um den Brei dünnflüssiger zu machen;
dann wurde mit 1 ml 36 n-Schwefelsäure versetzt. Der Brei wurde über Nacht beim
pH-Wert 0,7 gerührt. Das erhaltene Produkt wurde abfiltriert, mit 6 ml 80 °/oigem
Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die so erhaltenen 4,65 g Desmethylchlortetracyclin
- Harnstoffsulfat- Komplexverbindung wurden in 14 ml Wasser und 0,2 ml 50 °/oigem
Cetyltrimethylammoniumchlorid aufgeschlämmt. Dann wurden 4,5 ml Salzsäure zugegeben,
und der rasch kristallisierende Brei wurde 1 Stunde stehengelassen. Das Produkt
wurde abfiltriert, mit 0,4 n-Salzsäure und Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet,
wobei 3,05 g hellgelbe Kristalle des Hydrochlorids erhalten wurden. Die mikrobiologische
Prüfung ergab 914 y/mg Desmethylchlortetracyclin. Beispiel 4 Zu einer Lösung von
500 g der Desmethylchlortetracyclin-Harnstoffsulfat-Komplexverbindung (702y/mg Desmethylchlortetracyclin,
spektrophotometrisch) in 31 Wasser wurden 12 ml 31°/oige wäßrige Cetyltrimethylammoniumchloridlösung
und eine ausreichende Menge konzentriertes Ammoniumhydroxyd zugegeben, damit nach
2stündigem Rühren der pH-Wert 3,9 erhalten wurde. Das Produkt wurde abfiltriert,
mit 1,21 Wasser gewaschen und bei 50°C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug
276g
neutrales Desmethylcblortetracyclin (1046 y/mg Desmethylchlortetracyclin,
spektrophotometrisch).