CZ303409B6

CZ303409B6 - Zkrácený a mutovaný lidský chemokin

Info

Publication number: CZ303409B6
Application number: CZ20030947A
Authority: CZ
Inventors: Proudfoot@Amanda; N. C. Wells@Timothy; Kosco-Vilbois@Marie
Original assignee: Merck Serono Sa
Priority date: 2000-10-04
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2012-09-05
Also published as: ATE265222T1; DE60103078D1; EA006137B1; CA2423616C; SK287523B6; HK1062811A1; HUP0302194A3; AU1591902A; HRP20030215B1; RS50738B; MXPA03003008A; PL204231B1; HRP20030215A2; IL155178A0; SK4062003A3; PT1326628E; JP3908165B2; NO20031525D0; BR0114407A; CZ2003947A3

Abstract

Mutanty CC chemokinu pro prípravu farmaceutického prostredku, které obsahují nejméne dve mutace v kationtovém míste 40. smycky a které, vzhledem k divokému typu molekuly, mají redukovanou vazebnou aktivitu GAG. Zejména takové mutanty chemokinu, které jsou užitecné pro lécení sklerózy multiplex a/nebo jiných demyelinizacních onemocnení. CC chemokiny jsou vybrány z RANTES, MIP-1-alfa, MIP-1-beta, MIP-3, MIP-4, HCC1, I309, I35612 a MCP-2. Slouceninou, která vykazuje nejlepší výsledky je trojitá mutanta RANTES.

Description

Zkrácený a mutovaný lidský chemokin

Oblast techniky

Předkládaný vynález se zabývá mutantami CC chemokinů, které obsahují nejméně dvě mutace ve

40. smyčce a které, relativně k divokému typu molekuly, mají redukovanou vazebnou aktivitu GAG: ukazuje se, že takovéto mutované chemokiny jsou účinné při léčbě sklerózy multiplex a/nebo jiných demyelinizačních onemocnění.

io

Dosavadní stav techniky

Chemokiny tvoří třídu malých prozánětlivých cytokinů s leukocyty s chemotaktickými a aktivuj í15 čími vlastnostmi. V závislosti na umístění prvních konzervovaných cysteinů, může být třída chemokinů rozdělena na chemokiny C-C, C-X-C a C-X₃-C (Baggiolini M a spol., Adv. Immunol. 1994, 55-97 až 179; Baggiolini M a spol., Annu Rev Immunol. 1997, 15:675 až 705; Taub D. a spol., Cytokine Growth Factor Rev. 1996, 7(4):355 až 76).

Mnoho C-X-C chemokinů, jako interleukin-8 (IL-8), je chemotaktických pro neutrofily, zatímco C-C chemokiny jsou aktivní na různé leukocyty, které zahrnují monocyty, lymfocyty, eosinofily, basofily, NK buňky a dendritické buňky.

NH₂-terminální oblast chemokinů se účastní ve vazbě na receptor a NH₂-terminální zpracování může buď aktivovat chemokiny, neboje učinit kompletně inaktivní.

N-terminální varianty syntetických C-C chemokinů byly zkoušeny pro svoji aktivitu jako inhibitory nebo antagonisté přirozeně se vyskytujících forem. MCP-1, MCP-3 a RANTES, postrádající 8 až 9 NH₂-terminální aminokyseliny, jsou inaktivní na monocyty a jsou užitečné jako antago30 nisté receptorů (Gong JH a spol., J Exp Med. 1995, 181(2):631 až 40 a Gong JH a spol, J Biol Chem. 1996, 271(18):10521 až 7).

Prodloužení RANTES jedním methioninem vede ve skoro kompletní inaktivaci molekuly a MetRANTES se chová jako antagonista pro autentický RANTES (Proudfoot AE a spol., J Biol

Chem. 2. února 1996; 271(5):2599 až 603).

WO 99/16877 se zabývá aminoterminálními zkrácenými RANTES, které postrádají NH₂-terminální aminokyseliny, které odpovídají zbytkům aminokyselin 1, 1-2, 1-3 nebo 1-4 přirozeně se vyskytujících RANTES a které mají antagonistické účinky pro chemokiny. Dokument se týká také kódových sekvencí pro aminoterminální zkrácené RANTES, týká se jejich užití v terapii a/nebo diagnose nemocí, u kterých je požadován antagonistický účinek pro chemokiny. RANTES ((3-68) je výhodným zkráceným antagonistou chemokinů.

I když chemicky atraktivní účinnost RANTES a CC chemokinů byla obecně zkoumána zejména ve spojení se specifickou membránou receptorů, může RANTES také vzájemně reagovat s glykosaminoglykany (GAGs), vysoce variabilními rozvětvenými cukernými skupinami přidanými post-translačně k některým proteinům, které jsou obecně nazývané proteoglykany (PGs). Takovéto proteiny jsou přítomny na buněčné membráně, v mezibuněčné hmotě a v krevním oběhu, kde mohou být také přítomny izolované GAGs.

Interakce s GAGs je obecná vlastnost mnoha rozpustných molekul signálních pro buňky (interleukiny, růstové faktory). PGs nebo izolované GAGs mohou tvořit komplex s rozpustnými molekulami, pravděpodobně za účelem ochrany takovýchto molekul před proteolýzou v extracelulárním prostředí. Bylo uvažováno, že GAGs mohou pomáhat správnému dodání molekul signálních buněk kjejich specifických receptorům a eventuelně také mohou GAGs modulovat Činnost cílových buněk.

V případě chemokínů jsou koncentrace imobilizovaných gradientů v místě zánětu a následně interakce s receptory buněk a jejich aktivační stav patrně modulovány různými formami GAGs (Hoogewerf AJ a spol., Biochemistry 1997, 36(44):13570 až 8). Tudíž bylo předpokládáno, že modulace takovýchto interakcí může představovat terapeutický přístup u zánětlivých onemocnění (Schwarz MK a Wells TN, Curr Opin Chem Biol. 1999, 3(4):407 až 417) a u HIV infekce (Bums JM a spol. Proč Nati Acad Sci U S A 1999, 96(25):14499 až 504).

Strukturální požadavky a funkční účinky spojení GAG-RANTES byly zkoumány v různých modelech. RANTES váže GAGs na endoteliální buňky lidské pupeční žíly (HUVECs) v mikromolekulámích koncentracích s afinitou a vyšší specifičností než jiné chemokiny, jako MCP-1, IL-8 nebo ΜΙΡ-lalpha. Taková spojená se nejeví jednoduše elektrostatická, ale také závisí na dalších parametrech jako je délka a N-sulfatace a O-sulfatace GAGs (Kuschert GS a spol., Biochemistry 1999, 38(39):12959 až 68). Defektivní buněčné linie GAGs ještě mohou vázat chemokiny, ale přítomnost povrchu buněk GAGs značně zvyšuje jejich účinnost na receptory pokud jsou v nízkých koncentracích (Ali S a spol., J. Biol Chem 2000, 275(16):11721 až 7). Další pokusy ukazují, že GAGs, zejména heparin-sulfát, usnadňují spojení RANTES s povrchem buněk makrofágů a následnou inhibici infekce HIV. Což je výsledek, který je konzistentní se známým odporem těchto buněk, u nichž nesnadno dochází k expresi heparin-sulfátu pro antivirové účinky RANTES (Oravecz T a spol., J. Immunol. 1997, 159(9):4587 až 92).

Rozpustné GAGs se dostávají do kompetice s buněčnou membránou GAGs a mohou působit jako specifické inhibitory aktivace povrchu vyvolanou RANTES (Appay V. a spol; Int Immunol 2000, 12(8): 1173 až 82), nebo mohou působit jako potlačovatelé infekce HIV (Bums JM a spol; Proč Nati Acad Sci U S A 1999,96(25):14499 až 504).

Některé studie struktury-funkce se snažily identifikovat oblast RANTES odpovědnou za spojení s GAGs, jelikož odpovídající sekvence (BBXB, kde B je hlavní zbytek a X může být některý zbytek) je příliš generická. Studie s mapováním epitopu byla provedena za použití monoklonálních protilátek zvýšených proti rekombinantním lidským RANTES, schopným zamezovat obojímu- antivirovým účinkům a mobilizaci intracelulámího vápníku zprostředkovanou RANTES (Bums JM a spol., J. Exp. Med. 1998, 188(10:1917 až 27). Tento přístup umožnil definovat zbytky 55-66 nezbytné jak pro činnosti, tak pro interakci GAG, uvádějící důvody, že interakce GAG může mít doplňkovou nebo odlišnou funkci zprostředkovanou některými receptory, jak také uvedeno ve studii na variantách RANTES s upravenými vlastnostmi agregace /Appay V a spol., J Biol chem 1999, 274(39):27505 až 12).

Oblast 55-66, která představuje segment C-terminální atfa-šroubovice, je shodná s GAG vázající oblast jiných chemokínů, jako je IL-8(Witt DP a Lander AD, curr. Biol. 1994, 4(5):394 až 400), a obsahuje kationtové místo, které obsahuje lysin a arginin (KKWVR). Taková vazebná oblast je odlišná od vazebného místa pro buněčné receptory, které je umístěno v N-zakončení, (Pakianathan DR a spol., Biochemistry 1997, 36(32):9642 až 8) a obsahuje některé zbytky zahrnuté v agregaci monomerů RANTES, dokonce ačkoliv takové desagregující mutace neovlivňují účinek interakce s GAGs (Czaplewski LG a spol., J. Biol. Chem. 1999, 274(23):16077 až 84; WO 98/13495).

RANTES obsahuje jiné kationtové místo (RKNR) ve zbytcích 44-47. které je konservováno v oblasti GAGs vázající jiné chemokiny, jako je MIP-la(Koopmann W a Krangel MS, J. Biol. Chem. 1997,272(15):10103 až 9) a MlP-Ιβ (Koopman W a spol., J Immunol. 1999, 163(4):2120 až 7).

-2 CZ 303409 B6

Varianty lidského RANTES, které obsahují jedinou mutaci v kationtových místech, byly popsány jako antagonisté RANTES mající potenciálně terapeutická použití při léčení infekce HIV a při léčení zánětlivých nebo alergických onemocnění (WO 99/33989).

Ukázalo se také, že pouze trojitá mutanta RANTES, ve které tři zbytky v poloze 44, 45 a 47 byly nahrazeny alaninem, má ztracenou schopnost vázat GAG (A. Proudfoot a spol., Chemokine Gordon Conference, Session 1, 24. července 2000).

Podstata vynálezu

Bylo zjištěno, že CC chemokiny, které obsahují nejméně dvě mutace vkationtovém místě takzvané „40. smyčky“, jsou účinné v léčení sklerózy multiplex a/nebo jiným demyelinizačních onemocnění. Toto místo představuje konzervované motif, schopné vazby na GAG u CC chemokinů (jako RANTES, ΜΙΡ-lalfa a ΜΙΡ-lbeta, MIP-3, MIP-4, HCC1, 1309, MCP-2). Všechny tyto mutanty chemokinů mají redukovanou vazebnou činnost GAG ve srovnání s divokými typy odpovídajících molekul.

Oblast, ve které budou přítomny nejméně dvě mutanty, podle vynálezu, takzvaná 40. smyčka, je označená pro řadu chemokinů na obr. 1. Zejména trojitá mutanta RANTES, ve které byly nahrazeny alaninem tři bazické zbytky v poloze 44, 45 a 47, vykazovala účinnost na živočišném modelu pro léčení sklerózy multiplex. Tato trojitá mutanta RANTES vykazuje účinek závislý na dávce u myšího modelu EAE a srovnatelnou účinnost k referenčnímu léčení s rekombinantním IFNbeta. Analogické výsledky byly získány se zkrácenou trojitou mutantou RANTES, ve které byly nahrazeny alaninem tři zbytky v poloze 44, 45 a 47 a které postrádají první 2 N-terminální aminokyseliny. Tato zkrácená mutanta RANTES (mající sekvenci aminokyselin SEQ ID NO: 3) je nová a představuje další předmět vynálezu.

Podobný experimentální důkaz byl vytvořen ve spojení s trojitými mutantami ΜΙΡ-lalfa, a MIP lbeta, které jsou již známy a které jsou zde označované jako ΜΙΡ-Ια trojitá mutanta R18AR46A-R48A (Koopman W a Krengel MS., J. Biol Chem. 1997, 272(15):10103 až 9) a jako MIP-Ιβ trojitá 4O.mutanta K45A-R46A-K48A (Laurence JS, Biochemistry 2001, 40:4990 až 4999),

Výrazem „redukovaná vazebná činnost GAG“ se míní, že mutanty, podle vynálezu, mají nižší schopnost vázat GAGs, tj. nižší procento každé z mutant váže GAGs (jako heparinsulfát) vzhledem k odpovídajícímu divokému typu molekuly.

Výhodnější jsou mutanty lidského RANTES, ve kterých tři bazické zbytky aminokyselin v poloze 44, 45 a 47 divokého typu molekuly byly nahrazeny jinými aminokyselinami. Takové zbytky mohou být nahrazeny s malými alifatickými nepolárními nebo slabě polárními zbytky, jako je například Ala, Ser, Thr, Pro a Gly. Nej výhodnější z nich je alanin.

Mutanty RANTES, které byly zjištěny jako zejména účinné v léčení MS, jsou takové mutanty které mají sekvenci aminokyselin jak je uvedeno SEQ ID NO:2 a SEQ IDNO:3.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je užití mutant chemokinů, jak jsou výše definovány, k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení sklerózy multiplex a/nebo jiných demyelinizačních onemocnění.

Skleróza multiplex (MS) je pomalu postupující onemocnění CNS, charakterizované diesminovanými ložisky demyelinizace v mozku a míše, vedoucí v mnohočetné a různé neurologické symptomy a příznaky, obvykle s remisemi a exacerbacemi (viz The Merck Manual, šestnácté vydání).

Příčina je neznámá, ale předpokládá se imunologická abnormalita s několika klubky nyní udávajícími specifický mechanismus. Předpokládané příčiny zahrnují infekci pomalými latentními viry a myelinolysu enzymy. Obvykle je zvýšeno IgG v GSF a bývají zvýšené titry spojené s různými viry, které zahrnují virus spalniček. Význam těchto objevů s uváděnými spojeními s alotypy

HLA a změněným množstvím T buněk je nejasný, protože důkazy jsou poněkud sporné. Zvýšený rodinný výskyt předpokládá genetickou vnímavost; ženy jsou poněkud častěji postiženy než muži. Ukazují se být přítomny i faktory zevního prostředí. Ačkoliv v začátku onemocnění je věk od 20 do 40 let, MS byla spojena s geografickou oblastí, kde pacient strávil prvních 15 let. Znovu zjištění po 15ti letech věku nemění riziko.

io

Plaky nebo ostrůvky demyelinizace s destrukcí oligodendroglii a perivaskulámí zánět jsou diseminovány v CNS, především v bílé hmotě, s predilekcí pro laterální a zadní provazce (zejména v cervikálních a dorsálních oblastech), optické nervy a periventrikulámí oblasti. Trakty v mezimozku, pontu a mozečku jsou také postiženy a může být postižena Šedá hmota v mozku a míše.

Těla buněk a axony jsou obvykle chráněny, zejména u časných poškození. Později mohou být axony poškozeny, zejména v dlouhých traktech a fibrózní gliosa uděluje traktům jejich „sklerotický“ vzhled. Obojí, časné i pozdní poškození, může být zjištěno současně. Chemické změny v lipidových a proteinových složkách myelinu jsou dokázány v plácích a kolem plaků.

Onemocnění je charakterizováno různými postiženími a projevy dysfunkce CNS, s remisemi a stále se opakujícími exacerbacemi.

Nejvíce citlivou diagnostickou zobrazovací technikou je magnetická rezonance (MRI); může ukazovat mnoho plaků. Poškození také mohou být viditelná na CT se zvýšeným kontrastem.

Terapeutické pokroky u sklerózy multiplexu (MS) vznikají pomalu, částečně proto, že není kompletně známá patogeneze onemocnění. Pro empirickou léčbu zahrnují hlavní překážky postupu vysoce variabilní průběh MS, dlouhodobý charakter nej důležitějších výsledných měření a nedo30 statek objektivních znaků účinku léčby, zejména v krátkém období.

Ačkoliv patogeneze MS zůstává nejistá, skutečný původ je dále zkoumán. Byla vypracována objektivní výsledná měření, založená na magnetické rezonanci (MRI) a řada nebezpečí klinických pokusů, které vedly ke zdokonaleným způsobům a lepší interpretaci výsledků, je neznámá.

Dalším předmětem, podle vynálezu, je tudíž z působ léčení MS podáváním účinného množství mutant chemokinů, podle vynálezu, spolu s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou.

„Účinné množství“ se týká množství účinných složek, které je schopné ovlivnit průběh a závaž40 nost onemocnění, vedoucí k redukci remisí takové patologie. Účinné množství bude záviset na způsobu podávání a stavu pacienta.

Dalším předmětem, podle vynálezu, jsou farmaceutické prostředky pro léčbu MS a/nebo jiných demyelinizačních onemocnění, obsahující mutanty chemokinů, podle vynálezu, v přítomnosti jedné nebo více farmaceuticky přijatelných pomocných látek.

„Farmaceuticky přijatelný“ se rozumí, zeje zahrnut některý nosič, který neinterferuje s účinností biologické aktivity účinné složky a který je netoxický pro hostitele, kterému je podáván. Například, pro parenterální podávání, mohou být výše uveden účinné složky zpracovány v dávkovači formě pro injekce v nosném prostředí jako je fyziologický roztok chloridu sodného, roztok dextrózy, sérum albuminu a Ringerův roztok.

Mimoto farmaceuticky přijatelné nosiče, prostředky, podle vynálezu, mohou také obsahovat malé množství pomocných látek, jako jsou stabilizátory, pomocné prostředky, pufry a konzervační látky.

-4CZ 303409 B6

Podávání takovýchto účinných složek může být intravenosní, intramuskulámí nebo podkožní cestou. Jiné způsoby podávání, které mohou vytvářet požadované krevní hladiny, pokud se týká složek, jsou zahrnuty ve vynálezu.

Optimální dávka účinné složky může být vhodně vybrána podle způsobu podávání, stavu pacienta a vlastností pacienta (pohlaví, věk, tělesná hmotnost, zdraví, rozměry), rozsahu symptomů, souběžných léčení, frekvence léčení a požadovaného účinku. Úprava a manipulace stanovených dávkovačích rozmezí jsou plně ve způsobilosti ošetřujících lékařů.

Obvykle může být denní dávka účinné složky kolem 0,01 až 100 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti. Obvykle je účinné k získání požadovaných výsledků 1 až 40 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti a den podávané v rozdělených dávkách nebo ve formě s postupným uvolňováním. Další nebo následující podávání mohou být provedena v dávce, která je stejná, menší nebo větší než počáteční dávka nebo předcházející dávka podávaná pacientovi.

Předkládaný vynález byl popsán v souvislosti ke specifickým provedením, avšak obsahu popisu je možno uskutečnit řadu modifikací a substitucí, které uskuteční každý odborník, aniž by se odchýlil od smyslu vynálezu.

Vynález bude nyní popsán cestou nelimitujících příkladů.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: Představuje srovnání některých příkladů CC chemokinů, vyrovnaných v hladině 40. smyčky. Tento proteinový segment a kationtové místo, které odpovídá motifu, schopnému vazby na GAG, jsou v rámečku.

Obrázek 2: Ukazuje mapu plasmidu, použitého ke klonování divokého typu RANTES a jeho mutant, podle příkladů.

Obrázek 3: Ukazuje výsledky Kompetitivní vazné zkoušky (¹²⁵I)-RANTES a mutant heparinu ve zkoušce s kuličkami s obsahem heparinu.

Obrázek 4: znázorňuje Kompetitivní zkoušku na rovnovážný stav RANTES a trojité 40. mutanty RANTES.

Obrázek 5: Ukazuje indukci monocytů a chemotaxe T buněk prostřednictvím RANTES a trojité 40. a 50. mutanty RANTES.

Obrázek 6: ukazuje inhibici příjmu peritoneálních buněk trojitou 40. mutantou RANTES.

Obrázek 7: znázorňuje inhibici RANTES indukovanou příjmem peritoneálních buněk zkrácenou trojitou 40. mutantou RANTES (3-68), produkovanou v Pichia pastoris.

Obrázek 8: znázorňuje inhibici MlP-Ιβ indukovanou příjmem peritoneálních buněk prostřednictvím MIP-Ιβ trojité 40, mutanty (K45A-R46A-K48A).

Obrázek 9: ukazuje inhibici ΜΙΡ-Ια indukovanou příjmem peritoneálních buněk prostřednictvím ΜΙΡ-Ια trojité mutanty (R18A-R46A-R48A).

Obrázek 10: znázorňuje inhibici thioglykolátu indukovanou příjmem buněk prostřednictvím trojité 40. mutanty RANTES.

Obrázek 11: ukazuje inhibici začátku experimentální autoimunitní encefalomyelitis prostřednictvím všech 40. trojitých mutant RANTES, podle vynálezu.

Příklady provedení vynálezu 1. Materiály a metody

a) Tvorba mutant RANTES bez vazby na heparin io

Mutageneze RANTES byla dosažena inversní PCR-technikou. Bodové mutace byly vloženy do jednoho nebo dvou primerů použitých k hybridizaci kódové sekvence lidských RANTES v opačném pořadí (GenBAnk acc., No. NM 002985). Za účelem zlepšení účinnosti navázání primerů (zejména pokud byly do primerů vloženy mnohočetné mutace) byla DNA denaturována bázemi.

Denaturovaná DNA byla zředěna na koncentraci přibližně 10 pg na reakci, aby nedošlo k zařazení nemutované DNA do transformační reakce.

Číslování aminokyselin, udané v příkladech a popisu, bere v úvahu zralý protein, to znamená začíná Ser, kterým je aminokyselina v poloze 24 podle popsané sekvence. Tudíž, aby byla výborná shoda mezi čísly aminokyselin v seznamu a v příkladech, je nutné přidat 23 k číslům v příkladech nebo v popisu.

Sekvence mutagenních primerů použitých jak následuje a sekvence mutovaných bází jsou podtrženy:

-6CZ 303409 B6

R44A (negativní)

-TTTGTCACCGCAAAGAACCGCCAAG-3 : ^pl

R44A (pozitivní)

- GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG- 3 : ^P2

K45A (negativní) ' - TTTGTCACCCGAGCGAACCGCCAAG- 3 ' : ^P3

K4 5A (pozitivní)

5'- GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3': P4

R47A(negativní) “ - CGAAAGAACGCCCAAGTGTGTGCCA- 3 : P5

R47A (pozitivní)

-GGTGACAAAGACGACTGCTGGGTTG-3 : ^P6

R44A-K45A-R47A(trojitá 40 .mutanta, negativní) ' - TTTGTCACCGCAGCGAACGCCCAAGTGTGTGCCAAC - 3 : ^p7

R44A-K45A-R47A (trojitá 40. mutanta, pozitivní)

-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTGCC-3 ^J : ^Pa

K5 5A(negat ivní)

-GCCAACCCAGAGGCGAAATGGGTTCGG- 3 ' : P9

K55A(pozitivní)

5-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGAC-3: PÍ0

K56A(negativní)

-AACCCAGAGAAGGCATGGGTTCGGGAG- 3 ' : PÍ 1

K56A (pozitivní)

5-GGCACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGT-3': P12

R59A(negativní)

-AAGAAATGGGTTGCGGAGTACATCAAC-3 : P13

R59A(pozitivní)

5-CTCTGGGTTGGCACACACTTGGCG-3: P14

K55A-K56A-R59A (trojitá 50. mutanta, negativní) ' -GCCAACCCAGAGGCGGCATGGGTTGCGGAGTACATC-3 “ : P15

K55A-K56A-R59A(trojitá 50.mutanta, pozitivní) ' -ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGACAAAGAC-3 : P16

Amplifíkace byla vytvořena v DNA termálním cyklickém zařízení (Perkin-Elmer-Cetus 480) pro 35 cyklů za použití pfuturbo® DNA polymerázy(Stratagene). DNA byla spojena a transformována do Top 10F'příslušných buněk E. coli (Invitrogen). Sekvence mutant byla ověřena sekvencí DNA.

b) Exprese a purifikace divokého typu (WT)RANTES a mutant RANTES v E.coli

Fragmenty DNA se získají PCR, jak objasněno výše a klonují se do plazmidu pET24d (obr. 2) tvořícího řadu vektorů. WT nebo kódovací sekvence mutovaného RANTES se klonuje do 3zakončení promotoru PT7 mezi místy působení Xbal a Nhel/Xhol. Plasmid obsahuje dva markerové geny (Km a láci) a účinný začátek cyklu (Ori fl).

Výsledné vektory se použijí k opětné transformaci BL21(DE3) kmenu E-coli, která umožňuje io silnou expresi proteinu za použití systému PT7/Lacl. Exprese proteinu se indukuje přidáním mM ísopropyl-[3-D-thiogalaktopyranosidu (TPTG) ke kultuře. Buňky se oddělí a opět suspendují v pufru pro lysu (50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM MgCl₂, 5 mM benzamidinu/HCl, 1 mM DTT, 0.1 mM fenyl methyl sul fonyl fluorid (PMSF), Dnase 20 mg/1). Buňky se rozruší třemi průchody přes tlakovou jednotku French Pressure Cell unit. Poté se suspenze centrifuguje při

10,000 x g za 30 min, při 4 °C. Usazenina inklusních tělísek, obsahující WT RANTES nebo jednu z mutant RANTES, se rozpustí v 0.1 M Tris/HCl, pH 8,0, obsahujícím 6M guanidinu/HCl a 1 mM DTT a míchá se po dobu 30ti minut pri 60 °C. Roztok se dialyzuje proti 3 podílům 1% kyseliny octové. Nerozpustné složky se odstraní centrifugací při 10,000 x g za 30 minut. Supernatant obsahující WT RANTES nebo jednu z mutant RANTES se lyofilizuje.

Lyofilizovaný prášek se rozpustí v 0.1 M Tris/HCl, pH 8,0, obsahujícím 6M guanidinu/HCl a lmM DTT za vzniku koncentrace přibližně 1 mg/ml. Proteiny se renaturují ředěním po kapkách na 10ti násobný objem roztokem guanidinu v 20 mM Tris/HCl, pH 8,0, obsahujícím 0.01 mM oxidovaného glutathionu a 0.1 mM redukovaného glutathionu. Roztok se míchá přes noc při

4 °C. Nerozpustné složky se odstraní centrifugací 10,000 x g za 30 minut. Kyselinou octovou se pH udržuje na 4.5 a vodivost se udržuje na 20 ms ředěním s vodou. Roztok se aplikuje do sloupce HiLoad S 26/10 především udržováním v 20 mM octanu sodném, pH 4.5 a protein se promyje lineárním gradientem 0-2'M NaCl ve stejném pufru. Frakce, obsahující WT RENTES nebo jeden z proteinu mutanty RANTES, se spojí, opět se dialyzují proti třem podílům kyseliny octové a lyofílizují se.

Lyofilizované proteiny se rozpustí v 50 mM Tris/HCl pufru, pH 8,0. Vedoucí sekvence MKKKWPR, odvozená od klonovacího postupu, se rozštěpí z WT RANTES nebo z některého z proteinů mutanty RANTES přes noc při teplotě 37 °C inkubací s endoproteinázou Arg-C (1:600 enzym:35 substrátu, procenta hmotnostní). Rozštěpené proteiny se oddělí od nerozstěpených proteinů chromatografií na kationtoměniči na sloupci HiLoad S 26/10 předtím v rovnovážném stavu ve 20 mM octanu sodného, pH 4,5, obsahujícím 6 M urey, a proteiny se promyjí s lineárním gradientem 0-2M NaCl ve stejném pufru. Rozštěpené frakce se spojí a dialyzují proti dvěma podílům 1% kyseliny octové a nakonec prot 0.1% kyselině trifluoroctové a poté se frakce lyofíli40 zují (Edgerton MD a spol,, str. 33 až 40 a Proudfoot AE a spol., str. 75 až 87, v „Chemokine Protocols“, Methods in Molecular Biology 2000, vol. 138, Humana Press).

Pravost WT a proteinů mutanty RANTES se ověří hmotovou spektrometrií. Analogickými postupy se produkují další mutanty, které obsahují Met jako extenzi NH₂-konce, zrovna tak jako jednoduché nebo trojité 40. mutanty RANTES a jednoduché nebo trojité 50. mutanty RANTES.

c) Exprese a purifikace divokého typu (WT) RANTES a mutant RANTES v Pichia pastoris

Zralá trojitá 40. mutanta RANTES (R44A-K45A-R47A) se vytvoří užitím megaprimeru založe50 ném mutagenezí PCR (Datta AK, Nucleic Acid Research 1995, 23(21):4530 až 31). Trojitá 40. mutanta RANTES se klonuje do vektoru pro expresi Pichia Pastoris, pPIC9K, v rámci s Mat alfa pre-pro signálního peptidu S. cerevisiae.

Po ověření sekvence se plasmid přemístí elektroporací do hostitelského kmene Pichia Pastoris

HS115(his4). His positivní klony se třídí pro expresi mutanty RANTES. Sledování exprese

-8CZ 303409 B6 v malém měřítku se provede použitím standardních postupů popsaných v Pichia Expression Kit z Invitrogen (Life Technologies). Stručně, kultura se rozvine v obohaceném nosném prostředí za použití glycerolu jako zdroje uhlíku, poté se kultura usadí a opět suspenduje v nosném prostředí, které k indukci exprese proteinu mutanty RANTES obsahuje metanol. Sekrece mutanty RANTES v nosném prostředí se prokáže na SDS-PAGE při barvení modří Coomassie.

Pro přenesení do velkých třepacích lahví se použije klon tvořící vysoké hladiny mutanty RANTES (přibližně 500 až 750 mg/1). Fermentované živné prostředí se centrifuguje při 5,000 otáčkách za minutu a supematant se použije pro purifikaci.

Protein se čistí ze supematantu jednoduchou chromatografií na sloupci sepharosy s heparínem, v rovnovážném stavu v 0.1 M Tris-HCI a promytém s lineárním gradientem 0-2 M NaCl ve stejném pufru za použití 20ti objemů sloupce. Pravost proteinu se ověří hmotovou spektroskopií. Bylo zjištěno, že v takovémto systému takto vytvořená mutanta RANTES(R44A-K45A-R47A) je také zkrácena vN-konci vzhledem k divokému typu molekuly, to znamená, že chybí první 2 aminokyseliny. Takto získaná mutanta byla tudíž určena jako trojitá 40. mutanta (R44A, K45A, R47A) RANTES (3-68) a její sekvence aminokyselin odpovídá SEQ ID NO: 3.

d) Zkoušky vazby heparinu

Chromatografie heparinu na sepharosu se provede za použití 50 pg WT nebo proteinů mutovaného RANTES, které jsou naplněny do sloupců sepharosy s heparínem v rovnovážném stavu v 25 mM Tris/HCl, pH 8,0 a 50 mM NaCl a jsou promyty s lineárním gradientem 0-2 M NaCl v 25 mM Tris/HCl, pH 8,0.

Chromatografie heparinu na sepharosu se provede za použití 50 pg WT nebo proteinů mutovaného RANTES, které jsou naplněny do Mono S sloupce kationtoměniče v rovnovážném stavu v 50 mM octanu sodného, pH 4,5. Protein se promyje s 0-2 M gradientem NaCl.

Zkouška na kompetitivní vazbu se provede s použitím WT RANTES, trojité 50. mutanty RANTES a trojité 40. mutanty RANTES (SEQ ID NO:2- také zde označenou jako „R44AK45A-R47ARANTES“), která je radioaktivně značená s ^l25I při specifické účinnosti 2200 mCi/mol. Filtrační plotny s 96 vyhloubeními se napustí vazebným pufrem (50 mM HEPES, pH 7,2, obsahující 1 mM Nal₂, 5 mM MgCl₂, 0.15 M NaCl a 0,5% BSA). Sérií ředění heparinu ve vazebném pufru se dosáhne rozmezí koncentrací od 20 mg/ml až 1 pg/ml. Zkouška se provede v celkovém objemu lOOpl přidáním 25 pl roztoků heparinu, 25 pl 0,4 nM (¹²⁵I)-chemokinu, 25p kuliček heparinu (0.2pg/ml ve vodě) a 25 pl vazebného pufru do každého vyhloubení. Zkoušky se provedou třikrát. Plotny se inkubují při teplotě místnosti s mícháním po dobu 4 hodin. Filtrační plotny se k odstranění nevázaného značeného chemokinů promyjí třikrát s 200 pl promývacího pufru za použití vakuového čerpadla. Poté se do každého vyhloubení přidá 50 pl sc int i lační kapaliny a spočítá se radioaktivita (1 min/vyhloubení). Údaje se analyzují za použití Softwaru-GraFit,

e) Zkoušky na kompetitivní rovnovážnou vazbu na receptor

Zkoušky se provedou za použití metody SPA (Scintillation Proximity Assay) s použitím (^,25I)ΜΙΡ-Ια jako značení na membránách zCHO po transfekcí, u nichž dochází k expresi CCR1 nebo CCR2. Kompetitory se připraví sérií ředění neznačených chemokinů ve vazebném pufru k pokrytí rozmezí ΙΟ^-ΚΓ^Μ. Použitý vazebný pufr je 50 mM HEPES, pH 7,2, obsahující 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0.15 M NaCl a 0.5% BSA, Kuličky pro SPA z pšeničných klíčků (Amersham) se rozpustí v PBS na 50 mg/ml a zředí se ve vazebném pufru na 10 mg/ml. Konečná koncentrace je ve zkoušce 0.25 mg/vyhloubení. Membrány připravené zCHO buněk expresí CCR1 nebo CCR2 se skladují při -80 °C a zředí se ve vazebném pufru na 80 pg/ml. Odpovídající objemy membrány a zásobních kuliček se před vykonáním zkoušky pro redukci pozadí míchají. Konečná koncentrace membrán je 2g/ml a konečná koncentrace (¹²⁵I)-MIP-la je 0.1 nM. Plotny se inkubují při teplotě místnosti s mícháním po dobu 4 hodin. Radioaktivita se měří a údaje se analyzují jak popsáno ve zkoušce vazby za heparin.

f) Zkoušky chemotaxe

Chemotaxe monocytů byla provedena za použití zkušební komůrky micro-Boyden. Monocyty se vyčistí z barevného povlaku za použití následujícího izolačního postupu: 100 ml roztoku barevného povlaku se zředí 100 ml PBS, navrství se na Ficoll a centrifuguje se při 600 x g po dobu 20ti minut při teplotě místnosti. Buňky, které tvoří dělicí plochu se seberou, promyjí se dvakrát ío s PBS a opět se suspendují při koncentraci 40-1 OOx 10⁶/ml v nosném prostředí RPMI 1640, obsahujícím 5% inaktivovaného zárodečného telecího séra (FCS), 2 mM glutaminu a 25 mM

HEPES, pH 7.2. Buňky se dále čistí od frakce lymfocytů přidáním 10⁶ ovčích červených krvinek/ml, zpracovaných přes noc při 4 °C na rosety, a oddělí se druhým gradientem Ficoll za odstředění při 900 x g po dobu 20ti minut při teplotě místnosti. Monocyty se nalézají na dělicí ploše mezi Ficoll a pufrem a T buňky jsou v usazenině. Monocyty se promyjí v PBS a opět se suspendují v 2.5 x 10⁶/ml v nosném prostředí RPMI 1640. Čistota se měří přímým a bočním rozptylem FACS analýzou a zjistilo se, že 40 až 80 % je v závislosti na donoru. Chemokiny se zředí na konečný objem 30 pl, pokrytí rozmezí koncentrace 10“⁶ až 10“¹² M v nosném prostředí RPMI se umístí do nižších vyhloubení. Filtr s velikostí pórů 5 pm pro monocyty (Neuroprobe) a 8 pm pro T buňky, zajišťující, že nebudou vzduchové bubliny a že systém nebude neprodyšně uzavřen, se umístí nad nižší vyhloubení. Padesát mikrolitrů buněčné suspenze (2.5 x 10⁶ buněk/ml) v nosném prostředí RPMI se umístí v horních vyhloubeních. Komora se inkubuje po dobu 30ti minut pro monocyty a 1,5 hodiny pro T buňky při 37 °C pod kyslíkem. Buňky se odloží, horní povrch membrány buněk se očistí a membrány se promyjí PBS. Membrány se fixují ponořením do MeOH po dobu 1 minuty, suší se na vzduchu a obarví se Fieldovým roztokem A a B. Migrující buňky se spočítají volbou náhodných polí pro každé vyhloubení 20ti násobně zvětšeny na standardním mikroskopu, kterýje vybavený analyzátorem obrazu IBAS. Údaje se získají za použití softwaru-Gra-Fit.

g) Zkoušky peritoneálního příjmu buněk

V první zkoušce se příjem buněk indukuje intraperitoneální injekcí 10pg chemokinů ředěných v 0.2-ml sterilního izotonického roztoku chloridu sodného (NaCl-prostý LPS) do samičích BALB/c myší 8 až 12 týdnů starých. Mutanty chemokinů (10 pg ředěných chemokinů v 0.2 ml sterilního roztoku chloridu sodného) se podávají 30 minut před podáním agonisty. O šestnáct hodin později se myší usmrtí plynným CO₂. Peritoneální laváž se provede 3 promytími s 5 ml PBS a laváže se slijí. Buňky se centrifugují pri 600 x g po dobu 10ti minut, opět se suspendují v konečném objemu 1 ml a celkové leukocyty se zjistí spočítáním za použití hemacytometru.

Ve druhé zkoušce se příjem buněk indukuje intraperitoneální injekcí 200 pl 3% roztoku thioglykolátu v destilované vodě do samičích BALB/c myší 8 až 12 týdnů starých (den I). Mutanty chemokinů (10 pg ředěných chemokinů v 0.2 ml sterilního roztoku chloridu sodného) se podávají 30 minut před podáním thioglykolátu. Mutanty chemokinů se potom podávají denně po dobu 3 dnů (den 2, 3 a 4). Myši se v den 5 usmrtí plynným CO₂. Peritoneální laváž se provede 3 promy45 tími s 5 ml PBS a laváže se slijí. Buňky se centrifugují při 600 x g po dobu 10ti minut, opět se suspendují v konečném objemu 1 ml a celkové leukocyty se zjistí spočítáním za použití hemacytometru.

h) Experimentální autoimunní encefalomyelitis (EAE)

Postup imunizace

Samičky myší C57 BL/6NCrlBR 8 týdnů staré s hmotností 18-22 gramů byly imunizovány (den=0) injekcí s.c. v zadní části krku 0.1 ml emulse, která obsahovala 200pg MOG3₅_₅5 peptidu

-10CZ 303409 B6 (Neosystem, Strasbourg, Francie) v úplném Freundově pomocném prostředku (CFA s Mycobacterium butyricum, Difco, Detroit, U.S.A.), obsahujícím 0.25 mg Mycobacterium tuberculosis. Před s.c. injekcí bylo podáno 200 μΐ i.v. injekce do ocasní žíly s 300ng toxinu pertusse (List Biological Lab., Campbell, CA, U.S.A.) ředěného v PBS. V den 2 byla zvířatům podána druhá i.p. injekce s 300 ng toxinu pertuse.

Výsledky postupu, začínají přibližně ode dne 8-10 objevením se progresivní paralýzy, vycházející z ocasu a postupující ascendentně k předním končetinám.

Plán pokusu

Pokus zahrnuje skupiny-každou po 10ti zvířatech. Všechny skupiny byly imunizovány s MOG₃₅_55peptidem v CFA a toxinem pertuse podle následujícího imunizačního protokolu:

Skupina 1: positivní kontrolní skupina, které bylo podáváno samotné nosné prostředí (PBS) i.p. cestou.

Skupina 2: positivní kontrolní skupina, které bylo podáváno samotné nosné prostředí (PBS) s.c. cestou.

Skupina 3: podáváno i.p. 10 pg trojité 40. mutanty RANTES/myš.

Skupina 4: podáván i.p. lpg trojité 40. mutanty RANTES/myš.

Skupina 5: podáváno i.p. 10 pg trojité 40. mutanty Met/RANTES/myš.

Skupina 6: podáván i.p. lpg trojité 40. mutanty Met/RANTES/myš.

Skupina 7: podáváno s.c. 10,000 U myšího rekombinantního interferonu beta (m-IFN-p)/myš. Skupina 8: podáváno s.c. 20,000 U m-IFN-p/myš.

Nosné prostředí

PBS bylo použito k ředění všech 40. trojitých mutant RANTES, všech 40. trojitých mutant Met-RANTES a m-IFN-β k příslušným koncentracím.

Způsoby podávání

Trojitá 40. mutanta RANTES, trojitá 40. mutanta Met-RANTES a m-IFN-β byly podávány denně i.p. cestou v objemech 200 μΙ/myš. Skupina 1,2 dostávala 200μ1 PBS/myš.

Doba trvání léčení

Léčení pro každé zvíře začínalo 4. den pokusu (přibližně 3 až 5 dní před obvyklým objevením se nemoci) a poté léčení pokračovalo 14 následujících dní (zvířata byla usmrcena v 18. den pokusu).

Klinická sledování

Počínaje 5. den byla zvířata individuálně zkoušena na přítomnost paralýzy prostřednictvím následujícího klinického hodnocení:

0= nejsou známky onemocnění 0.5= částečná paralýza ocasu ío 1= paralýza ocasu

1.5= paralýza ocasu + částečná unilaterální paralýza zadní končetiny

2= paralýza ocasu + ochablost zadní končetiny nebo částečná paralýza zadní končetiny

2.5= paralýza ocasu + částečná paralýza zadní končetiny (snížená pánev)

3= paralýza ocasu + kompletní paralýza zadní končetiny

3.5= paralýza ocasu + kompletní paralýza zadní končetiny + inkontinence

4= paralýza ocasu + paralýza zadní končetiny + ochablost nebo částečná paralýza přední končetiny

5= umírání nebo smrt

2. Výsledky

a) zkoušky vazby heparinu

Čištěné proteiny RANTES, mutované v jedné nebo ve třech polohách, byly analyzovány heparinovou chromatografií a koncentrace NaCl, potřebná k jejich promytí, byla srovnána s profilem promývání WT RANTES. Jelikož interakce s heparinem je elektrostatická, mutanty byly podrobeny chromatografií na kationtoměniči na sloupci MonoS. To má za následek pokles koncentrace

NaCl, která je požadovaná pro eluci, vzhledem k tomu, že mutageneze odstranila bazické zbytky. Rozdíl v koncentraci NaCl, získané chromatografií na kationtoměniči, je odečten od výsledku, který se získal heparinovou chromatografií. Jestliže je hodnota pozitivní, je prokázána specifická interakce s heparinem. (Tabulka 1).

Přímé měření vazby na heparin bylo provedeno s trojitou 40. a 50. mutantou RANTES ve zkoušce na kom pěti ti vní vazbu. WT RANTES a mutanty byly jódovány a všechny měly stejnou specifickou radioaktivitu 2,200 mCi/mol. Nicméně pouze přibližně 20% trojité 40. mutanty se navázalo na kuličky heparinu, s maximálním počtem 4,000 impulzů za minutu ve srovnání s 22,000 impulzy za minutu pro WT RANTES a 50. mutantu (obrázek 3). To ukazuje, že tyto zbyt45 ky ve 40. smyčce, které jsou mutovány, přispívají k větší vazebné kapacitě heparinu pro RANTES. Na druhé straně, to také ukazuje, že domnělý motif vázající GAG není v 50. smyčce „skutečným“ vazebným místem GAG.

b) Zkoušky na kompetitivní rovnovážnou vazbu na receptor

Schopnost trojité 40. a trojité 50. mutanty RANTES je účastnit se kompetice o (^,25I) ΜΙΡ-Ια pro vazbu na rekombinantní CCR1 a CCR5 v membránách připravených z CHO stabilních transfektantů. Není zde významný rozdíl v některé z jednotlivých mutací na obojích receptorech (výsledky nezaznamenány). Žádná z trojitých mutant nevykazuje rozdíl ve vazbě na CCR5 ve srovnání s proteinem WT RANTES. Nicméně, na CCR1 měla trojitá 40. mutanta RANTES

- 12CZ 303409 B6

100 násobnou redukci afinity, kde trojitá mutanta RANTES vykazuje pouze malou (3 násobnou) ztrátu afinity (Obr. 4).

c) Zkoušky chemotaxe

Trojité 40. a trojité 50. mutanty byly všechny schopné indukovat chemotaxi monocytů ve srovnání s činností WT RANTES, vyjma trojité 40. mutanty, která byla pouze schopna indukce významné chemotaxe v ΙμΜ. Nicméně trojité 40. a 50. mutanty byly stejně účinné ve své schopnosti indukovat chemotaxi T buněk (Obr. 5).

Výsledky získané ve zkouškách chemotaxe monocytů se dobře shodují s těmi výsledky, které byly získány ve zkouškách vazby na receptor. Ztráta účinnosti trojité 40, mutanty RANTES na chemotaxi monocytů odpovídá ztrátě afinity pro CCR1.

d) Zkoušky peritoneálního příjmu buněk

Trojitá 40. mutanta RANTES nebyla schopna indukce příjmu buněk do peritonea v dávce (10 pg/myš), při nichž RANTES způsobují příjem (Obr. 6).

Kromě toho, jestliže je podáváno 10 pg mutanty 30 minut před podáním RANTES, je příjem buněk indukovaný RANTES inhibován. Tudíž zrušení vazby GAG vytvářelo in vivo inhibitor příjmu buněk, indukovaného chemokiny.

Analogické výsledky jsou znázorněny na obr. 7 se zkrácenou trojitou 40. mutantou RANTES (368) (produkovanou v Pichia pastoris), na obr. 8 s MIP-Ιβ trojitou 40. mutantou (K45A-R46AK48A) a na obr. 9 s MIP-1 a trojitou 40. mutantou (R18A-R46A-R48A). Příjem buněk stimulovaný thioglykolátem byl inhibován zrovna tak dobře trojitou 40. mutantou RANTES, jak znázorněno na obr. 10.

e) Experimentální auto imunitní encefalomyelitis

Trojitá 40. mutanta RANTES ukazuje účinek závislý na dávce na modelu myší EAE. Protein, podávaný denně i.p. v dávkách 1 pg a 10 pg/myš počínaje 10. den po primární imunizaci s MOG, vykazoval srovnatelnou účinnost s referenčním léčením rekombinantním m-IFN-β (Obr. 11). Začátek onemocnění byl významně opožděný a závažnost onemocnění (jak stanoveno oblastí pod křivkou) byla také významně snížena. Kromě toho, průměr maximálního klinického hodnocení, dosaženého během pokusu, byl také snížen. Jiná mutanta (trojitá 40. mutanta Met-RANTES) nedosáhla žádných užitečných účinků ve stejném pokusu.

Tyto výsledky ukazují čistě užitečný účinek léčení se všemi 40. trojitými mutantami RANTES, které redukují klinické známky chronické EAE u myší po imunizaci s MOG. Mimoto, trojitá 40. mutanta RANTES má užitečný terapeutický účinek a může být použita jako léčivo u chronických demyelinizačních onemocnění jako je MS.

Tabulka 1. MolaritaNaCl pro eluci z heparinu a sloupců Mono-S (kationtoměnič)

Mutace RANTES	Heparin	MonoS	ANaCl^HepS	ANaCl^⁰'²	AANaCl
NoíWT)	0-80	0.91		—	-
R44A	0.61	0.82	0.19	0.09	0.10
K4 5A	0.65	0.97	0.15	0.04	0.11
R47A	0.65	0.84	0.15	0.07	0.08
R44A- K45A-R47A	0.47	0.70	0.33	0.21	0.11
K55A	0.70	0.86	0.10	0.05	-0.05
KS 6 A	0.90	0.94	-0.10	0.07	-0.17
R59A	0.79	0.85	0.01	0.06	-0.05
K55A- K56A-R59A	0.70	0.75	0.10	0,16	. -0.06

Následující tabulka 2 bude vyjasňovat identitu sekvencí uvedených v Seznamu sekvencí a během 5 textu.

SEQ ID NO:	Popis sekvence
1	Divoký typ(WT)RANTES
2	Trojitá 40. mutanta RANTES
3	Trojitá 40. mutanta RANTES(3-68)
4	Trojitá MIP-1-alfa mutanta(R18A-R46A-R48A)
5	Trojitá MIP-1-beta mutanta(K45A-R46A-K48A)
6	Trojitá 50.mutanta RANTES

- 14CZ 303409 B6

7	Trojitá 40. mutanta Met-RANTES
8	R44A-mutanta RANTES
9	K45A-mutanta RANTES
10	R47A-mutanta RANTES
11	K55A-mutanta RANTES
12	K56A-mutanta RANTES
13	R59Amutanta RANTES
14	Primer PÍ
15	Primer P2
16	Primer P3
17	Primer P4
18	Primer P5
19	Primer P6
20	Primer P7
21	Primer P8
22	Primer P9
23	Primer P10
24	Primer Pil
25	Primer P12
26	Primer PÍ3

27	Primer P14
28	Primer P15
29	Primer P16
30	WT-I309
31	WT-MIP-l-alfa
32	WT-MIP-l-beta
33	WT-MIP-4
34	WT-MIP-5
35	WT-HCC1
36	WT-I36512
37	WT-MCP-2

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití mutanty CC chemokinů ze skupiny RANTES, ΜΙΡ-laIfa a ΜΙΡ-lbeta, MIP-3, ίο MIP-4, HCC1, 1309, 135612 a MCP-
2 a kde mutanta CC chemokinů obsahuje nejméně dvě mutace na kationtovém místě 40. smyčky a která vzhledem k divokému typu molekuly má redukovanou vazebnou aktivitu GAG, pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení sklerózy multiplex a/nebo jiných demyelinizačních onemocnění.

15 2. Použití, podle nároku 1, ve kterém mutantou chemokinů je mutanta RANTES.
3. Použití, podle nároku 2, ve kterém mutantou CC chemokinů je trojitá mutanta RANTES, která má tři bazické aminokyseliny v kationtovém místě 40. smyčky nahrazené jinými aminokyselinami.
4. Použití, podle nároku 3, ve kterém tři bazické aminokyseliny v kationtovém místě 40. smyčky jsou nahrazeny alaninem, serinem, threoninem, prolinem nebo glycinem.
5. Použití, podle nároku 1, ve kterém mutantou CC chemokinů je mutovaný RANTES se 25 SEQIDNO:2.

-16CZ 303409 B6
6. Použití, podle nároku 1, ve kterém mutantou CC chemokinů je mutanta RANTES se SEQ IDNO:3.
7. Použití, podle nároku 1, ve kterém mutantou CC chemokinů je mutanta MIP-1-alfa se SEQ IDNO:4.
8. Použití, podle nároku 1, ve kterém mutantou CC chemokinů je mutanta MIP-1-beta se SEQ IDNO:5.
9. Farmaceutický prostředek pro léčení sklerózy multiplex a/nebo jiných demyelinizačních onemocnění, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou látku mutantu chemokinů, podle nároků 1 až 8, spolu s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou.
10. Zkrácený a mutovaný lidský RANTES, který má sekvenci aminokyselin SEQ ID NO:3.
11. Molekula DNA, která obsahuje kódovou sekvenci DNA pro zkrácený a mutovaný RANTES, podle nároku 10.
12. Vektor pro expresi, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu DNA podle nároku 10.
13. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že obsahuje vektor pro expresi, podle nároku 12.
14. Rekombinantní způsob přípravy polypeptidu, vyznačující se tím, že se v příslušném nosném prostředí pěstují buňky podle nároku 13.