MXPA03003008A - Quimiocinas mutantes en el tratamiento de la esclerosis multiple. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a las quimiocinas mutantes CC, los que, al menos, contienen dos mutaciones en el sitio catiónico del bucle 40's y los que, en relación con la molécula de tipo silvestre tienen una actividad de unten GAG reducida;particularmente, se ha descubierto que tales quimiocinas mutantes son efectivas en el tratamiento de la esclerosis múltiple y/o en otras enfermedades desmielinizantes;el compuesto que muestra los mejores resultados es el triple mutante de RANT

Description

QUIMIOCINAS MUTANTES EN EL TRATAMIENTO DE LA ESCLEROSIS MULTIPLE CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a las quimiocinas mutantes CC, que contienen al menos dos mutaciones en el bucle 40 y los que, con referencia a las moléculas de tipo silvestre, tienen una reducida actividad GAG de unión. Se ha descubierto que tales quimiocinas mutadas son efectivas en el tratamiento de la esclerosis múltiple y/o en otras enfermedades desmielisantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las quimiocinas constituyen una familia de las citocinas pro-inflamatorias pequeñas con propiedades quimiotácticos y activantes de los leucocitos. Dependiendo de la posición de la primera cisteina conservada, las familias de las quimiocinas pueden ser divididas en quimiocinas C-C, C-X-C, y C-X3-C, (M. Baggiolini y colaboradores, Adv. Immunol. 1994, 55:97-179; M. Baggiolini y colaboradores, Annu. Rev. Immunol., 1997, 15:675-705; D. Taub y colaboradores, Cytokine Growth Factor Rev. 1998, 7(4) :355-76). Muchas de las quimiocinas C-X-C tales como la interleucina-8 (IL-8) son quimiotácticas para los neutrófilos, mientras que las quimiocinas C- C son activas sobre una cantidad de leucocitos, incluyendo a los monocitos, a los linfocitos, a los eosinófilos, a los basófilos, a las células NK, y a las células dendríticas. El dominio terminal NH2 de las quimiocinas está involucrado en la unión receptora y el procesamiento de la terminal NH2 puede tanto activar a las quimiocinas como suministrar quimiocinas completamente inactivas. Se han probado las variables de la Terminal-N de las quimiocinas C-C sintéticas en su actividad como inhibidoras o antagonistas de las formas presentes en la naturaleza. Los MCP1 , MCP-3 y RANTES que le faltan los aminoácidos de terminal NH2, 8 a la 9, son inactivos sobre los monocitos y son útiles como receptores antagonistas (J. H. Gong y colaboradores, J. Exp. Med. 1995, 181 (2): 631-40 y J. H. Gong y colaboradores, J. Biol. Chem. 1996, 271 (18): 10521-7). Las extensiones de RANTES con una metionina dan como resultado casi la inactivación completa de la molécula y el Met-RANTES se comporta como antagonista de la auténtica (A.E. Proudfoot y colaboradores, J. Biol. Chem. 996, Feb 2;271 (5): 2599-603). La patente WO 99/16877 se refiere al RANTES truncado amino-terminalmente que carece de los aminoácidos terminales NH2 correspondientes a los residuos aminoácidos 1 , 1-2, 1-3, ó 1-4 de los RANTES presentes en la naturaleza y que tienen actividad antagonista de las quimiocinas, así como también secuencias de ADNc que las codifican, su uso en la terapia y/o diagnóstico de la enfermedades en las que se requiere un efecto de actividad antagonista de las quimiocinas. El RANTES (3-68) es antagonista de la quimiocina truncada preferida. Aún cuando la actividad quimioatractiva del RANTES y de las quimiocinas C-C, ha sido, por lo general, estudiada principalmente en conexión con los receptores de la membrana de células específicas, el RANTES puede también ¡nteractuar con los altamente variables glicosaminoglicanos (GAGs), grupos de azúcares ramificados agregados posttraducción a varias proteínas genéricamente llamadas proteoglicanos (PGs) . Tales proteínas están presentes en la membrana de las células, en la matriz extracelular y en la corriente sanguínea, en la que también pueden estar presentes las GAGs aisladas. La interacción con GAGs es una característica común para muchas moléculas solubles de señalamiento de célula (¡nterleucinas, factores de crecimiento). Las PGs o las GAGs aisladas pueden formar un complejo con las moléculas solubles, probablemente con el objetivo de proteger esta molécula de la proteolisis en el medio ambiente extracelular. También se ha propuesto que las GAGs pueden ayudar a la presentación correcta de las moléculas de señalamiento celular a su receptor específico, y, eventualmente, también a la modulación de la activación de la célula objetivo. En el caso de las quimiocinas, la concentración en los gradientes inmovilizados en el lugar de la inflamación, y consecuentemente, la interacción con los receptores de la célula y su estado de activación parecen modulados por las formas diferentes de GAGs {Hoogewert A.J. y colaboradores, Biochemistry 199.7, 36 (44): 13570-8). Por lo tanto, se ha sugerido que la modulación de tales interacciones puede representar un método terapéutico en la enfermedad inflamatoria (Schwarz M.K. y Wells T.N., Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3(4): 407-17) y en la infección de VIH (Bums J.M. y colaboradores Proc. Nati. Acad Sci. E.U.A. 1999, 96(25) :14499-504). Los requerimientos estructurales y los efectos funcionales de la interacción GAG-RANTES se han estudiado en varios modelos. RANTES une al GAGs en las células endoteliales de la vena umbilical humana (CEVUH) en concentraciones micromolares con una afinidad y una especificidad mayor que otras quimiocinas, como las MCP-1 , IL-8, o MIP-1 alfa. Tal interacción parece ser no simplemente electroestática pero también dependiente de otros parámetros, como el largo y la sulfatación -N u O de los GAGs (Kuschert G.S. y colaboradores, Biochemistry 1999, 38(39): 12959-68). Las líneas de célula defectuosas GAG pueden unir las quimiocinas pero la presencia de las GAGs de superficie de célula aumenta en forma importante su actividad en los receptores cuando están a bajas concentraciones (Ali S. y colaboradores, J Biol. Chem 2000, 275(16): 11721-7). Otros experimentos mostraron que GAGs, el sulfato de heparina en particular, facilita la interacción de RANTES con la superficie de la célula de los macrófagos y la consecuente inhibición de la infección de VIH, como un resultado consistente con la resistencia bien conocida de estas células, expresando en forma pobre el sulfato de heparina a los efectos antivirales de RANTES (Oravecz T., y colaboradores, J. Immunol. 1997, 159(9); 4687-92). Las GAGs solubles compiten con la membrana de la célula GAGs y pueden actuar cono inhibidores específicos de la superficie de activación inducida de RANTES (Apay V. y colaboradores; Int. Immunol. 2000, 12(8):1173-82) como un supresor de la infección VIH (Burns JM y colaboradores; Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos de Norteamérica 1999, 96 (25): 114499-504). Algunos estudios de la función de estructura trataron de identificar al dominio de RANTES como responsable de la interacción con GAGs, debido a que la secuencia de consenso tradicional (BBXB, donde B es un residuo básico de X puede ser cualquier residuo) es demasiado genérico. Un estudio del mapeo del epitope se llevó a cabo utilizando el anticuerpo monoclonal levantado contra el recombinante RANTES humano, capaz de bloquear tanto los efectos antivirales y la movilización del calcio intracelular mediado por RANTES (Burns J.M. y colaboradores, J. Exp. Med. 1998, 188(10);1917-27). Este método permitió definir el residuo 55-66 como necesario para ambas actividades y para la interacción del GAG, esgrimiendo que la interacción de GAGs puede tener una función complementaria o diferente de una mediada por los receptores canónicos, así como también se sugirió en el estudio de las variantes de RANTES que tienen propiedades de agregado alteradas (Appay V. y colaboradores, J. Biol. Chem 1999, 274(39): 27505-12).

La región 55-66 que representa el segmento alfa-helicoidal C-terminal es homólogo al dominio de unión GAG de otras quimiocinas, como el IL-8 (Witt D.P. y Lander A.D. Curr. Biol. 1994, 4(5);394-400) y un sitio catiónico que contiene Usina y arginina (KKWVR). Tal región de unión es diferente del sitio de unión para los receptores de célula que se ubican en la terminal N (Pakianathan D.R. y colaboradores, Biochemistry 1997, 36(32):8642-8) y contiene algunos residuos involucrados en el agregado de los monómeros RANTES, aunque tales mutaciones de disgregación parecen no afectar la interacción con GAGs (Czaplewski L.G. y colaboradores, J. Biol. Chem. 1999, 274(23); 16077-84; WO 98/13495). RANTES contiene otro sitio catiónico (RKNR) en los residuos 44-47 que se conservan en el dominio de unión de GAG de otras quimiocinas, como MIP-lo: (Koopmann W. y Krangel .S., J. Biol. Chem. 1997, 272(15):10103-9) y ???-1 ß (Koopmann W. y colaboradores, J. Immunol. 1999, 63(4) :2120-7). Las variantes RANTES humanas que contienen mutaciones únicas en estos sitios catiónicos han sido reveladas como antagonistas de RANTES que tienen aplicaciones terapéuticas potenciales en el tratamiento de la infección por VIH y la enfermedades inflamatorias o alérgicas (WO 99/33989). También se ha revelado que solamente un muíante triple de RANTES, en el cual tres residuos en las posiciones 44, 45 y 47 han sido substituidos con Alanina, ha perdido la capacidad de unión GAG (A. Proudfoot y colaboradores, Chemokine Gordon Conference, Session 1 , 24 de Julio del año 2000, comunicador personal).

DESCRIPCION DE LA INVENCION Se ha descubierto ahora, que las quimiocinas CC, que contienen al menos dos mutaciones en el sitio catiónico del así llamado bucle 40's, son efectivas en el tratamiento de la esclerosis múltiple y otras enfermedades desmielisantes. Este sitio representa un motivo de unión GAG conservado en las quimiocinas CC (como RANTES, MIP-1 alfa y MIP-1 beta, MIP-3, MIP-4, HCC1 , I309, MCP-2). Todas estas quimiocinas mutantes tienen una actividad de unión GAG reducida cuando se compara con las moléculas correspondientes tipo silvestre. La región en la cual al menos dos mutaciones deberían estar presentes de acuerdo con la invención, el así llamado bucle 40's, se indica para un número de quimiocinas CC en la figura 1. En particular, el muíante triple RANTES, en el cual los tres residuos básicos en la posición 44, 45 y 47 se han substituido con la alanina, se ha descubierto que es activo en un modelo animal para el tratamiento de la esclerosis múltiple. Esta triple muíante de RANTES mostró un efecto relacionado de dosis en el modelo de ratón EAE y una eficacia comparable al tratamiento de referencia con el recombinante IFN-1 beía. Resulfados análogos se han encontrado con un mutante triple RANTES truncado en el cual los tres residuos en las posiciones 44, 45 y 47 han sido substituidos con Alanina y que carecen de los dos primeros amino ácido N-terminal. Este mutante RANTES truncado (que tiene la secuencia aminoácido de SEC ID No: 3) es novedoso y representa otro objeto de la presente invención. Una evidencia experimental similar se ha generado también en relación con las mutantes triples de MIP-1 alfa y MIP-1 beta que ya son conocidas y que están identificadas en la presente como MIP-1 mutante triple R18A-R46A-R48A (Koopman W. y Krangel MS., J. Biol. Chem. 1997, 272(15):10103-9) y MIP-1 ß mutante 40's triple K45A-R46A-K48A (Laurence J.S. Biochemistry 2001 , 40:4990-4999). La frase "una actividad de unión GAG reducida" significa que las mutantes de la invención tienen una capacidad más baja de unir a GAGs, es decir un porcentaje menor de cada una de estas mutantes une a GAGs (como el sulfato de heparina) con respecto a la molécula correspondiente tipo silvestre. Más preferiblemente son las mutantes del RANTES humano, en las cuales los tres aminoácidos básicos en las posiciones 44, 45, y 47 de la molécula tipo silvestre han sido substituidos por otros aminoácidos. Tales residuos pueden ser substituidos con residuos pequeños alifáticos, no polares o muy poco polares, tales como por ejemplo Ala, Ser, Thr, Pro y Gly. La alanina es el preferido. Las mutantes RANTES que se han descubierto como que son particularmente efectivas en el tratamiento de ES son aquellas que tienen las secuencias de aminoácidos como las informadas en SEC ID NO. 2 y SEC ID No. 3 respectivamente. Otro objetivo de la presente invención es el uso de las quimiocinas mutantes como se definiera anteriormente para producir una composición farmacéutica para tratar la esclerosis múltiple y/u otras enfermedades desmielinizantes. La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad CNS que progresa en forma lenta caracterizada por los parches diseminados de desmielinación en la medula espinal y en el cerebro, resultando en síntomas y señales neurológicas múltiples y variadas, usualmente con remisiones y exacerbaciones (ver The Merck Manual, edición dieciséis). La causa es desconocida pero la anormalidad inmunológica es sospechada, con pocos indicios que en el presente indican un mecanismo específico. Las causas postuladas incluyen la infección por un virus lento o latente y la mielinolisis por enzimas: IgG se eleva usualmente en el CSF y los titulados elevados se han asociado con una variedad del virus, incluyendo el del sarampión. La importancia de estos descubrimientos de las asociaciones informadas con aliotipos HLA y el número alterado de las células T no es claro, debido a que las evidencias son un poco conflictivas. Una incidencia incrementada familiar sugiere susceptibilidad genética: a menudo las mujeres son algo más afectadas que los hombres. Los factores ambientales parecen estar presentes. Aunque la edad al comienzo es generalmente desde 20 a 40 años, EM se ha unido al área geográfica donde el paciente ha pasado sus primeros 15 años. La reubicación luego de los 16 no altera el riesgo. Las placas o las islas de desmielinación con la destrucción de la oligodendroglia y la inflamación perivascular son diseminadas por medio de CNS, primariamente en la materia blanca, con una predilección para las columnas laterales ad-poster¡or (especialmente en las regiones cervicales y dorsales) los nervios ópticos y las áreas periventriculares. El tracto en el cerebro medio, el pon, y el cerebelo también son afectados y la materia gris en el cerebro y la médula pueden ser afectadas. Los cuerpos de células y los axones se conservan usualmente, especialmente en las lesiones precoces Luego los axones pueden ser destruidos, especialmente en los tractos largos y unas gliosis fibrosas le da al tracto su apariencia "esclerótica". Las lesiones precoces y las tardías pueden encontrarse simultáneamente. Los cambios químicos en los constituyentes lípidos y la proteína de mielina han sido demostrados en y alrededor de la placa. La enfermedad está caracterizada por varias quejas y descubrimientos de disfunción de CNS con remisiones y exacerbaciones que recurren persistentemente. La Imagen de Resonancia Magnética (IRM) es la imagen de diagnóstico sensitivo; puede mostrar muchas plaquetas. Las lesiones pueden también ser visibles en los barridos de CT de contraste aumentado.

Los avances terapéuticos en la esclerosis múltiple (EM) se ha mostrado que emergen lentamente, en parte debido a la comprensión incompleta de la patogénesis del desorden. Para el tratamiento basado en forma empírica los obstáculos principales para progresar incluyen el curso altamente variable de la EM, la naturaleza de largo plazo de los resultados finales más importante y la falta de marcadores objetivo del efecto del tratamiento, particularmente a corto plazo. Aunque la patogénesis de la EM permanece incierta, la historia natural continua siendo estudiada. El objetivo de los resultados finales basados en la imagen de resonancia magnética (IRM) se han desarrollado y se conocen muchas fallas en las pruebas clínicas que han llevado a métodos de juicio improvisados y a una mejor interpretación de los resultados. Otro objetivo de la presente invención es, por lo tanto, el método para tratar la EM por la administración de una cantidad efectiva de las quimiocinas mutantes de la invención junto con el excipiente farmacéuticamente aceptable. Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de ingredientes activos que es suficiente para afectar el curso y la importancia de la enfermedad, llevando a la reducción o remisión de tal patología. La cantidad efectiva va a depender de la ruta de administración de la condición del paciente. Otro objetivo adicional de la presente invención son las composiciones farmacéuticas que contienen las quimiocinas mutantes de la invención, en la presencia de uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para tratar la EM y/u otras enfermedades desmielinizantes. "Farmacéuticamente aceptable" quiere decir que incluye cualquier vehículo que no interfiera con efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo que no es tóxico al huésped al cual se administra. Por ejemplo, para la administración parenteral, los ingredientes activos anteriormente mencionados pueden ser formulados en una forma de dosis de unidad para la inyección en los vehículos tales como la salina, la solución dextrosa, la albúmina de suero y la solución de Ringer. Además del vehículo farmacéuticamente aceptable, las composiciones de la invención pueden también comprender cantidades menores de aditivos, tales como estabilizadores, excipientes, amortiguadores y preservativos. La administración de tal ingrediente activo puede ser por ruta subcutánea, intravenosas o intramusculares. Otras rutas de administración, que pueden establecer los niveles de sangre deseados de los ingredientes respectivos se incluyen por la presente invención. La dosis óptima del ingrediente activo puede ser apropiadamente seleccionado de acuerdo con la ruta de administración, condiciones del paciente y las características (sexo, edad, peso corporal, salud, tamaño) extensión de los síntomas, tratamientos concurrentes, frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulación de las gamas de dosis establecidas están dentro de la capacidad de aquellas personas expertas en la técnica. Usualmente una dosis diaria de ingrediente activo, puede ser aproximadamente 0.01 a 100 miligramos por kilogramo del peso corporal. En forma común de 1 a 40 miligramos por kilogramo por día dado en dosis divididas o en una forma de liberación sostenida es efectiva para obtener los resultados deseados. En la segunda o en las administraciones subsecuentes puede ser llevada acabo en una dosis que es el mismo, menor que, o mayor que, la dosis previa inicial o previa administrada al individuo. La presente invención se ha descrito con referencia a las realizaciones específicas, pero el contenido de la descripción comprende todas las modificaciones y substituciones que pueden ser presentadas por una persona experta en la técnica sin extenderse más allá del significado y los fines de las reivindicaciones. La invención será ahora descrita por medio de los siguientes Ejemplos que no deberían ser considerados como una forma limitativa de la presente invención. Los ejemplos se van a referir a las Figuras especificas en el presente más adelante.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 : Representa una alineación de algunas quimiocinas CC ejemplares, alineadas al nivel del bucle 40's. El segmento de la proteína y el sitio catiónico que corresponde al motivo de unión GAG están encajonados. La Figura 2: Muestra el mapa del plásmido utilizado para donar RANTES tipo silvestre y sus mutantes de acuerdo con los Ejemplos. La Figura 3: muestra los resultados del ensayo de Unión de competición de [125I]-RANTES y los mutantes para la heparina en ei ensayo de perlas de heparina. Las Figuras 4A y 4B: informan el ensayo de Unión de Equilibrio de competición de RANTES y el muíante triple RANTES 40's. Las Figuras 5A y 5B: Muestran la inducción del monociío y de las quimolaxis de la célula T por RANTES y los muíanles íriple 40's y 50's RANTES. La Figura 6: Muesíra la inhibición del reclutamiento de la célula peritoneal por el muíaníe íripolar 40's RANTES. La Figura 7: muestra el reclutamiento de la inhibición celular peritoneal inducida de RANTES por el mutaníe triple truncando 40's RANTES (3-68) en el Pichia pastoris.

La Figura 9: muestra la inhibición del reclutamiento celular peritoneal inducido de MIP-1 por la muíante triple MIP-1 oc (RI8A-R46A-R48A). La Figura 10: muestra la inhibición del reclutamiento celular inducido del tioglicolato por la mutante triple 40's RANTES. La Figura 1 1 : Muestra la inhibición del comienzo de la Encefalomielitis Autoinmune Experimental por todos las mutantes triples RANTES 40's de la invención.

EJEMPLOS Materiales y Métodos a) Generación de los mutantes RANTES de unión de no heparina La mutagénesis de RANTES fue lograda por una técnica de reacción de cadena de polimerasa inversa. Las mutaciones de punto fueron introducidas en una de los dos iniciadores utilizados para hibridizar a la secuencia de codificación RANTES humana (Banco de Genes Acc. No. NM 002985) en la orientación opuesta. Para mejorar la eficacia del templado del primer (especialmente cuando las mutaciones múltiples fueron introducidas en los iniciadores), el ADN fue desnaturalizado mediante un álcali. El ADN desnaturalizado fue diluido en una concentración de aproximadamente 10 pg/reacción para evitar la incorporación del ADN no mutado en la reacción de transformación. La numeración de los aminoácidos dada en los Ejemplos y en la descripción considera la proteína madura, es decir como comenzando por Ser que es el aminoácido en la posición 24 de acuerdo con el Listado de secuencia. Por lo tanto para tener una correspondencia perfecta entre los números de amino ácidos en el Listado de Secuencia y en los Ejemplos, debería agregarse el 23 a los números que aparecen en los Ejemplos o en la Descripción. Las secuencias de los iniciadores mutagénicos utilizados son como a continuación y las bases mutadas se subrayan. R44A (sentido) 5'-TTTGTCACCGCAAAGAACCGCCAAG-3' P1 R44A (contra-sentido) 5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3' P2 K45A (sentido) 5'-TTTGTCACCCGAGCGAACCGCCAAG-3' P3 K45A (contra-sentido) 5' -GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3' P4 R47A (sentido) 5'-CGAAAGAACGCCCAAGTGTGTGCCA-3' P5 R47A (contra-sentido) 5'-GGTGACAAAGACGACTGCTGGGTTG-3' P6 R44A-K45A-R47A (muíante triple 40's, sentido) 5'-TTTGTCACCGCAGCGAACGCCCAAGTGTGTGCCAAC-3' P7 R44A-K45A-R47A (muíante triple 40's, contrasentido) 5' -GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTGCC-3' P8 K55A (sentido) 5' -GCCAACCCAGAGGCGAAATGGGTTCGG-3' P9 K55A (contrasentido) 5" -ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGAC-3' P10 K56A (sentido) 5'-AACCCAGAGAAGGCATGGGTTCGGGAG-3' P11 K56A (contrasentido) 5 -GGCACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGT- 3' P12 R50A (sentido) 5' -AAGAAATGGGTTGCGGAGTACATCAAC-3' P 13 R59A (contrasentido) 5" -CTCTGGGTTGGCACACACTTGGTG-3' P14 K55A-K56A-R59A (muíante 50's triple, sentido) 5'-GCCAACCCAGAGGCGGCATGGGTTGCGGAGTACTACATC-3 - P 5 K55A-K56A-R59A (muíante 50's triple, coníraseníido) 5'-ACACACTTG GCG GTTCTTTCG GGTGACAAAAGAC-3' P16 La amplificación fue realizada en el ciclador íérmico de ADN (Perkin-Elmer-Ceíus 480) para 35 ciclos utilizando pfuturbo® polimerasa ADN (Stratagene). El ADN fue ligado y íransformado en células Top 10 F' competente E. coli (Invitrogen). La secuencia de las mutantes fue verificada por el secuenciación de ADN. b) Expresión y purificación de las mutantes RANTES y RANTES (TS) Tipo Silvestre en el E. coli Los fragmentos de ADN obtenidos por PCR como se explicara anteriormente han sido donados en el plásmido pET24d (figura 2) generando una serie de vectores. La secuencia de codificación del RANTES (tipo silvestre) TS o el RANTES mutado está donada en 3'al promotor p17, entre los sitios Xbal y Nhel/Xhol. El plásmido contiene dos genes marcadores (Km y lacl) y un origen de replicación activo (Ori fi). Los vectores resultantes fueron utilizados para retransformar la cepa E. coli BL21 (DE3) que permite la expresión de la proteína fuerte utilizando el sistema pT7 /Lacl. La expresión de la proteína fue inducida por el agregado de 1 mM isopropil- -D-tiogalactopiranosido (IPTG) al cultivo. Las células fueron cultivadas y resuspendidas en la solución reguladora de pH de lisis (50 mM Tri-HCI pH 8, 10 mM MgCI2 5 mM benzamidina/HCI, 1 mM DTT, 0.1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), DNasa 20 mg/L). Las células se rompieron mediante tres pasajes por medio de la unidad de célula de Presión Francesa (French Pressure Cell). La suspensión fue luego centrifugada a 10.000 x g durante 30 minutos a 40°C La pella corporal de inclusión conteniendo el RANTES TS o una de los mutantes RANTES fue solubilizado en 0.1 M Tris/HCI, pH 8.0 conteniendo 6 M guanidina/HCI, y 1 mM DTT y se agitó durante 30 minutos a 60°C. La solución fue dializada contra 3 cambios del ácido acético al 1 por ciento. El material insoluble fue quitado por centrifugación a 10,000 x g durante 30 minutos. Se liofilizó el sobrenadante conteniendo las mutantes RANTES TS o un muíante RANTES. El polvo liofilizado fue disuelto en 0.1 M Tris/HCI, pH 8.0 conteniendo 6 M Guanidina/HCI, y 1 mM DTT para obtener una concentración de aproximadamente 1 mg/ml. Las proteínas fueron re-naturalizadas por dilución de goteo en un volumen de 10 x esa solución de guanidina de 20 mM Tris/HCI, pH 8.0 conteniendo 0.01 mM glutationina oxidada y 0.1 mM glutationa reducida. La solución fue agitada durante toda la noche a 4o C. El material insoluble fue quitado por centrifugación 10,000 x g durante 30 minutos. El pH fue ajustado a 4.5 con ácido acético y la conductividad se ajustó a 20 mM por dilución con agua. Se aplicó la solución a una columna HiLoad S 26/10 previamente equilibrada en 20 mM de acetato de sodio, pH 4.5, y la proteína fue eluida con un gradiente lineal 0-2 M NaCI gradiente en la misma solución reguladora de pH. Las fracciones conteniendo RANTES TS o una de las proteínas mutantes RANTES fueron mancomunadas, dializadas contra 3 cambios de ácido acético y liofilizadas. Las proteínas liofilizadas fueron disueltas en solución reguladora de pH de 50 mM Tris/HCI, pH 8.0. La secuencia líder MKKKWPR derivada del procedimiento de clonación fue separada de las proteínas RANTES o una de las proteínas mutantes RANTES por incubación con endoproteinasa Arg-C (1:600 substrato de enzima p/p) durante toda la noche a 37°C. Las proteínas divididas fueron separadas de la proteína no partida por la cromatografía de intercambio de cationes en una columna HiLoad 5 26/10 previamente equilibrada en 20 mM de acetato de sodio, pH 4.5 conteniendo 6 MN de urea y las proteínas fueron eluidas con un gradiente lineal 0-2 M NaCI en la misma solución reguladora de pH. Las fracciones separadas fueron combinaron y dializaron contra dos cambios de ácido acético al 1 por ciento y finalmente contra 0.1% de ácido trifluoroacético y luego se liofilizaron (Edgerton M.D. y colaboradores, págs. 33-40 y Proudfoot A. E. y colaboradores, págs. 75-87 en "Chemokine Protocols Methods in Molecular Biology" (Protocolos de los Métodos de las Quimiocinas en Biología Molecular) 2000, vol. 138, Human Press). La autenticidad de las proteínas mutantes RANTES y RANTES TS fue verificada por espectrometría de masas. Con un procedimiento análogo se produjo otra muíante conteniendo Met, como extensión NH2-terminal, así como las mutantes solas o triples 40's RANTES y las mutantes solas o triples 50's. c) Expresión v purificación de las mutantes RANTES TS (tipo silvestre) v de las mutantes RANTES en Pichia pastoris La muíante triple RANTES 40's (R44A-K45A- R47A) fue creada utilizando en la mutagénesis PCR basada en mega iniciadores (Datta A.K., Nucleic Acid Research 1995, 23(21 ):4530-31) . Fue donado en el vector de expresión Pichia pastoris, pPIC9K, en el marco con el S. cerievisae péptido de señal pre-pro Met alfa. Luego de la confirmación de la secuencia, el plásmido fue transferido en la cepa huésped de Pichia pastoris GS1 15 (His4) por electroporación. Los clones His+ fueron filtrados por la expresión de la muíante RANTES. Se llevaron a cabo estudios de expresión a pequeña escala utilizando los procedimientos estándar como se describe en Pichia Expresión Kit (Equipo de Expresión Pichia) de Invitrogen (Life Technologies). En resumen, el cultivo se expandió en un medio enriquecido utilizando gliceroí como una fuente de carbono, luego de lo cual fue formado en pellas y resuspendido en un medio que contenía metanol para inducir la expresión de la proteína muíante RANTES. La secreción de la muíante RANTES en el medio fue defectada en SDS PAGE teñida con Coomassie Blue. Un clon que segrega altos niveles de la muíante RANTES (aproximadamente 500-750 mg/I) se usó para su crecimiento en matraces de agitación grandes. El cullivo fermeníado fue centrifugado en 5.000 rpm y el sobrenadante se utilizó para purificación. La proteína del sobrenadante fue purificada por un paso único cromatográfico en una columna de Heparina Sepharose, equilibrada en 0.1 M Tris-HCI y eluida con un gradiente lineal de 0-2 M NaCI en la misma solución reguladora de pH utilizando los volúmenes de columna 20. La autenticidad de la proteína fue verificada por espectrometría de masas y fue descubierto que en tal sisíema la muíante RANTES (R44A-K46A-R47A) así producida fue también truncada en la terminal-N con respecto a la molécula tipo silvestre, es decir, carece de los primeros dos aminoácidos. La mutante así obtenida, por lo tanto, ha sido identificada como mutante triple 40's RANTES (3-68) (R44A, K4S5A, R47A) y sus secuencias aminoácidos es como la SEC ID NO. 3. d) Ensayos de unión de Heparina La cromatografía de la Sepharose de heparina fue llevada a cabo utilizando 50 µg de proteínas RANTES TS o mutadas que fueron cargadas en la columna de Sepharosea de Heparina equilibrada en 25 mM Tris/HCI, pH 8.0 y 50 mM NaCI y eluido con un gradiente lineal de 0.2 M NaCI en 25 mM Tris/HCI, pH 8.0. La cromatografía de sepharose de Heparina fue llevada a cabo utilizando 50 µg de proteínas RANTES TS o mutadas que se cargaron en una columna de intercambio de catión MonoS equilibrado en 50mM acetato de sodio, pH 4.5. La proteína fue eluida con gradiente de 0-2 M NaCI. El ensayo de unión de competición fue llevado a cabo utilizando mutante RANTES TS, mutante RANTES 50's triple y mutante RANTES 40 triple (SEC. ID No:2 - también identificado en la presente como "R44A-K45A-R47A RANTES") que fueron radiomarcadas con [125l] por Amersham para una actividad específica de 2200 mCi/mol. Las placas de filtro que tenían 96 fuentes fueron remojadas con amortiguador de unión (50 mM HEPES, pH 7.2 conteniendo 1 mM CaCI2l 5 mM MgCI2, 0.15 M NaCI y BSA al 0.5 por ciento). Las diluciones seriales de heparina en el amortiguador de unión fueron llevadas a cabo para cubrir la gama de concentración de 20 mg/ml a 1 µg/mi. El ensayo fue llevado a cabo en un volumen total de 100 µ? por la adición de 25 µ? de diluciones de heparina, 25 µ? de 0.4 nM [125l] de quimiocina, 25 µ? de perlas de heparina (0.2 µg/ml en agua) y 25 µ? de amortiguador de unión a cada fuente. Los ensayos fueron llevados a cabo en triplicado. Se incubaron las placas a temperatura ambiente con agitación durante 4 horas. Las placas del filtro fueron lavadas 3 veces con 200 µ? de amortiguador de lavado utilizando una bomba al vacío para quitar la quimiocina etiquetada no unida. Luego se agregaron 50 µ? de centellante a cada fuente y se contaron por radioactividad (1 min/pozo). Los datos fueron analizados usando el Software Grafit. e) Ensayos de unión de receptor de competencia de equilibrio Los ensayos fueron llevaos a cabo en membranas de transfectantes CHO expresando CCR1 o CCR5 utilizando un Ensayo de Proximidad por Centelleo (EPC) utilizando [125l]-MIP-1 como trazador. Los competidores fueron preparados por diluciones en serie de las quimiocinas no marcadas en la solución reguladora de pH de unión para cubrir la escala de 10"6 a 10"12 M. La solución reguladora de pH de unión fue 50 mM HEPES, pH 7.2 conteniendo 1 mM CaCI2, 5 mM MgCI3, 0. 5 M NaCI y 0.5 por ciento de BSA. Las perlas EPC Wheatgem (Amersham) fueron solubilizadas en PBS a 50 mg/ml y diluidas en solución reguladora de pH de unión a un mg/ml y la concentración final en ensayos fue 0.25 mg/pozo. Las membranas preparadas de las células de CHO expresando CCR1 o CCR5 fueron almacenadas a -80°C y diluidas en la solución reguladora de pH de unión a un 80 µg/m!. Los volúmenes iguales de las reservas de perlas y membrana fueron mezclados antes de llevar a cabo el ensayo para reducir el fondo. La concentración final de membranas fue de 2 µg/ml y aquella de [ 25l]-MIP-1 fue 0.1 nM. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente con agitación durante 4 horas. Se midió la radioactividad y se analizaron los datos como se describiera para el ensayo de unión de heparina. f) Ensayos de guimotaxis La quimotaxis de monocito se llevó a cabo utilizando un ensayo de cámara micro -Boyden. Los monocitos fueron purificados de las capas de leucocitos utilizando el siguiente procedimiento de aislamiento: 100 mi de solución de capa de leucocito fue diluida en 100 mi de PB, puesto en capas en Ficoll y centrifugada a 600 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se recogieron las células que forman la inferíase, se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en una concentración de 40-100 x 106/ml en medio RPMI 1640 conteniendo un 5 por ciento de suero de cabra fetal inactivado (SCF), 2 mM glutamina y 25 mM HEPES, pH 7.2. Fueron luego purificados de la fracción de linfocitos agregando 106 células de sangre roja de oveja, se formaron en rosetones durante toda la noche a 4°C y se separaron por una centrifugación de gradiente Ficoll a 900 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los monocitos se descubrieron en la interfase entre el Ficoll y el amortiguador, y las células T estaban en la pella. Los monocitos fueron lavados en PBS y se resuspendieron a 2.5 x 106 /mi en medio RPMI 1640. La pureza fue medida por diseminación hacia delante y lateral por análisis FACS y se descubrió que era entre el 40-80 por ciento dependiente del donante. La quimiocina fue diluida en un volumen final de 30µ?, cubriendo la escala de concentración de 10"6-10"12 M en medio RPMI fue colocada en pozos más bajos. Un filtro con tamaño de poro de 5 µ?? (Neuroprobe) para los monocitos y 8 µ?? para las células T fue colocado sobre los pozos más bajos asegurando que no había burbujas de aire, y el sistema sellado. Cincuenta microlitros de la suspensión de células (25 x 106 células/ml) en medio RPMI fue colocado en las fuentes superiores. La cámara fue incubada durante 30 minutos para los monocitos y 1.5 horas para las células T a 37°C bajo 02. Las células fueron luego descartadas, la superficie superior de la membrana raspada limpia de células y las membranas fueron lavadas con PBS. La membrana se fijó por inmersión en MeOH durante 1 minuto, secada por aire y teñida con solución Fields A y B. Las células migradas fueron contadas por selección de campos aleatorios para cada fuente con un objetivo de 20 x en un microscopio estándar adaptado con software de analizador de imagen IBAS: Se adaptaron los datos utilizando software GraFit. q) Ensayos de reclutamiento celular peritoneal En un primer ensayo, el reclutamiento celular fue inducido por la inyección intraperitoneal de 10 µg de la quimiocina diluida en 0.2 mi salina estéril (LPS- libre NaCI) en los ratones BALB/c hembras de 8 a 12 semanas de edad. Las quimiocinas mutantes (10 µ9 de quimiocina diluida en 0.2 mi estéril salina) se administró 30 minutos antes de la administración agonista. Dieciséis horas más tarde, los ratones fueron sacrificados por C02 administrado por aerosol. El lavaje peritoneal fue llevado a cabo con 3 lavados con 5 mi de PBS y los lavados se mancomunaron. Las células fueron centrifugadas a 600 x g durante 10 minutos, resuspendidas en un volumen final de 1 mi y los leucocitos totales producidos fueron contados con un hemacitómetro. En un segundo ensayo, el reclutamiento celular fue inducido por inyección intraperitoneal de 200 µg de una solución al 3 por ciento de tioglicolato en agua destilada en ratones BALB/c hembras de 8 a 12 semanas de edad (Día 1 ). El muíante quimiocina (10 µg de la quimiocina diluida en 0.2 mi salina estéril) fue administrada 30 minutos antes de la administración de tioglicolato. El muíante de quimiocina fue administrado diariamente luego durante 3 días (Día 2, 3 y 4). Los ratones fueron sacrificados en el día 5 por C02 suministrado mediante aerosol. El lavaje peritoneal fue llevado a cabo en 3 lavados con 5 mi de PBS y los lavados se mancomunaron. Las células fueron centrifugadas a 600 x g durante 10 minutos, resuspendidas en un volumen final de 1 mi y los leucocitos totales producidos fueron contados con un hemocitómetro. h) Encefalitis Autoinmune Experimental (EAE) Procedimiento de inmunización Se inmunizó a los ratones hembras de 8 semanas de edad C57 BL/6NCrlBR pesando 18-22 gramos (día 0) Inyectando s.c. en la parte posterior del cuello 0.1 mi de una emulsión conteniendo 200 µg MOG35-55 péptido (Neosystem, Strasbourg, Francia) en Adyuvante de Freund completo (AFC con Mycobacteríum butyrícum, Difco, Detroit (Estados Unidos de Norteamérica), conteniendo 0.25 mg de Mycobacteríum tuberculosis. Antes de la inyección s.c. recibieron 200 µ? mediante inyección i.v. de 300 ng de toxina de la tos ferina (List Biological Lab. Campbell, CA E.U.A.) disuelto en PBS en la vena de la cola. En el día 2 se le dio a los animales un inyección Lp de 300 ng de toxina de pertusis. Este procedimiento trae como resultado, comenzando aproximadamente desde el día 8-10 la aparición de una parálisis progresiva surgiendo de la cola y progresivamente ascendiendo hasta las patas delanteras.

Diseño de Estudio El estudio involucró grupos de 10 animales cada uno. Todos los grupos fueron inmunizados con péptido MOG35-56 en CFA y con toxina de pertusis, de acuerdo con el protocolo de inmunización.

Grupo 1 : grupo de control positivo dosificado con vehículo único (PBS) por ruta i.p. Grupo 2: grupo de control positivo dosificado con vehículo único (PBS) por ruta s.c. Grupo 3: dosificados con 10 µ9/G3??? i.p. de muíante RANTES triple 40's. Grupo 4: dosificado con 1 µg/ra ón i.p. de muíante RANTES 40's triple. Grupo 5: dosificado con 10 µg ratón i.p. de muíaníe RANTES-Met 40's triple. Grupo 6: dosificado con 1 µg/ratón i.p. de muíaníe RANTES-Meí 40's triple. Grupo 7: dosificado con 10.000 U/ratón s.c. de inferieron recombinaníe de ratón beta (m-IFN-ß). Grupo 8: dosificado con 20,000 U/ratón s.c. de rn-IFN-ß.

Vehículo: El PBS fue utilizado para diluir todos los mutantes triples 40's, todos los Met-RANTES todos los mutantes triples 40's y mlFN-ß a la concentración apropiada.

Ruta de administración El muíante RANTES 40's, el muíante et-RANTES 40's y mlFN-ß fueron administrados diariamente por la ruta i.p. al volumen de administración de 200 µ/ratón. Los grupos 1 , 2 fueron dosificados i.p. con 200 µ/ratón de PBS.

Duración del tratamiento El tratamiento comenzó para cada animal al cuarto día experimental (aproximadamente 3-5 días antes de la ocurrencia usual de la enfermedad) y luego continuó durante 14 días consecutivos (sacrificio de los animales al día experimental 18).

Observaciones clínicas Comenzando el día 5, los animales fueron individualmente examinados por la presencia de parálisis por medio de un puntaje clínico como sigue a continuación: 0 = ninguna señal de enfermedad 0.5 = parálisis parcial de la cola 1= parálisis de la cola 1.5 = parálisis de la cola + parálisis parcial unilateral de las exíremidades posteriores 2 = parálisis de la cola más debilidad en las extremidades posteriores o parálisis parcial de extremidades posteriores 2.5 = parálisis de la cola + parálisis parcial de las extremidades posteriores (pelvis baja) 3 = parálisis de cola + parálisis completa de la extremidad posterior 3.5 = parálisis de la cola + parálisis completa de la extremidad posterior + incontinencia 4 = parálisis de cola + parálisis de extremidad posterior + debilidad o parálisis parcial de los miembros delanteros o moribundo o muerto.

Resultados a) Ensayos de unión de Heparina Las proteínas RANTES o purificadas mutadas en una o tres posiciones fueron analizadas por la cromatografía de heparina y la concentración de NaCI requerida para eluirlas fue comparada con el perfil de elusión de RANTES TS. Debido a que la interacción con la heparina es electrostática los mutantes estuvieron también sujetos a la cromatografía de intercambio de catión en la columna MonoS. Esto da como resultado una caída en la concentración de NaCI requerida para eluirlas debido a que la mutagénesis ha quitado los residuos básicos. La diferencia en la concentración de NaCI obtenida en la cromatografía de intercambio de catión se substrajo de la obtenida en la cromatografía de Heparina. Sí este valor es positivo, se identifica una interacción específica con la heparina (Cuadro 1). Una medida directa de unión a la heparina fue realizada con los mutantes RANTES 40's y 50's en un ensayo de unión de competición. El RANTES TS y los mutantes fueron iodados por Amersham y todos tuvieron la misma radioactividad específica de 2.200 mCi/mol. Sin embargo solamente cerca del 20 por ciento del muíante triple 40's se unió a las perlas de heparina, con un número máximo de cpm de 4.000 comparado con 22.000 cm para RANTES TS y el muíante 50's (figura 3). Esto demuestra que estos residuos en el bucle 40's, que ha sido mutado, contribuyen a la mayoría de la capacidad de unión de heparina de RANTES. Por otro lado, esto también demuestra que el motivo de unión GAG putativo en el bucle 60's no es un sitio de unión GAG "real". b) Equilibrio de los ensayos de unión de receptor de competición La capacidad de los mutantes RANTES 40's y 50's triples para competir [25l] ???-1a para unir el recombinante CCR1 y CCR5 en las membranas preparadas de CHO transfectantes estables. No hubo ninguna diferencia importante en ninguna de las mutaciones únicas o en ambos receptores (resultados no mostrados). Ninguno de los mutantes triples mostró una diferencia en la unión a CCR5 comparado con las proteínas RANTES TS. Sin embargo, en CCR1 , el muíante íriple 40's íuvo una reducción de 100 veces en afinidad, mientras el mutante triple 50's solamente mostró una pérdida (tres veces) de afinidad (Figura 4). c) Ensayos de Quimotaxis Los mutantes triple 40's y triple 50's fueron todos capaces de inducir la quimotaxis de monocito con las actividades comparables a RANTES TS, con la excepción del mutante triple 40's que fue solamente capaz de inducir quimotaxis importante a 1 µ?. Sin embargo los mutantes triples 40's y 50's fueron equipotentes en su capacidad de inducir la quimotaxis de la célula T (figura 5). Los resultados obtenidos en los ensayos de quimotaxis de monocitos corresponden bien con aquellos obtenidos en los ensayos de unión del receptor. La pérdida de actividad del mutante RANTES triple 40's o la quimotaxis de monocito corresponde a la perdida de afinidad para CCR . d) Ensayos de reclutamiento celular peritoneal El mutante RANTES 40's triple no fue capaz de inducir el reclutamiento celular en el peritoneo en la dosis (10 µq ratón) que RANTES causa en el reclutamiento substancial (figura 6). Además, si 10 9 del mutante se administra 30 minutos antes de la administración de RANTES, el reclutamiento celular inducido por RANTES es inhibido. Por lo tanto, la abrogación de la unión GAG produjo un inhibidor del reclutamiento celular inducido por quimiocina in vivo.

Resultados análogos se muestran en la figura 7 con RANTES truncado (3-68) mutante triple 40's (producido en Pichia pastorís), en la figura 8 por MIP-1 P mutante triple 40's (K45A-R46A-K48A) y en la Figura 9 por el mutante 40's triple MIP-1 a (R18A-R46A-R48A) . El reclutamiento celular estimulado por tioglicolato fue inhibido también por el mutante RANTES 40's triple en la Figura 10. e) Encefalomielitis Autoinmune Experimental (SAE) El mutante RANTES triple 40's mostró un efecto de dosis relacionado en los ratones modelo EAE. La proteína, en ambos ^µg y 10 µg/ratón administrado diariamente i.p, iniciando en el día 10 post la inmunización primaria con MOG demostró una eficacia comparable al tratamiento de referencia, recombinante m-IFN-ß (Figura 1 ). El comienzo de la enfermedad fue significativamente retrasada y la severidad de la enfermedad (como confirmado por el área bajo la curva) fue también reducida en forma importante. Además, el medio del puntaje clínico máximo alcanzado durante el experimento fue también disminuido. El otro mutante (mutante RANTES-Met triple 40's) falló en mostrar cualquier efecto beneficioso en el mismo experimento. Nuestros resultados muestran un efecto beneficioso claro del tratamiento con mutante RANTES-Met triple 40's, que reduce los signos clínicos de la SAE crónica en los ratones luego de la inmunización con MOG. Por lo tanto, el mutante RANTES-Met triple 40's tiene un efecto terapéutico beneficioso y puede ser utilizado como tratamiento en las enfermedades crónicas desmielinizantes tales como MS.

CUADRO 1 Molaridad NaCI para eluir desde las columnas de Heparina y Mono-S (intercambio de cationes) El siguiente cuadro 2 va a clarificar la identidad de la secuencias informadas en el Listado de Secuencias y a través del texto.

Met Ser 65 <210> 3 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SEÑAL <222> (1) - - (23) <400> 3 Met Lys Val Ser Ala Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr lie Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His lie Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Ala Ala Asn Ala Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr lie Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 4 <211> 70 <212> PRT <213> Escherichia Coli <400> 4 Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Ala Gln lie Pro Gln Asn Phe lie Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val lie Phe Leu Thr Lys Ala Ser Ala 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Ala 65 70 <210> 5 <211> 69 <212> PRT <213> Escherichia Coli <400> 5 Ala Pro ¾¡j¾3ly Ser Aep Pro Pro Thr Ala Cys Cys rr Thr 10 Ala Arg jeu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr 20 25 Ser Leu (¡jjjjSer Gln Pro Ala Val Val Phe Gln Thr 3er Ala Gln Val (^¾la Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gln /al Tyr 55 60 Asp Leu i eu Asn 65 <210> 6 <211> 9 <212> P: <213 > E; richia coli <220> <221> s: <222> ( (23 ) <400> 6 3er Ala Ala Ala Leu Ala Val lie Leu 5 10 Leu Cys 2¾ ?ro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Bir Pro 20 25 Cys Cys Ornenla. Tyr lie Ala Arg Pro Leu Pro Arg 40 Glu Tyr B¡s^M.'yr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro M 55 60 Val Thr .ys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro 65 70 75 Val Ala GBB r lie Asn Ser Leu Glu Met Ser 90 <210> 7 <211> 9 <212 > P: <213> Es¾g£¾:ichia Coli Met Lys er Ala Ala Ala Leu Ala Val lie Leu 1 5 10 Leu Cys ?ro Ala Ser Ala Met Ser Pro Tyr Ser fhr Thr .0 25 Pro Cys phe Ala Tyr lie Ala Arg Pro Leu Pro lis lie Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val 50 55 60 Phe Val Thr Ala Ala Asn Ala Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys 65 70 75 80 Trp Val Arg Glu Tyr lie Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 8 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SEÑAL <222> (1) .. (23) <400> 8 Met Lys Val Ser Ala Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr lie Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His lie Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Ala Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr lie Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 9 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SEÑAL <222> (1) .. (23) <400> 9 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val lie Leu lie Ala Thr Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr lie Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His lie Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Arg Ala Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr lie Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 10 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SEÑAL <222> (1) .. (23) <400> 10 Met Lys Val Ser Ala Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr lie Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His lie Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Arg Lys Asn Ala Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr lie Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 11 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SEÑAL <222> (1) .. (23) <400> 11 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr r ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr lie Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His lie Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 50 <211> 36 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 20 tttgtcaccg cagcgaacgc ccaagtgtgt gccaac 36 <210> 21 <211> 27 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 21 gacgactgct gggttggagc acttgcc 27 <210> 22 <211> 27 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 22 gccaacccag aggcgaaatg ggttcgg <210> 23 <211> 27 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 23 acacacttgg cggttctttc gggtgac <210> 24 <211> 27 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 24 aacccagaga aggcatgggt tcgggag <210> 25 <211> 27 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 25 ggcacacact tggcggttct ttcgggt 27 <210> 26 <211> 27 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 26 aagaaatggg ttgcggagta catcaac 27 <210> 27 <211> 24 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 27 ctctgggttg gcacacactt ggcg <210> 28 <211> 36 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 28 gccaacccag aggcggcatg ggttgcggag tácate 36 <210> 29 <211> 33 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 29 acacaottgg cggttctttc gggtgacaaa gac 33 <210> 30 <211> 74 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 30 Ser Lys Ser Met Gln Val Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala 1 5 10 15 Glu Gln Glu lie Pro Leu Arg Ala lie Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser 20 25 30 Ser lie Cys Ser Asn Glu Gly Leu lie Phe Lys Leu Lys Arg Gly Lys 35 40 45 Glu Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gln Arg His Arg Lys 50 55 60 Met Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys 65 70 <210> 31 <211> " 70 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 31 Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Arg Gln lie Pro Gln Asn Phe lie Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val lie Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Ala 65 70 <210> 32 <211> 68 <212> PRT<213> Escherichia coli <400> 32 Ser Phe His Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr lie Ser Gln Ser 1 5 10 15 lie Pro Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys 20 25 30 Ser Lys Pro Gly Val lie Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys 35 40 45 Ala Lys Pro Ser Gly Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys 50 55 60 Pro Tyr Ser lie 65 <210> 33 <211> 68 <212 > PRT <213 > Escherichia i <400 ? 33 Gln Val Gly Thr Asn 1 5 10 15 Gln lie Pro Gln Lys 20 25 30 Cys Pro Lys Leu Gly Val lie Leu Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln lie 35 40 45 Cys Ala Asp Pro Asn Lys Lys Trp Val Gln Lys Tyr lie Ser Asp Leu 50 55 60 Lys Leu Asn Ala 65 <210> 34 <211> 76 <212> PRT <213> Escherichia coli <400 > 34 Asp Arg Phe His Ala 1 5 10 15 Arg Ser lie Pro Cys 20 25 30 Glu Cys Ser Lys Pro 35 40 45 Phe Cys Ala Asn Pro 50 55 60 Leu Lys Leu Asp Thr 65 70 75 <210 > 35 <211> 74 <212 > PRT <213 > Escherichia i <400 > 35 Thr Lys Thr Glu Ser 1 5 10 15 Cys Phe Thr Tyr Thr 20 25 30 Tyr Tyr Glu Thr Asn 35 40 45 Thr Lys Arg Gly His 50 55 60 Gln Asp Tyr lie Lys 65 70 <210 > 36 <211> 96 <212 > PRT <213 > Escherichia i <400 > 36 Pro Lys Val Pro Glu 1 5 10 15 Tyr Tyr Glu Lys Val 2 0 25 30 Ala Leu Asn Cys His 35 40 45 Arg Glu Val Cys Thr 50 55 60 Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr Val 65 70 75 80 Lys lie lie Thr Ala Lys Asn Gly Gln Pro Gln Leu Leu Asn Ser Gln 85 90 95 <210> 37 <211> 76 <212> PRT <213> Escherichia <400> 37 Gln Pro Asp Ser Val 1 5 10 15 Asn Arg Lys lie Pro 20 25 30 Asn lie Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val lie Phe Lys Thr Lys Arg Gly 35 40 45 Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met 50 55 60 Lys His Leu Asp Gln lie Phe Gln Asn Leu Lys Pro S5 70 75

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- El uso de una muíante de quimiocina, la cual contiene por lo menos dos mutaciones en el sitio catiónico del bucle 40's, como se muestra en la Figura 1 , y la cual, en relación a la molécula tipo silvestre, tiene una actividad de unión de GAG reducida, para la preparación de una composición farmacéutica en el tratamiento de esclerosis múltiple y/u otras enfermedades desmielinnizantes, en donde la quimiocina CC se selecciona entre RANTES, ???-1-alfa, mIP-1-beta, MIP-3, IP-4, HCC1 , 1309, 135612 y MCP-2.

2. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la mutante de quimiocina es una muíante RANTES.

3. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde la mutante de quimiocina es una mutante RANTEs triple en la cual los tres aminoácidos básicos en el sitio catiónico el bucle 40's han sido sustituidos por otros aminoácidos.

4. - El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde los tres aminoácidos básicos en el sitio catiónico del bucle 40!s se han sustituido por alanina, serina, treonina, prolina o glicina.

5. - El uso como se reclama en la reivindicación , en donde la mutante de quimiocina es la RANTES mutada de SEC ID No.: 3.

6. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la muíante de quimiocina es la muíante RANTES de SEC ID No.: 2.

7. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la muíante de quimiocina es la muíante ???-1-alfa de SEC ID No.: 4.

8.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la mutaníe de quimiocina es la mulante ???-1-beta de SEC ID No.: 5.

9. - Una composición farmacéutica para el traíamienío de esclerosis múlfiple y/u otras enfermedades desmielinizantes caracíerizada porque comprende como ¡ngredieníe acíivo la muíaníe de quimiocina de las reivindicaciones 1 a 8 junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. - El RANTES humano truncado y mutado, caracterizado porque tiene la secuencia amino de la SEC ID NO:2. 1. - La molécula de ADN que comprende las secuencias de ADN codificando para el RANTES truncado y mutado de la reivindicación 10. 2.- Un vector de expresión caracterizado porque comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 10. 13. - Una célula huésped caracterizada porque comprende al vector de expresión de la reivindicación 12. 14. - Un procedimiento recombinante para preparar el polipépíido de la reivindicación 1 , caracíerizado porque comprende el culíivo en un medio de cultivo apropiado de las células de la reivindicación 13.